本发明涉及一种乏氧敏感基因载体及其制备方法与应用。本发明以聚乙烯亚胺接枝硝基化合物，再通过纳米沉淀法形成所述乏氧敏感基因载体。本发明提供的聚乙烯亚胺接枝硝基化合物可以在细胞内的硝基还原酶以及NADH共同作用下，发生电荷反转，实现基因药物释放，提高转染效率。本发明可以负载多种带负电荷药物分子，具有广阔的应用前景和巨大的研究价值。
其中，R选自被一个、两个或多个硝基苯基取代的Ra基团；所述Ra选自被一个、两个或多个Rb取代的C1‑40烷基、C3‑40环烷基、C6‑20芳基、5‑20元杂芳基、C6‑20芳基氧基、5‑20元杂芳基氧基；Rb选自C1‑40烷基、C3‑40环烷基、C1‑40烷氧基；n为大于2的整数；X为阴离子，所述阴离子选自卤素阴离子。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，式(I)聚合物的分子量为5000‑50000。
3.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，式(I)聚合物的接枝率为1‑20％。
4.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，式(I)聚合物的接枝率为2‑15％。
5.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，X选自Cl、I。
6.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于，式(I)所示聚合物具有以下结构单元：其中，X具有权利要求1所述的定义。
7.权利要求1所述聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
化合物1与化合物2在卤代烷作用下反应得到式(I)所示化合物；
所述反应在溶剂存在下进行，所述溶剂选自N,N‑二甲基甲酰胺、N,N‑二甲基乙酰胺、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃中的至少一种；
所述化合物1与所述溶剂的质量体积比为1:5‑100g:mL；
所述化合物1中可反应的叔胺基团与化合物2的摩尔比为1:0.5‑5；
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述化合物1与所述溶剂的质量体积比为1:5‑50g:mL；
所述化合物1中可反应的叔胺基团与化合物2的摩尔比为1:0.8‑3；
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为1‑72h；所述反应温度为10‑80℃。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为24‑36h；所述反应温度为20‑60℃。
11.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1)化合物(4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇的合成
将羟基苯甲醇，碳酸钾，对硝基苄溴，三者摩尔比按1:0.5～10:0.1～100的比例加入到N，N‑二甲基甲酰胺中，搅拌使其溶解，溶解完成后溶液为淡黄色，反应5～36小时溶液呈现墨绿色；过滤除去固体不溶物，依次使用饱和氯化钠水溶液、乙酸乙酯洗涤反应液，最后收集的有机相使用无水硫酸镁除去水过滤后，旋转蒸发溶剂即得产物；
A2)将(4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇溶于二氯甲烷后加入到反应器中，加入三乙胺作为缚酸剂,将反应液置于冰浴下搅拌1～100min使得反应液温度降为较低的温度，在冰浴条件下滴加入丙烯酰氯，(4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇、三乙胺、丙烯酰氯的摩尔比例为1:0.1～10:0.1～10；反应5～36小时后用饱和NaCl水溶液洗涤三次，收集有机相，通过无水硫酸镁除水，过滤除去固体后旋转蒸发溶剂，通过乙酸乙酯：正己烷柱层析分离产物，乙酸乙酯：正己烷的体积比为1:0.5～10，产物为丙烯酸4‑((4‑硝基苄基)氧基)苄基酯；
A3)称取0.1～1g分子量为10K的支状聚乙烯亚胺于反应器中，加入0.1～10mL无水N，N‑二甲基甲酰胺搅拌至聚乙烯亚胺完全溶解，待溶解充分无明显粘稠液体后，加入0.1～10g丙烯酸4‑((4‑硝基苄基)氧基)苄基酯，室温下搅拌反应2～48小时后转移至45℃水浴锅中反应10～48小时；取碘甲烷0.1～1mL加入反应体系中，避光反应1～24小时；反应完成后，用乙醚沉淀三次，去除未反应的碘甲烷；之后用二氯甲烷沉淀三次，去除未反应的单体，将沉淀后的固体置于真空烘箱中除去残留的溶剂；溶剂去除完成后得到黄色粉末固体，常温干燥保存。
12.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
B1)将对硝基苯甲醇0.1～10g溶于二氯甲烷后加入100mL的圆底烧瓶中，加入1～10mL三乙胺作为缚酸剂，将反应液置于冰浴下搅拌1～30min使得反应液温度降为较低的温度，在冰浴条件下缓慢滴加入0.1～10mL丙烯酰氯，反应5～24小时后用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，收集有机相，通过无水硫酸镁除水，过滤除去固体后旋转蒸发溶剂，通过体积比为1:1～10的乙酸乙酯：正己烷柱层析分离产物，第一个点即为产物丙烯酸4‑硝基苄酯；
