一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法

摘要

本发明公开了一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，将海鲈鱼在保活运输前置于暂养池中禁食暂养36h，排除鱼体内的代谢废物。设置制冷机以3℃/h降温速率将暂养池中的水从20～22℃降至运输温度12℃，将被乳化的香蜂草精油加入PE袋的运输水体中，完成保活运输后将海鲈鱼从PE袋子里转移至水温为12(±1)℃的干净水体中进行室温恢复。本发明有效减低海鲈鱼在保活运输过程中的能量消耗和新陈代谢速率，有效减缓保活运输对鳃、肝和肾组织诱发的损伤和细胞凋亡，延缓海鲈鱼血清皮质醇、应激蛋白、乳酸、血糖以及氧化酶活性上升，增强海鲈鱼在运输中总抗氧化能力，将活鱼运输存活率提高46％，获得更高的经济效益。

权利要求

1.一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，其特征在于，包括如下操作步骤：（1）暂养：运输前36 h禁食暂养，暂养期间水温20 22 ℃、盐度16‰、溶解氧4 6 mg/L、~ ~pH 7.5 8.5、鱼水比1:50，禁食暂养期间海鲈鱼体内的新陈代谢废物被排出；

~

（2）降温：设置制冷机以3 ℃/h降温速率，将暂养池中的水温从20 22 ℃降至运输温度~

12±1℃，在低温条件下鱼的新陈代谢速率有效降低；

（3）运输前处理：将被乳化的香蜂草精油加入PE袋的运输水体中，且将水温控制在12±

1℃，香蜂草精油浓度分别为10、20或40 mg/L，在该浓度下进行保活运输，可减低海鲈鱼在保活运输过程中的能量消耗和新陈代谢速率；减缓保活运输对鳃、肝和肾组织诱发的损伤和细胞凋亡；延缓海鲈鱼血清皮质醇、应激蛋白、乳酸、血糖以及氧化酶活性上升；增强海鲈鱼在运输中的总抗氧化能力；

（4）运输：将海鲈鱼转移至装有运输水体的PE袋里，然后用皮筋固定袋口防止水体溅出，进行空气曝气运输72 h，维持运输水体中有足够的溶解氧水平，按照该方法进行运输活鱼与常规运输相比可将运输存活率提高46 %；

（5）恢复：将运输结束后的鱼置于水温为12±1℃的干净水体中进行室温恢复，恢复12 h后海鲈鱼无侧翻、正常游动且活跃度高即为恢复正常。

2.根据权利要求1所述的一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，其特征在于，所述海鲈鱼应为体质健康，大小均匀和呼吸频率一致的鱼。

3.根据权利要求1所述的一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，其特征在于，所述香蜂草精油的乳化方法为：V(精油): V (50%酒精): V (吐温‑80)=10:200:1；乳化条件：室温。

4.根据权利要求1所述的一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，其特征在于，所述运输水体参数为水温12±1℃、盐度16‰、溶解氧4 6 mg/L、pH 7.5 8.5。

~ ~

5.根据权利要求1所述的一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，其特征在于， 所述保活运输鱼水比1：4。

说明书

一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法

技术领域

[0001] 本发明涉及鱼类保活运输领域，特别是涉及一种减缓海鲈鱼氧化应激反应和组织损伤的海水鱼有水保活运输方法。

背景技术

[0002] 海鲈鱼(sea bass,Lateolabrax maculatus)，属硬骨鱼纲、鲈形目、鲈鱼种、鮨科，花鲈属，是我国养殖海水鲈鱼的主要品种。海鲈鱼富含蛋白质，肉质鲜美细嫩，具有很高的食用价值。但是由于海鲈鱼应激性强，鳞片粗糙、背部有锋利的鳍，因此在保活运输过程中极易引起剧烈挣扎造成机械损伤，且高密度的拥挤胁迫会加速机体的代谢速率和水质恶化从而造成水体中高浓度的排泄物和代谢产物积累，加剧活鱼运输的应激响应导致鱼类死亡，因此限制了海鲈鱼销售的市场规模。

