一种靶向HER2的光热纳米材料及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种靶向HER2的光热纳米材料及其制备方法与应用，其中，制备方法包括步骤：提供靶向HER2的纳米抗体；制备BSA包覆CuS的纳米颗粒，记为CuS@BSA NPs；将所述CuS@BSA NPs与所述纳米抗体偶联，得到靶向HER2的光热纳米材料，记为CuS@BSA‑NB2NPs。本发明制备的靶向HER2的光热纳米材料通过NB2纳米抗体形成靶向HER2的功能，在近红外激光照射下，通过光热制剂CuS形成产生光热效应作用，最终可以靶向HER2高表达肿瘤进行光热治疗。因此，本发明制备的CuS@BSA‑NB2NPs为应用于HER2高表达肿瘤治疗提供一种新的治疗材料，形成一种药物递送系统，以及为纳米抗体药物靶向肿瘤细胞治疗提供一定的参考。

权利要求

1.一种靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其特征在于，包括步骤：提供纯化的靶向HER2的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

在磁力搅拌条件下将二水氯化铜加入到BSA水溶液中，得到初始溶液；

在磁力搅拌条件下将硫化胺溶液加入到所述初始溶液中，得到二次溶液；

在磁力搅拌条件下对所述二次溶液进行加热处理，反应得到BSA包覆CuS的纳米颗粒，记为CuS@BSA NPs；

对所述CuS@BSA NPs中BSA上的羧基基团进行活化处理，得到活化后CuS@BSA NPs；

将所述活化后CuS@BSA NPs与所述纳米抗体加入到缓冲液中，混合使纳米抗体与所述活化后CuS@BSA NPs中的BSA偶联，得到靶向HER2的光热纳米材料，记为CuS@BSA‑NB2 NPs。

2.根据权利要求1所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其特征在于，纯化的靶向HER2的纳米抗体的制备包括步骤：将带有编码所述纳米抗体的基因质粒转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；

将所述重组大肠杆菌接种于包含氨苄青霉素的肉膏蛋白胨培养基中，之后加入异丙基‑β‑d‑硫代半乳糖苷诱导过夜，得到诱导后培养基；

对诱导后培养基进行离心处理，弃去第一上清液，离心得到菌体；

将所述菌体重悬在缓冲液后进行超声处理，之后进行离心处理，收集第二上清液；

将谷胱甘肽树脂加入柱子中，然后将所述第二上清液过所述柱子；

用还原型谷胱甘肽缓冲液洗脱所述柱子，同时收集洗脱液；

将所述洗脱液在缓冲液中进行透析处理后再进行离心处理，收集第三上清液，即制得纯化的靶向HER2的纳米抗体。

3.根据权利要求1所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其特征在于，在磁力搅拌条件下对所述二次溶液进行加热处理的步骤中，加热温度为80‑100℃，加热时间为20‑

40min。

4.根据权利要求1所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其特征在于，对所述CuS@BSA NPs中BSA上的羧基基团进行活化处理，得到活化后CuS@BSA NPs的步骤包括：将CuS@BSA NPs分散在2‑(N‑吗啡林)乙磺酸缓冲液中，得到CuS@BSA NPs重悬液；

向所述CuS@BSA NPs重悬液中加入1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺并混合，使所述CuS@BSA NPs中BSA上的羧基基团活化，得到活化后CuS@BSA NPs。

5.一种靶向HER2的光热纳米材料，其特征在于，采用权利要求1‑4任一所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法制得。