B2)称取0.1～1g分子量为10K的支状聚乙烯亚胺于圆底烧瓶中，加入0.1～10mL无水N，N‑二甲基甲酰胺搅拌至聚乙烯亚胺完全溶解，待溶解充分无明显粘稠液体后，加入0.1～
10g丙烯酸4‑硝基苄酯，室温下搅拌反应2～48小时后转移至45℃水浴锅中反应10～48小时；取碘甲烷0.1～1mL加入反应体系中，避光反应1～24小时；反应完成后，用乙醚沉淀三次，去除未反应的碘甲烷；之后用二氯甲烷沉淀三次，去除未反应的单体，将沉淀后的固体置于真空烘箱中除去残留的溶剂；溶剂去除完成后得到黄色粉末固体，常温干燥保存。
13.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
C1)将2‑氨基‑1H‑咪唑‑5‑羧酸乙酯1～200mg添加到1～10mL冰醋酸中，然后逐滴添加NaNO2饱和水溶液1～10mL；反应在室温下进行0.1～10小时；用乙酸乙酯萃取溶液，并用水，NaHSO3水溶液和盐水洗涤；有机溶液经无水硫酸钠干燥，并将粗产物通过柱色谱法正己烷和乙酸乙酯纯化，正己烷和乙酸乙酯的体积比为1～20:1，获得为褐色固体的化合物2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑羧酸乙酯；
C2)化合物2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑羧酸乙酯100～200mg，10～100mg NaBH4和100～300mg I2，将其溶于无水THF中；将混合物在室温下于20～40℃搅拌1～48小时；通过真空旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯萃取溶液，并用去离子水洗涤；有机层经Na2SO4干燥，粗产物通过柱色谱使用流动相正己烷和乙酸乙酯纯化，正己烷和乙酸乙酯的体积比为1：1～10，获得为黄色固体的化合物(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)甲醇；
C3)将(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)甲醇0.1～10g溶于二氯甲烷后加入100mL的圆底烧瓶中，加入1～10mL三乙胺作为缚酸剂，将反应液置于冰浴下搅拌1～30min使得反应液温度降为较低的温度，在冰浴条件下缓慢滴加入0.1～10mL丙烯酰氯，反应5～24小时后用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，收集有机相，通过无水硫酸镁除水，过滤除去固体后旋转蒸发溶剂，通过乙酸乙酯：正己烷柱层析分离产物，乙酸乙酯和正己烷的体积比为1:1～10，第一个点即为产物(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)丙烯酸甲酯；
C4)称取0.1～1g分子量为10K的支状聚乙烯亚胺于圆底烧瓶中，加入0.1～10mL无水N，N‑二甲基甲酰胺搅拌至聚乙烯亚胺完全溶解，待溶解充分无明显粘稠液体后，加入0.1～
10g(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)丙烯酸甲酯，室温下搅拌反应2～48小时后转移至45℃水浴锅中反应10～48小时；取碘甲烷0.1～1mL加入反应体系中，避光反应1～24小时；反应完成后，用乙醚沉淀三次，去除未反应的碘甲烷；之后用二氯甲烷沉淀三次，去除未反应的单体，将沉淀后的固体置于真空烘箱中除去残留的溶剂；溶剂去除完成后得到黄色粉末固体，常温干燥保存。
14.权利要求1‑6任一项所述聚合物作为药物或基因载体的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述应用为作为抗肿瘤药物载体的应用。
16.权利要求1‑6任一项所述聚合物在制备药物中的用途；所述药物包括基因药物和其他治疗性分子。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述药物为抗肿瘤药物；所述肿瘤包括中枢神经系统的肿瘤、恶性肿瘤或转移性肿瘤。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。
19.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述基因药物选自siRNA或者pDNA；所述其它治疗性分子选自吲哚菁绿或二氢卟吩E6。
20.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，权利要求1‑6任一项所述聚合物作为药物载体时，所述聚合物与药物的质量复合比为1:1‑20。
21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于，所述聚合物与药物的质量复合比为1:2‑