[0003] 在应激反应的初始阶段，皮质醇和肾上腺素等激素水平往往会急剧上升，随着保活运输时间延长，应激诱导鱼产生两种典型反应:鱼可能通过自我调节逐渐适应应激，或者当鱼类激素水平超过鱼能耐受的阈值时，可能发生不良反应或死亡。应激反应包括呼吸代谢系统和内分泌系统的紊乱，免疫功能异常，鳃、肝、肾组织损伤，抵抗力下降等其他变化。目前通过优化运输技术和方法，改善运输设施，在运输水中添加麻醉剂、镇静剂和免疫增强剂等手段可提高运输效率，其中三卡因甲磺酸盐(MS‑222)和丁香酚是最常见的麻醉剂。但目前对于麻醉剂使用后的残留检测有待进一步研究，且在中国没有明确的渔用麻醉剂使用标准，因此人们对于麻醉剂对于食用鱼的应用尚存在质疑。

[0004] 香蜂草精油作为天然植物提取精油，可作为一种抗焦虑的药物和温和的镇定剂。其主要成分包括醛类化合物、萜烯类化合物和酚类化合物，如柠檬醛、迷迭香酸和黄酮类化合物。香蜂草精油里的酚类化合物和黄酮类化合物具有高的抗氧化活性，无细胞毒性，可作为天然防腐脂溶性抗氧化剂。它的镇定作用机理为迷迭香酸(RA)抑制γ‑氨基丁酸(GABA)转氨酶活性并减缓GABA降解，从而维持生物体内GABA浓度的稳定性。在运输水体中添加精油或镇定剂，可暂时阻断感觉(传入)神经的传导，缓解应激引起的疼痛、不适、挣扎和能量消耗。目前对于高良姜精油(Alpinia galanga oil)，广域香精油(Nectandra grandiflora essential oil)、欧西姆精油(Ocimum Gratissimum L.Essential oil)等在活鱼运输领域已有研究，但目前国内外学者对于香蜂草精油在活鱼运输的应用及对其机体功能和应激反应的影响尚未作出报道。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，所要解决的技术问题是将天然植物提取物香蜂草精油作为一种新型的麻醉剂和镇定剂用于活鱼运输，减缓活鱼运输过程中胁迫诱发的应激反应和组织损伤，提高运输存活率。探究在水体中添加香蜂草精油联合低温条件进行模拟保活运输对海鲈鱼鳃组织形态结构、肝脏损伤及细胞凋亡程度的影响，测定海鲈鱼血液生化应激水平、抗氧化酶活性和肾功能指标，为海水鱼的保活运输提供理论依据。

[0006] 本发明所要解决的技术问题通过以下技术措施来实现：

[0007] 本发明的特征在于具体操作步骤：

[0008] 一种减缓海鲈鱼氧化应激损伤的保活运输方法，包括如下操作步骤：

[0009] (1)暂养：运输前36h禁食暂养，暂养期间水温20～22℃、盐度16‰、溶解氧4～6mg/L、pH 7.5～8.5、鱼水比1:50，禁食暂养期间海鲈鱼体内的新陈代谢废物被排出；

[0010] (2)降温：设置制冷机以3℃/h降温速率，将暂养池中的水温从20～22℃降至运输温度12(±1)℃，在低温条件下鱼的新陈代谢速率有效降低；

[0011] (3)运输前处理：将被乳化的香蜂草精油加入PE袋的运输水体中，且将水温控制在12(±1)℃，香蜂草精油浓度分别为10、20和40mg/L，在该浓度范围内进行保活运输，可减低海鲈鱼在保活运输过程中的能量消耗和新陈代谢速率；减缓保活运输对鳃、肝和肾组织诱发的损伤和细胞凋亡；延缓海鲈鱼血清皮质醇、应激蛋白、乳酸、血糖以及氧化酶活性上升；
增强海鲈鱼在运输中的总抗氧化能力；

[0012] (4)运输：将海鲈鱼转移至装有运输水体的PE袋里，然后用皮筋固定袋口防止水体溅出，进行空气曝气运输72h，维持运输水体中有足够的溶解氧水平，按照该方法进行运输活鱼与常规运输相比可将运输存活率提高46％；