6.一种如权利要求5所述靶向HER2的光热纳米材料的应用，其特征在于，将所述靶向HER2的光热纳米材料用于制备治疗HER2高表达肿瘤的药物。

7.根据权利要求6所述靶向HER2的光热纳米材料的应用，其特征在于，所述HER2高表达肿瘤为乳腺癌、肺癌和消化道癌症中的一种。

说明书

一种靶向HER2的光热纳米材料及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及纳米抗体技术领域，尤其涉及一种靶向HER2的光热纳米材料及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 人类表皮生长因子受体‑2(Human epidermal growth factor receptor‑2，HER2)是乳腺癌的重要预后因素，也是治疗HER2阳性乳腺癌的重要靶点。最新统计数据显示，女性乳腺癌首次超过肺癌，成为全球最常见的癌症。大约20％～30％的乳腺癌患者存在HER2过表达，并产生高侵袭性、无病生存期短和预后不良等反应。抗HER2靶向药物的出现大大提高了此类乳腺癌患者的治疗效果，HER2靶向治疗药物主要包括三类：单克隆抗体类(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、伊妥珠单抗)，小分子类(拉帕替尼、吡罗替尼)和抗体偶联药物类(恩美曲妥珠)。目前，帕妥珠单抗和曲妥珠单抗双靶向联合多西他赛化疗的抗HER2药物是局部晚期乳腺癌的主要一线标准治疗。单抗类药物虽然可以带来实质性的治疗效果，但是会产生一定的耐药性，还有很强的毒副作用如心脏毒性。抗体偶联药物类药物为患者带来了新的希望，可将细胞毒制剂靶向递送至癌细胞内，与通常的化疗相比，可减少细胞毒制剂的全身暴露。因此，新辅助治疗目前是治疗HER2阳性乳腺癌的重要方案。

[0003] 纳米抗体是一种来自骆驼科动物的特殊抗体，只含有一个重链可变域(the variable domain of heavy chain of heavy‑chain antibody，VHH)，天然缺失轻链和重链恒定区1的抗体，只有一个抗原结合域。与人类抗体相比，骆驼和人类抗体同源性高达80％，体积是常规抗体的1/10。因此，纳米抗体可以识别常规抗体难以识别的位点，并且可以接近凹表位作为酶催化位点。与传统抗体相比，作为微小的功能性抗原结合片段，纳米抗体具有稳定性更高、亲和力更高、更容易表达和组织穿透力更强的优势。因此，可以通过纳米抗体来治疗某些肿瘤，而且多项纳米药物研究也正在开发研究阶段，但是目前有关纳米抗体治疗肿瘤相关研究报道较少。

[0004] 因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

[0005] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向HER2的光热纳米材料及其制备方法与应用，为纳米抗体药物靶向肿瘤细胞治疗提供参考。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 一种靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其中，包括步骤：

[0008] 提供纯化的靶向HER2的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0009] 在磁力搅拌条件下将二水氯化铜加入到BSA水溶液中，得到初始溶液；

[0010] 在磁力搅拌条件下将硫化胺溶液加入到所述初始溶液中，得到二次溶液；

[0011] 在磁力搅拌条件下对所述二次溶液进行加热处理，反应得到BSA包覆CuS的纳米颗粒，记为CuS@BSA NPs；

[0012] 对所述CuS@BSA NPs中BSA上的羧基基团进行活化处理，得到活化后CuS@BSA NPs；

[0013] 将所述活化后CuS@BSA NPs与所述纳米抗体加入到缓冲液中，混合使纳米抗体与所述活化后CuS@BSA NPs中的BSA偶联，得到靶向HER2的光热纳米材料，记为CuS@BSA‑NB2 NPs。

[0014] 所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其中，纯化的靶向HER2的纳米抗体的制备包括步骤：

[0015] 将带有编码所述纳米抗体的基因质粒转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；

[0016] 将所述重组大肠杆菌接种于包含氨苄青霉素的肉膏蛋白胨培养基中，之后加入异丙基‑β‑d‑硫代半乳糖苷诱导过夜，得到诱导后培养基；

[0017] 对诱导后培养基进行离心处理，弃去第一上清液，离心得到菌体；

[0018] 将所述菌体重悬在缓冲液后进行超声处理，之后进行离心处理，收集第二上清液；

[0019] 将谷胱甘肽树脂加入柱子中，然后将所述第二上清液过所述柱子；

[0020] 用还原型谷胱甘肽缓冲液洗脱所述柱子，同时收集洗脱液；

[0021] 将所述洗脱液在缓冲液中进行透析处理后再进行离心处理，收集第三上清液，即制得纯化的靶向HER2的纳米抗体。

[0022] 所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其中，在磁力搅拌条件下对所述二次溶液进行加热处理的步骤中，加热温度为80‑100℃，加热时间为20‑40min。

[0023] 所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，其中，对所述CuS@BSA NPs中BSA上的羧基基团进行活化处理，得到活化后CuS@BSA NPs的步骤包括：

[0024] 将CuS@BSA NPs分散在2‑(N‑吗啡林)乙磺酸缓冲液中，得到CuS@BSA NPs重悬液；

[0025] 向所述CuS@BSA NPs重悬液中加入1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺并混合，使所述CuS@BSA NPs中BSA上的羧基基团活化，得到活化后CuS@BSA NPs。