[0013] (5)恢复：将运输结束后的鱼置于水温为12(±1)℃的干净水体中进行室温恢复，恢复12h后海鲈鱼无侧翻、正常游动且活跃度高即为恢复正常。

[0014] 作为本申请最优实施例，所述海鲈鱼应为体质健康，大小均匀和呼吸频率一致的鱼。

[0015] 作为本申请最优实施例，所述香蜂草精油乳化方法为：V(精油):V(50％酒精):V(吐温‑80)＝10:200:1；乳化条件：室温。

[0016] 作为本申请最优实施例，所述运输水体参数为水温12(±1)℃、盐度16‰、溶解氧4～6mg/L、pH 7.5～8.5。

[0017] 作为本申请最优实施例，所述保活运输鱼水比1：4。

[0018] 作为本申请最优实施例，所述香蜂草精油购自中国重庆高岛化妆品商行。

[0019] 本发明所提供的保活运输方法，可以有效减低海鲈鱼在保活运输过程中的能量消耗和新陈代谢速率，有效减缓保活运输对鳃、肝和肾组织诱发的损伤和细胞凋亡，延缓海鲈鱼血清皮质醇、应激蛋白、乳酸、血糖以及氧化酶活性上升，增强海鲈鱼在运输中的总抗氧化能力，与常规运输相比可将活鱼运输存活率提高46％。

具体实施方式

[0020] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0021] 实施例1：

[0022] 精油种类的选择：

[0023] (1)选取大小均匀，体质健康，呼吸频率一致的海鲈鱼，将其进行36h禁食暂养，暂养期间水温20～22℃、盐度16‰、溶解氧4～6mg/L、pH 7.5～8.5、鱼水比1:50；

[0024] (2)在室温条件下将香蜂草精油乳化，乳化方法为：V(精油):V(50％酒精):V(吐温‑80)＝10:200:1；将乳化后的精油按照相应浓度(10、50、100、200mg/L)加入运输水中，水温为12(±1)℃；

[0025] (3)将完成暂养后的海鲈鱼浸入添加有不同种类不同浓度的精油的水中，每种精油每个浓度浸入5尾鱼；

[0026] (4)浸入30min后观察精油对海鲈鱼是否有镇定麻醉效果，当鱼出现侧翻时被认为已进入入麻状态；

[0027] (5)当海鲈鱼进入入麻状态时将海鲈鱼转移至干净的水体中使其恢复，记录存活率；见表1；

[0028] (6)得出镇定麻醉效果最好的精油种类，确定最优研究浓度范围。

[0029] 表1海鲈鱼保活运输中不同精油及浓度对其存活率(％)的影响

[0030]

[0031] 实施例2：

[0032] 精油浓度的确定(香蜂草精油)：

[0033] (1)选取大小均匀，体质健康，呼吸频率一致的海鲈鱼，将其36h禁食暂养，暂养期间水温20～22℃、盐度16‰、溶解氧4～6mg/L、pH 7.5～8.5、鱼水比1:50；

[0034] (2)在室温条件下将香蜂草精油乳化，乳化方法为：V(精油):V(50％酒精):V(吐温‑80)＝10:200:1；将乳化后的精油按照相应浓度(0、10、20、40、60、80、100mg/L)加入运输水体中，水温为12(±1)℃。

[0035] (3)选取大小均匀，体质健康，呼吸频率一致的海鲈鱼，将其置于加有不同浓度香蜂草精油的运输水体中(每个浓度浸入28尾鱼)，在鱼水比1:4的条件下进行模拟运输72h，记录存活率。见表2；

[0036] (4)得出最优浓度范围，进行氧化应激及组织损伤等指标的测定。

[0037] 表2海鲈鱼运输过程中不同处理组的成活率(％)

[0038]

[0039] 实施例3：

[0040] (1)实验材料

[0041] 海鲈鱼(500±120g，39±1cm)购自中国上海芦潮港当地海鲜市场，然后用活鱼运输箱运送到实验室。将体质健康、无外伤、大小基本一致的海鲈鱼禁食暂养36h。暂养条件如下：鱼水比为1:50，水温为20～22℃，盐度为16‰，溶解氧为4～6mg/L,pH值为7.5～8.5。然后暂养水温度由20～22℃降至12℃，降温速率为3℃/h。

[0042] (2)仪器与设备

[0043] HS28A全自动循环冷水机(广东海利集团)；LX‑100VTR模拟运输振动台(上海鲁轩仪器设备厂)；F2640型多点温度采集仪；Biophotometer RS‑232分光光度仪(德国EPPENDORF)；BX‑43光学显微镜(日本Olympus)；SU5000热场发射扫描电子显微镜(日本Hitachi)；Leica RM2135切片机(德国Nussloch)。

[0044] (3)实验方法

[0045] 根据实施例2中得出的最佳浓度范围，在室温条件下将香蜂草精油乳化，乳化方法为：V(精油):V(50％酒精):V(吐温‑80)＝10:200:1；将乳化后的精油按照相应浓度(0、10、20、40)加入装有水的PE袋子中进行模拟保活运输。模拟运输时间为72h，运输过程中鱼水比为1:4，运输水温12℃，运输过程中使用曝气机持续往运输水体中空气曝气。模拟运输：B级公路运输1小时(80公里/小时)，A级公路运输4小时(100公里/小时)，B级公路运输1小时(80公里/小时)，以此循环重复12次。在完成2、4、6、8、10和12次运输循环后，随机抽取3尾黑鲈进行采样。模拟运输72h后，将海鲈鱼置于水温为12(±1)℃的干净水体中进行室温恢复
12h，完成恢复12h后，测定其相关指标。

[0046] (4)样品前处理

[0047] 按照上海海洋大学动物保护与利用委员会(SHOU‑DW‑2021–67)制定的原则和指导条例，将海鲈鱼放入冰中浸泡15分钟后处死。从尾静脉取血，全血不加抗凝剂。血液4℃静置2h，4℃离心10614g 5min后收集上清液(血清)，血清置于‑80℃冰箱保存使用。注意:血清反复冻融后不得使用。从第二鳃弓上去除鳃丝上部，将光学显微镜观察的鳃组织样品在4％甲醛溶液中浸泡24h，将扫描电镜观察的鳃组织样品在2.5％戊二醛溶液中浸泡24h，用光镜和扫描电镜观察鳃组织形态结构。最后将海鲈鱼置于冰盘上，解剖出鱼的肝脏，用生理盐水漂洗干净且用滤纸将吸干水分迅速放入‑80℃冰箱，测定肝脏组织及免疫相关指标。

[0048] (5)指标的测定

[0049] ①光学显微镜观察

[0050] 鳃丝用4％甲醛溶液固定24h，固定完成后在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH＝7.4)中漂洗三次，用各级乙醇溶液进行脱水和脱色，然后在通风橱中用二甲苯过渡，石蜡包埋，用切片机切成4μm的切片。鳃片用苏木精‑伊红(Sigma‑Aldrich)染色，梯度酒精复水、二甲苯脱蜡处理，并根据制造商的说明用中性树胶封片。光学显微镜使用光学显微镜(Olympus BX‑43，日本)拍照并记录。

[0051] ②扫描电镜观察

[0052] 将鳃丝置于2.5％的戊二醛溶液中固定24h之后，样品用0.1mol/L PBS(pH＝7.4)洗涤3次，用体积分数为30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液进行逐级脱水，脱水之后在通风橱中用乙酸异戊酯置换，在观察前对样品进行镀金导电涂层。采用热场发射扫描电子显微镜(SU5000,Hitachi,Japan)在5kV加速电压下观察鳃组织样品表面。

[0053] ③肝组织损伤指标的测定

[0054] 丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)活性参照Baldissera等的方法测定；采用试剂盒(建成生物工程研究所，南京，中国)分光光度法测定肝脏中磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)、己糖激酶(Hexokinase,HK)、肝糖原(Glycogen,Gly)、脂质过氧化物(Lipid peroxides,MDA)、caspase‑3活性及血清中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性。

[0055] ④肾组织损伤的测定

[0056] 尿酸(Uric acid，UA)和尿素氮(Urea nitrogen,BUN)试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定UA和BUN含量。

[0057] ⑤血清生化应激指标的测定

[0058] 采用葡萄糖(Glucose,Glu)和乳酸(Lactic Acid,LD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定Glu和LD含量；采用鱼皮质醇(Cortisol,Cor)、鱼热应激蛋白(Heat shock proteins,HSP)和鱼前蛋白转化酶枯草溶菌9(Proprotein Ponvertase Subtilisin Kexin type 9，PCSK‑9)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定Cor、HSPs和PCSK‑9水平。