[0026] 一种靶向HER2的光热纳米材料，其中，采用本发明所述靶向HER2的光热纳米材料的制备方法制得。

[0027] 一种靶向HER2的光热纳米材料的应用，其中，将所述靶向HER2的光热纳米材料用于制备治疗HER2高表达肿瘤的药物。

[0028] 所述靶向HER2的光热纳米材料的应用，其中，所述HER2高表达肿瘤为乳腺癌、肺癌和消化道癌症中的一种。

[0029] 有益效果：本发明提供了一种靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，将纯化好的NB2纳米抗体与制备完成的牛血清白蛋白包裹CuS纳米粒子(CuS@BSA NPs)进行偶联形成CuS@BSA‑NB2 NPs。本发明制备的靶向HER2的光热纳米材料CuS@BSA‑NB2 NPs，通过NB2纳米抗体形成靶向HER2的功能，在近红外激光照射下，通过光热制剂CuS形成产生光热效应作用，最终可以靶向HER2高表达肿瘤进行光热治疗。另外，采用的纳米抗体作为靶向HER2的功能，纳米抗体较常规抗体具有更多的优点：分子量小、亲和力强、稳定性高。因此，本发明为应用于HER2高表达肿瘤，例如乳腺癌、肺癌、消化道癌症等，治疗提供一种新的治疗材料，形成一种药物递送系统，以及为纳米抗体药物靶向肿瘤细胞治疗提供一定的参考。

附图说明

[0030] 图1为本发明一种靶向HER2的光热纳米材料的制备方法较佳实施例的流程图。

[0031] 图2为实施例1中所有样品在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳结果图。

[0032] 图3为实施例2中制得的CuS@BSA NPs的透射电子显微镜图。

[0033] 图4为实施例3中制得的CuS@BSA‑NB2 NPs的透射电子显微镜图。

[0034] 图5为实施例1‑实施例3中的NB2纳米抗体、CuS@BSA NPs和CuS@BSA‑NB2 NPs的红外光谱图。

[0035] 图6为实施例2和实施例3中的CuS@BSA NPs和CuS@BSA‑NB2 NPs的紫外可见吸收测试结果图。

[0036] 图7为实施例3制得的CuS@BSA‑NB2 NPs在808nm激光下随着时间延长温度逐渐升高的红外成像图。

[0037] 图8为实施例4中MDA‑MB‑231/EV和MDA‑MB‑231/HER2的免疫印记图。

[0038] 图9为CuS@BSA‑NB2 NPs处理MDA‑MB‑231/EV和MDA‑MB‑231/HER2细胞的免疫荧光图。

[0039] 图10为CuS@BSA‑NB2 NPs处理MDA‑MB‑231/EV和MDA‑MB‑231/HER2细胞的荧光强度柱状统计图。

[0040] 图11为不同浓度CuS@BSA‑NB2 NPs在MDA‑MB‑231/HER2细胞毒性结果图。

[0041] 图12为CuS@BSA‑NB2 NPs的细胞光热效应测试结果图。

[0042] 图13为CuS@BSA‑NB2 NPs光热治疗MDA‑MB‑231/HER2细胞活死细胞荧光染色图。

[0043] 图14为CuS@BSA‑NB2 NPs光热治疗MDA‑MB‑231/HER2细胞活死细胞柱状统计图。

具体实施方式

[0044] 本发明提供一种靶向HER2的光热纳米材料及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0045] 由于纳米颗粒在生物医学应用中副作用少、疗效好，有望成为的新型肿瘤治疗药物。其中，光热治疗纳米粒子由于具有体积小、导热系数高、比表面积大等优点，得到了不断的应用和发展。硫化铜纳米颗粒(Copper(II)sulfide nanoparticles,CuS NPs)是一种具有等离子体共振特性的光热治疗纳米颗粒，在外部近红外激光的照射下，在短时间内表现出很高的光热效应。此外，CuS NPs在治疗肿瘤细胞方面具有非侵入性、精确性、低副作用和高效率的优点，被认为是最具潜力的癌症疗法之一。由于硫化铜纳米颗粒本身毒性较高，可以优化材料结构特性以合成具有复合特性的新型纳米粒子，可以展现出更低毒、优良和个性化的治疗效果。

[0046] 基于此，本发明提供了一种靶向HER2的光热纳米材料的制备方法，如图1所示，其包括步骤：

[0047] S10、提供纯化的靶向HER2的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

[0048] S20、在磁力搅拌条件下将二水氯化铜加入到BSA水溶液中，得到初始溶液；

[0049] S30、在磁力搅拌条件下将硫化胺溶液加入到所述初始溶液中，得到二次溶液；

[0050] S40、在磁力搅拌条件下对所述二次溶液进行加热处理，反应得到BSA包覆CuS的纳米颗粒，记为CuS@BSA NPs；

[0051] S50、对所述CuS@BSA NPs中BSA上的羧基基团进行活化处理，得到活化后CuS@BSA NPs；

[0052] S60、将所述活化后CuS@BSA NPs与所述纳米抗体加入到缓冲液中，混合使纳米抗体与所述活化后CuS@BSA NPs中的BSA偶联，得到靶向HER2的光热纳米材料，记为CuS@BSA‑NB2 NPs。

[0053] 本实施例首先筛选了一个能够识别HER2胞外区的纳米抗体(Nanobody2，NB2)，所述纳米抗体可以靶向识别HER2高表达的细胞和组织，所述纳米抗体的氨基酸序列具体为：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Leu Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Pro Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser；然后，利用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)对CuS纳米粒子进行改性，得到BSA包覆CuS的纳米颗粒，记为CuS@BSA NPs；最后将所述纳米抗体与所述CuS@BSA NPs进行偶联，形成靶向HER2的光热纳米材料，记为CuS@BSA‑NB2 NPs。本实施例制得的CuS@BSA‑NB2纳米粒子能特异性靶向识别HER2高表达肿瘤，在对人体危害较小的近红外激光照射下能光热杀死HER2高表达肿瘤细胞，为HER2高表达肿瘤新辅助治疗提供一种新的靶向治疗递送系统；所述CuS@BSA‑NB2纳米粒子在一定浓度范围内，对细胞毒性较低，在近红外激光照射下，对HER2高表达细胞也具有显著的治疗效果，在应用于HER2靶向治疗提供一种可能。

[0054] 下面通过具体实施例对本发明一种靶向HER2的光热纳米材料及其制备方法与应用做进一步的解释说明：

[0055] 实施例1

[0056] 纯化的靶向HER2的纳米抗体的制备具体包括步骤：

[0057] 1)、将10μL转化得到带有NB2基因质粒的大肠杆菌加入20mL含50μg/mL的氨苄青霉素的肉膏蛋白胨培养基中，37℃摇床培养过夜，得到种子培养基；

[0058] 2)、将所述种子培养基接种于250mL氨苄青霉素的肉膏蛋白胨培养基中，接种比例为1％，测得600nm处吸光度达到0.6～0.8时，取1mL培养基作为诱导前样品；

[0059] 3)、0.5M异丙基‑β‑d‑硫代半乳糖苷加入到步骤2)的培养基中，在19℃下诱导过夜后，取1mL培养基作为诱导后样品；

[0060] 4)、将步骤3)中诱导完成的培养基离心(4000rpm，15min，4℃)，弃去上清液，离心得到的细菌在‑80℃下储存；

[0061] 5)、加入30mL含1mM苯甲磺酰氟的磷酸盐缓冲盐溶液重悬步骤4)中的菌体，并进行超声处理：开启2s，关闭3s，30％功率，30min，然后将细菌离心(5000rpm，10min，4℃)，收集上清液；同时，取部分沉淀物和100μL上清液作为破碎沉淀和破碎上清样品；

[0062] 6)、1mL谷胱甘肽树脂加入柱中，预先用10倍体积的磷酸盐缓冲盐溶液过柱洗涤谷胱甘肽树脂，将步骤5)中得到的上清液过柱子，取100μL过柱后样品作为流川样品。然后加入20倍体积的磷酸盐缓冲盐溶液过柱子，去除其他杂蛋白，同时取100μL溶液作为洗涤样品；

[0063] 7)、用还原型谷胱甘肽(10mM，pH＝8.0)缓冲液洗脱过柱子，同时实时监测洗脱液中600nm处的吸光度，直到与空白组吸光度相似。洗脱完成后，取100μL溶液作为洗脱样品；