[0059] ⑥血清氧化酶活性的测定

[0060] 通过测定过氧化氢与钼酸铵相互作用产生的黄色络合物的变化，计算血清中过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性；测定酶促反应中还原型谷胱甘肽(GSH)的消耗，计算酶促反应速度谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH‑px)的活性；GSH‑Px活性参照Boaventura等的方法进行测定；采用总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T‑AOC)试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定T‑AOC。

[0061] (6)数据分析

[0062] 采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析Duncan检验程序进行多重比较；结果用均数±标准差表示。使用Origin软件创建图表。

[0063] (7)结果与分析

[0064] ①光学显微镜观察

[0065] 鱼鳃是鱼类复杂的生理器官，是鱼体内气体交换的主要部位，它具有离子、酸碱调节和含氮废物排泄等多种生理功能。在保活运输前海鲈鱼运输前鳃小片丰盈而规则，无缺陷和鳃丝缺失。随着保活运输时间的增加鳃丝开始不同程度地收缩、塌陷、弯曲和折叠，其中40mg/L香蜂草处理组的鳃组织损伤最小。在完成恢复12h后，海鲈鱼在40mg/L香蜂草处理组的鳃丝状态恢复至运输前状态。海鲈鱼在未添加组(0mg/L)运输72h后其鳃小片严重紊乱，出现皱缩、弯曲，恢复12h后，鳃丝出现脆性断裂。这是由于在模拟运输过程中，无氧呼吸引起的酸性增加会导致鳃小片变脆从而导致其发生断裂，这些变化是由呼吸功能减弱和免疫代谢降低引起的。鳃组织的变化，如细胞增殖和鳃弯曲是一种防御机制，海鲈鱼在低温模拟运输时通过它调节和维持正常的生命活动。

[0066] ②扫描电镜观察

[0067] 模拟运输72h后，香蜂草处理组中海鲈鱼鳃结构与运输前的样品相比没有明显变化，但模拟运输后未添加组(0mg/L)的样品出现鳃丝增生以及鳃小片变形严重。经过12h恢复后，海鲈鱼在40mg/L香蜂草处理组的鳃丝排列有序且丰盈，未添加组与运输前的鳃丝状态相比仍有区别，这项电子显微镜观察结果相一致。

[0068] ③肝组织损伤

[0069] 肝脏是调节能量代谢的重要器官，是与各种器官和组织相联系的媒介。长时间的应激会导致肝组织脂质过氧化，从而破坏与磷转运网络相关的能量代谢。在保活运输初期PK活性呈上升趋势，随着保活运输时间的延长随后出现下降趋势，在第60h呈现上升趋势，可能是由于水质逐渐被恶化加剧了应激，机体需要大量的能量来抵抗环境变化。在恢复12h后，各个处理组无显著性差异。肝脏出现氧化应激反应时，机体内酶的活性会出现上升或下降趋势，根据现在以报道的数据发现不同种类的鱼体内PK活性具有一定的差异性。与香蜂草处理组相比较，未添加组的PFK活性较高，其中40mg/L处理组PFK活性上升趋势较小，并且在恢复12h后，该处理组样品于运输前鱼体内的PFK活性无显著差异。在整个保活运输过程中，PK活性在未添加组中以最高速率增加，说明该组黑鲈的胁迫响应程度高导致糖酵解速率加快。40mg/L处理组的PK活性于其他各组相比处于最低水平，恢复12h时样品中的PK活性均呈显著下降趋势。未添加组的肝糖原(Gly)显著下降，说明该组的海鲈鱼能量消耗最大。在整个活体运输过程中发生的肝糖原水平的变化与观察到的糖酵解速率的变化相一致。总体来看，40mg/L处理组糖酵解最低，能量消耗最低。由此可见，在运输水体中添加40mg/L香蜂草精油可有效缓解海鲈鱼体内的应激反应，降低其肝脏的糖酵解速率和能量代谢。