[0064] 8)、将步骤7)得到的洗脱液在磷酸盐缓冲盐溶液中透析24h，然后离心(1000rpm，10min，4℃)，分管搜集上清液，便是NB2纳米抗体，储存在‑80℃。

[0065] 将本实施例1中所有取得的样品分别加入40μL 6×蛋白印迹上样缓冲液，在100℃下加热20min后制备蛋白检测样品，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果如图2所示。从图2可以看出，第8泳道证明NB2纳米抗体纯化成功，其蛋白分子量为39KDa。

[0066] 实施例2

[0067] CuS@BSA NPs的制备具体包括以下步骤：

[0068] 1)、在室温磁力搅拌下，将250μL二水氯化铜(0.75M)滴加到装有10mL BSA水溶液(10mg/mL)的圆底烧瓶中，反应时间为10s，此时溶液变为淡蓝色；

[0069] 2)、在室温磁力搅拌下，将109μL的硫化铵溶液加入步骤1)的溶液中，反应时间为10s，溶液变成深棕色；

[0070] 3)、用锡箔纸包裹住瓶口，将步骤2)得到的溶液置于90℃油浴锅中磁力搅拌加热反应，反应时间为30min，反应结束后，得到的溶液便是CuS@BSA NPs，溶液颜色为黑绿色；

[0071] 4)、在4000rpm下将CuS@BSA NPs超滤20min，用6mL磷酸盐缓冲盐溶液重悬，用0.22μm注射器过滤，CuS@BSA NPs最后储存于4℃。

[0072] 对本实施例2制得的CuS@BSA NPs进行电子显微拍照，结果如图3所示。本实施例制得的BSA修饰的硫化铜纳米颗粒(CuS@BSA NPs)具备体积小，导热系数高，比表面积大，制备成本低，方法简单，合成速度快，且较具有更强的稳定性和生物相容性。在光热治疗肿瘤细胞过程中，CuS@BSA纳米颗粒在低浓度的情况下仍能发挥较强光热效应，在其他多种肿瘤治疗方案中，也可以利用该纳米材料进行建立治疗研究模型。

[0073] 实施例3

[0074] CuS@BSA‑NB2 NPs的制备具体包括以下步骤：

[0075] 1)、将制备的1mL的CuS@BSA NPs超滤20min后，用2‑(N‑吗啡林)乙磺酸缓冲液(0.1M，pH＝6.0，1mL)重悬；

[0076] 2)、将0.4mg 1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.7mg N‑羟基琥珀酰亚胺加入到(1)溶液中，活化BSA上的羧基基团，反应30min；

[0077] 3)、反应完成后，将溶液超滤20min，并用1mL磷酸盐缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline，PBS)重新悬浮。接着缓慢加入100μL纯化完成的纳米抗体，室温反应2h；

[0078] 4)、反应完成后，将溶液在4℃下透析24h以去除过量的纳米抗体，得到纳米抗体与BSA偶联形成CuS@BSA‑NB2 NPs，最后，将CuS@BSA‑NB2 NPs储存在4℃。

[0079] 对本实施例3制得的CuS@BSA‑NB2 NPs进行电子显微拍照，结果如图4所示。分别测量实施例1‑实施例3中的NB2纳米抗体、CuS@BSA NPs和CuS@BSA‑NB2 NPs的红外光谱，结果如图5所示，从图5可以看出，实施例3中成功合成了CuS@BSA‑NB2 NPs。对实施例2和实施例3分别制备的CuS@BSA NPs和CuS@BSA‑NB2 NPs进行紫外可见吸收测试，结果如图6所示，从图6可以看出，所述CuS@BSA NPs和CuS@BSA‑NB2 NPs在近红外波长区域有较强的吸收。对实施例3制得的CuS@BSA‑NB2 NPs在808nm激光下持续照射，测量其随时间变化的红外成像图，结果如图7所示，从图7可以看出，CuS@BSA‑NB2 NPs在808nm激光下随着时间延长温度逐渐升高。