[0070] 在正常情况下，鱼体内的微量脂质过氧化物可以通过正常的机体代谢活动而被清除。但是鱼类在胁迫应激条件下会产生过量的氧自由基，这些自由基会引起脂质、蛋白质、核酸和其他生物大分子的过氧化作用。机体内过氧化物诱导的脂质过氧化损伤是一种严重的损伤类型，可对肝细胞造成广泛的损伤，如细胞结构和器官功能的破坏。随着保活运输时间的延长，各个处理组中海鲈鱼肝脏中的MDA水平呈现上升趋势，其中未添加香蜂草组中海鲈鱼肝脏中的MDA含量显著高于其他各组，添加40mg/L香蜂草精油的组海鲈鱼肝脏中的MDA含量最低。在海鲈鱼保活运输12～72h中，各组Caspase‑3活性随模拟保活运输时间的延长而持续升高，但在恢复12h时Caspase‑3活性迅速下降。未添加组的海鲈鱼体内Caspase‑3活性最高，40mg/L香蜂草精油处理组活性最低。肝脏的受损伤程度激细胞凋亡速率随着香蜂草精油添加浓度的上升而下降，这表明在运输水体中添加香蜂草精油可有效减缓海鲈鱼的肝脏应激损伤。

[0071] ④肾组织损伤

[0072] 尿酸(UA)水平的变化能充分反映动物的代谢和免疫功能状况。血清尿素氮(BUN)是经肾小球滤除氮，也是氮有机物和蛋白质代谢的主要产物。肾脏易受各种因素的侵袭，废物排泄功能降低，血液中UA和BUN含量的增加会导致体内一些有害毒素无法正常排泄到体外。随着保活运输时间的延长，海鲈鱼体内的UA和BUN含量逐渐上升，其中未添加组中样品的UA和BUN含量显著高于其他各组且呈现急剧上升的趋势，添加40mg/L香蜂草精油处理组中鱼体内的UA和BUN含量最低，由此可见在运输水体中添加香蜂草精油可以降低应激引起的肾功能衰竭。

[0073] ⑤血清生化应激指标

[0074] 葡萄糖(GLU)是满足鱼类各种生命活动的重要能量物质，血液中的葡萄糖水平通过糖原代谢和糖异生调节皮质醇释放和葡萄糖稳态，从而影响鱼的应激程度。乳酸(LD)是在氧气供应不足的情况下糖酵解产生的。随着模拟运输时间的延长各个处理组中海鲈鱼的Glu和LD水平逐渐上升并且在运输72h后达到峰值，然后在恢复12h时急剧下降,其中在运输水体中添加40mg/L香蜂草精油处理组的LD水平恢复至运输前的水平,但Glu未回至运输前水平。原因可能是血液中糖原水平的提高加剧了应激反应且机体作出无氧呼吸产生大量的LD引起的,也可能是由于血清皮质醇水平的提高,促进糖原的生成,导致GLU升高。在整个的保活运输过程中，其血清皮质醇(Cor)水平呈现先上升后下降的趋势。在保活运输初期Cor水平呈急剧上升，说明在环境胁迫初期鱼的神经内分泌系统作出了初步反应并分泌了大量的Cor。随着模拟运输时间的延长，鱼体逐渐适应应激，Cor水平缓慢下降。但由于鱼类排泄废物积累和氨氮含量增加导致水质恶化加剧了鱼的胁迫应激响应，因此鱼在运输60h后出现二次胁迫响应，且在运输72h后达到峰值。20mg/L和40mg/L香蜂草精油处理组的样品在保活运输过程中的Cor处于较低水平。在保活运输结束后恢复12h后，未添加组的样品中Cor依然处于较高水平，这说明此时应激响应还未完全消除，或者由于运输引起的生理应激需要更长的时间进行恢复。

[0075] 应激蛋白(HSPs)在正常情况下水平较低且处于稳定状态，在受到环境胁迫后不同个体之间的应激蛋白水平会有不同程度的升高以保护机体的组织和器官在应激环境下不受损害。在整个活鱼运输过程各个处理组应激蛋白水呈增长趋势且未添加香蜂草精油的组的HSPs表现出最高水平，在运输水体中添加香蜂草精油可以有效减缓HSPs水平的升高，说明香蜂草精油可以使海鲈鱼在保活运输过程中处于镇定状态从而减缓环境胁迫诱发的应激反应。