[0080] 实施例4

[0081] 构建HER2高表达的稳定细胞株：

[0082] 1)、载体的构建：通过聚合酶链反应将HER2(NM_004448.4)目的基因构建到真核抗性的 慢 病毒 空 载 体 p L V 3 中 。扩 增 引 物为 ：正 向 引 物 (5 '→ 3 ') 为ataagaatgcggccgccatggagctggcggc，反向引物(5 '→3 ') 为ccgctcgagcactggcacgtccagaccca。扩增外源目的基因片段后，通过脱氧核糖核酸凝胶电泳将聚合酶链式反应产物进行胶回收。接着，将2μg的空载体和回收的目的基因分别进行加入两种限制性内切酶和双酶切效率为100％的缓冲液，37℃水浴双酶切反应2h，用DNA连接酶将空载体和目的基因在16℃下连接过夜后，将酶连产物转入大肠杆菌DH5α中。最后，通过筛选鉴定及测序获得pLV3‑HER2重组克隆。

[0083] 2)、构建HER2高表达稳定株：将pLV3‑HER2和pLV3分别构建到MDA‑MB‑231细胞中，形成相应的稳定株。将6μg总质粒(psPAX2:pMD2.G:plv3‑HER2/plv3＝3:1:4)加入到500μL无血清细胞冻存培养基中并静置5min。然后加入18μg转染试剂，静置20min。接着，将混合物和1.5mL培养基加入具有80％密度的293T细胞的6cm培养皿中，在细胞培养箱中孵育8h。然后，在培养皿中加入5mL完全培养基，培养30h，收集病毒。随后，每24小时将1mL病毒、1mL新鲜培养基和8μg/mL聚凝胺加入具有40％密度的人乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的35mm培养皿中以感染细胞，进行两次感染。最后，在培养皿中加入含10μg/mL嘌呤霉素的完全培养基杀死未感染的细胞，直至细胞不再死亡，即为稳定细胞系。最后，取一些稳定的细胞系离心(5000rpm，5min，4℃)，然后用100μL磷酸盐缓冲盐溶液重悬，分别加入40μL 6×蛋白印迹上样缓冲液，在100℃下加热20min后制备蛋白检测样品用于免疫印迹分析。

[0084] 3)、免疫印迹检测HER2高表达稳定株：首先，将制备好的蛋白质样品和分子量标记物上样到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳完成后，将凝胶取下，在转膜仪上将蛋白转移到用甲醇激活的聚偏二氟乙烯膜上。将含有蛋白的聚偏二氟乙烯膜与5％脱脂牛奶在室温下孵育30min，然后与稀释的一抗HER2抗体在4℃下孵育过夜。第二天，含有蛋白的聚偏二氟乙烯膜用洗涤缓冲液洗涤3次，每次4分钟，并与稀释的辣根过氧化酶标记的二抗β‑肌动蛋白室温孵育40分钟。然后再次用洗涤缓冲液洗涤含有蛋白的聚偏二氟乙烯膜，洗涤3次，每次4分钟。最后，加入超灵敏电化学发光底物后进行显影。图8是免疫印迹图，第一泳道为对照组，第二泳道有HER2条带，图8结果可以证明构建稳定细胞株成功。

[0085] 实施例5

[0086] 免疫荧光法检测CuS@BSA‑NB2 NPs靶向MDA‑MB‑231/HER2细胞：

[0087] 1)、将MDA‑MB‑231/HER2细胞和MDA‑MB‑231‑EV细胞两种细胞接种于带有细胞爬片的12孔板中，细胞密度约为60％～70％，孵育过夜；

[0088] 2)、将含有CuS@BSA‑NB2 NPs(1.2mg/mL,10μL)的培养基(1mL)添加到每个孔中并孵育2h；

[0089] 3)、第二天弃去培养基，用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次。然后，将1mL的多聚甲醛(4％)添加到每个培养皿中固定15min，接着用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次；

[0090] 4)、加入1％曲拉通X‑100(500μL)孵育10min，接着用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次；

[0091] 5)、加入100μL二抗VHH(1:1000)，孵育1h，孵育完成后用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次；

[0092] 6)、加入1mL 4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚(DAPI)(1:5000)，在黑暗中孵育10min，孵育完成后用磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次；

[0093] 7)、将细胞爬片取出，用猝灭剂和指甲油封片。最后，在荧光显微镜下观察细胞并拍照。

[0094] 其中，图9为CuS@BSA‑NB2 NPs处理MDA‑MB‑231/EV和MDA‑MB‑231/HER2细胞的免疫荧光图，图10为CuS@BSA‑NB2 NPs处理MDA‑MB‑231/EV和MDA‑MB‑231/HER2细胞的荧光强度柱状统计图。从图8‑图9可以看出，CuS@BSA‑NB2 NPs在MDA‑MB‑231/HER2细胞中有明显的富集，说明CuS@BSA‑NB2 NPs具有靶向高表达HER2细胞的作用。

[0095] 实施例6

[0096] 光热治疗细胞

[0097] 1、细胞毒性检测

[0098] 通过噻唑蓝法测量CuS@BSA‑NB2 NPs的细胞毒性。将构建好的MDA‑MB‑231/HER2细胞接种到96孔板中，接种密度为80％，每孔含有100μL培养基，培养24小时。CuS@BSA‑NB2 NPs用完全培养基稀释成不同浓度：0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL。每孔加入100μL不同浓度的含药物培养基，设置3个复孔，在细胞培养箱中培养24h。然后，除去含药物培养基，每孔用于磷酸盐缓冲盐溶液洗涤3次后，加入100μL中含有10μL噻唑蓝的无血清细胞冻存培养基，继续孵育4h。最后，除去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，通过多功能酶标仪在570nm处测量吸光度。

[0099] 测定不同浓度CuS@BSA‑NB2 NPs在MDA‑MB‑231/HER2细胞毒性，结果如图11所示，从图11可以看出，在24h内，0～100μg/mL的CuS@BSA‑NB2 NPs几乎无细胞毒性。

[0100] 2、细胞光热效应检测

[0101] 1)、通过噻唑蓝法测量CuS@BSA‑NB2 NPs的细胞光热效应，选择50μg/mL的CuS@BSA‑NB2 NPs和CuS@BSA NPs来检测光毒性。MDA‑MB‑231/HER2细胞接种于96孔板中，细胞密度为80％，分成两组。每组分别加入100μL分别含有PBS、CuS@BSA NPs和CuS@BSA‑NB2 NPs的2
完全培养基，三个复孔，每孔孵育24小时。然后，一组用808nm(80s，2W/cm )激光照射，另一组不照射作为对照组，然后继续在细胞培养箱中培养2h。然后，除去含药物培养基，每孔用于磷酸盐缓冲盐溶液轻轻洗涤3次后，加入100μL中含有10μL噻唑蓝的无血清细胞冻存培养基，继续孵育4h。最后，除去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，通过多功能酶标仪在570nm处测量吸光度。

[0102] 测定CuS@BSA‑NB2 NPs的细胞光热效应，结果如图12所示，从图12可以看出，CuS@BSA‑NB2 NPs的光热效应较无靶向效果的CuS@BSA NPs组更显著。

[0103] 2)、使用钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein Acetoxymethyl Ester，Calcein AM)和碘化丙啶(Propidium Iodid，PI)检测CuS@BSA‑NB2 NPs的细胞光热效应。同1)一样处理后，2
进行808nm(160s，1W/cm)照射，另一组不照射作为对照组，培养2h。去除培养基，然后将含有2μM的Calcein AM的新鲜培养基加入每孔中，持续30分钟。去除AM后，加入50μg/mL PI，孵育10min。除去PI后，每孔加入500μL磷酸盐缓冲盐溶液洗涤。最后用倒置荧光显微镜观察活细胞和死细胞并拍照，计数活死细胞数量。

[0104] CuS@BSA‑NB2 NPs光热治疗MDA‑MB‑231/HER2细胞活死细胞荧光染色图(比例尺为100nm)和柱状统计图分别如图13和图14所示，从图13‑图14可以看出，CuS@BSA‑NB2 NPs在MDA‑MB‑231/HER2细胞中有明显的光热治疗效应。

[0105] 综上所述，本发明制备的靶向HER2的光热纳米材料CuS@BSA‑NB2 NPs，通过NB2纳米抗体形成靶向HER2的功能，在近红外激光照射下，通过光热制剂CuS形成产生光热效应作用，最终可以靶向乳腺癌进行光热治疗。另外，采用的纳米抗体作为靶向HER2的功能，纳米抗体较常规抗体具有更多的优点：分子量小、亲和力强、稳定性高；而且，纳米抗体药物治疗肿瘤相关研究报道较少。因此，本发明为应用于HER2高表达肿瘤，例如乳腺癌、肺癌、消化道癌症等的治疗提供一种新的治疗材料，形成一种药物递送系统，以及为纳米抗体药物靶向肿瘤细胞治疗提供一定的参考。

[0106] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。