[0076] 蛋白转化酶(PCSK‑9)也被称为NARC1(神经凋亡调节转化酶)，是一种新发现的隶属于肽酶S8亚家族的枯草酶。PCSK9通过调节细胞因子的产生参与免疫调控，间接影响细胞凋亡率和血胆固醇水平，被激活的PCSK‑9具有促进细胞凋亡的作用。随着模拟运输时间的增加PCSK‑9活性呈缓慢升高的趋势，其中未添加香蜂草精油的组别上升趋势更明显。原因可能是在初始模拟运输过程中，由于拥挤运输条件和机械损伤，导致鱼体遭受强烈的应激反应和细胞凋亡，造成PCSK‑9活性被大量激活。也可能是由于运输72h后，水质的恶化加剧了海鲈鱼的应激反应，持续的胁迫反应且应激强度逐渐接近体耐受性阈值，导致海鲈鱼体内的PCSK‑9活性显著升高。PCSK‑9活性在恢复12h后显著降低但是与运输前的血清PCSK‑9活性存在差异，表明PCSK‑9活性的下降表示降低了鱼的应激反应，但应激反应并没有完全消除。

[0077] 可以发现处于镇静状态和麻醉状态的鱼比正常状态下鱼的应激响应程度更小，特别是在运输水体中添加40mg/L香蜂草精油进行保活运输时鱼的血清应激指数变化最小，本研究再次表明香蜂草精油用于鱼类保活运输能有效降低鱼的应激反应，提高鱼的抗应激能力。

[0078] ⑥血清氧化酶活性

[0079] 当鱼处在应激环境中，氧自由基的增加激活抗氧化酶的活性，通过自我调节来消‑除氧自由基。为了抵抗脂质过氧化，SOD首先将O2分解为O2和H2O2，然后CAT催化H2O2生成无害的H2O和O2。GSH‑Px作为一种重要的过氧化物酶分解酶，可催化体内其他有害过氧化物，将有毒过氧化物还原为无毒的羟基化合物，从而保护生物体细胞膜的结构和功能。MPO是中性粒细胞功能和激活的标志，MPO的过氧化物酶活性产生次氯酸盐杀死微生物和钝化酶抑制剂，中性粒细胞白细胞释放降解其附近的物质，因此这些酶组成了机体的抗氧化防御系统。

[0080] 随着保活运输时间的延长海鲈鱼体内的CAT、GSH‑Px和MPO活性在各个处理组中均呈现缓慢增长趋势,未添加香蜂草精油组的CAT和MPO活性在运输72h后显著上升，这表明随着保活运输时间的延长氧化应激程度在加剧。与其他处理组相比较，水体中添加40mg/L香蜂草精油的处理组中海鲈鱼的CAT、GSH‑Px和MPO活性最低，且抗氧化效果与香蜂草精油的添加浓度成正比。恢复12h后，各组抗氧化酶活性均呈明显下降趋势，其中40mg/L香蜂草精油处理组的酶活性最低，这意味着在运输水中添加40mg/L香蜂草精油可以使鱼体在恢复期更快地消除应激反应，并逐渐恢复到运输前的状态。且低温保活运输在一定程度上抑制了鱼体内酶的活性，香蜂草精油的应用在低温条件下表现出了良好的抗氧化酶活性。

[0081] 总抗氧化能力(T‑AOC)是指由各种抗氧化物质和抗氧化酶组成的总抗氧化水平，保护细胞和机体免受活性氧造成的氧化应激损伤，总抗氧化能力可以用来评价生物活性物质的抗氧化能力。随着模拟运输时间的增加，T‑AOC活性降低，与各处理组相比，未添加香蜂草精油的组别海鲈鱼体内的T‑AOC显著下降，随着在水体中香蜂草精油添加浓度的增加，机体T‑AOC的下降速率变小。在运输结束恢复12h后，40mg/L香蜂草精油处理组的海鲈鱼体内T‑AOC恢复至运输前状态，综上所述，研究发现在运输水体中添加香蜂草精油可以在活鱼运输过程中起到镇静和抗氧化应激作用，保护鱼免受氧化应激，推荐保活运输条件为：水体中添加香蜂草精油浓度为40mg/L，运输水温为12℃，运输过程中持续往水体中进行空气曝气。

[0082] 本发明所提供的保活运输方法，可以有效减低海鲈鱼在保活运输过程中的能量消耗和新陈代谢速率，有效减缓保活运输对鳃、肝和肾组织诱发的损伤和细胞凋亡，延缓海鲈鱼血清皮质醇、应激蛋白、乳酸、血糖以及氧化酶活性上升，增强海鲈鱼在运输中的总抗氧化能力，与常规运输相比可将活鱼运输存活率提高46％，获得更高的经济效益。

[0083] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。