一种乏氧敏感药物载体聚合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于纳米与生物医药领域，具体涉及一种乏氧敏感的聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 由于人口的老龄化，经济发展带来的生活方式的改变，比如吸烟，超重，缺乏体育锻炼以及经济发展带来的环境污染等等问题导致患癌风险不断增加，癌症对大多数国家来说都是亟待解决的公共卫生问题，严重危害了人类的健康。目前癌症的治疗手段主要以各
种形式的化学疗法和放射疗法为主，手术切除作为辅助手段。化疗药物多为小分子药物，其低水溶性，低生物利用度，以及多药耐药等问题限制其应用。而放射疗法不具备特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会损伤正常细胞，带来严重的毒副作用以及不良反应，极大降低了
患者的生活质量。
[0003] 肿瘤缺氧是人和动物实体瘤的共同特征，被认为是癌症治疗的最佳靶标之一。由于肿瘤部位代谢异常，氧气供给和氧气消耗之间的平衡被打破，导致组织氧气水平下降。一方面由于肿瘤部位的血管不成熟，血液流动不良，导致氧气在肿瘤部位的不良扩散。另一方面是因为肿瘤细胞比正常细胞增殖更快，消耗更多的氧气，致使肿瘤组织血管供氧不足，进而形成高度缺氧区域。硝基还原酶可由大肠杆菌等细菌合成，同时研究表明缺氧组织或细
胞以及肿瘤中硝基还原酶的含量相对正常状态呈现升高趋势，在还原型辅酶Ⅰ(NADH)或Ⅱ
(NADPH)存在下，硝基还原酶可以催化多种外源硝基芳香族化合物发生单电子转移，生成硝基阴离子自由基，随后进一步被还原成羟胺或氨基。
[0004] 基因治疗是在分子层面进行治疗干预，被认为是极具前景的治疗方式。阳离子脂质体、阳离子聚合物以及两者的混合体系是被认为有研究价值的非病毒类载体。阳离子载
体与基因药物是通过静电相互作用结合，能够较好地保护核酸药物不被核酸酶降解，但是
进入细胞后，通常需要通过胞内蛋白质竞争才能将带负电siRNA释放出来，使得转染效率降低。同时阳离子的存在可能会影响DNA转录点的识别甚至可以与翻译相关蛋白相互作用，进一步降低了转染效率。阳离子的电荷密度可能与其毒性有着密不可分的关系，会引起非特
异性吸附增加从而导致正常细胞毒性。
[0005] 在基因药物输送的各个过程，血液循环‑肿瘤靶向‑细胞内吞‑溶酶体逃逸‑入核等对纳米颗粒表面电荷属性要求都是不一样的。如何得到一种能够在相应条件下发生电荷反转的聚合物，可以较好的递送基因药物来达到更好的肿瘤治疗效果是本领域研究的重点。
发明内容
[0006] 针对现有技术不足，本发明提供了一种乏氧敏感的聚合物，所述化合物能够在硝基还原酶的作用下发生电荷反转，释放出负载的药物。
[0007] 本发明提供的聚合物，如式(I)所示：
[0008]
[0009] 其中，R选自无取代或被一个、两个或多个硝基C6‑20芳基、硝基5‑20元杂芳基取代的Ra基团；所述Ra选自被一个、两个或多个Rb取代的C1‑40烷基、C3‑20环烷基、C6‑20芳基、5‑20元杂芳基、C6‑20芳基氧基、5‑20元杂芳基氧基；Rb选自C1‑40烷基、C3‑40环烷基、C1‑40烷氧基；n为大于2的整数。
[0010] 根据本发明的实施方案，式(I)聚合物的分子量为5000‑50000；
[0011] 根据本发明的实施方案，式(I)聚合物的接枝率为1‑20％，例如2‑15％；
[0012] 根据本发明的实施方案，式(I)所示聚合物具有以下式(I‑1)所示的结构：
[0013]
[0014] 其中，R和n具有上文所述的定义，X为阴离子，所述阴离子选自卤素阴离子，例如‑ ‑
Cl、I。
[0015] 根据本发明的实施方案，所述式(I)所示聚合物具有以下结构单元：
[0016]
[0017] 根据本发明的实施方案，所述式(I‑1)所示聚合物选自：
[0018]
[0019] 其中，X具有上文所述的定义。
[0020] 根据本发明的实施方案，式(I)所示聚合物能在硝基还原酶(NTR)以及还原型辅酶Ⅰ(NADH)下发生电荷反转，生成D结构，从而能够释放出负载的基因药物。
[0021]
[0022] 本发明还提供式(I)所示化合物的制备方法：
[0023] 化合物1与化合物2在卤代烷作用下反应得到式(I)所示化合物；
[0024]
[0025] 其中，R、n独立地具有上文所述的定义。
[0026] 根据本发明的实施方案，所述化合物1的分子量为2000‑50000；
[0027] 根据本发明的实施方案，所述反应在溶剂存在下进行，所述溶剂选自N,N‑二甲基甲酰胺、N,N‑二甲基乙酰胺、乙腈、二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃中的至少一种；
[0028] 根据本发明的实施方案，所述卤代烷选自碘甲烷；
[0029] 根据本发明的实施方案，所述化合物1与所述溶剂的质量体积比(g:mL)为1:5‑100，例如为1:5‑50；
[0030] 根据本发明的实施方案，所述化合物1中可反应的叔胺基团与化合物2的摩尔比为1:0.5‑5，例如为1:0.8‑3，示例性为1:1.5；
[0031] 根据本发明的实施方案，所述化合物2与卤代烷的摩尔比为1:0.5‑5，例如为1:0.8‑3，示例性为1:2；
[0032] 根据本发明的实施方案，所述反应的时间为1‑72h，例如为2‑48h、24‑36h；
[0033] 根据本发明的实施方案，所述反应温度为10‑80℃，例如为20‑60℃，45℃。
[0034] 根据本发明的实施方案，式(I)所示聚合物的制备方法包括以下三种路径中的至少一种：
[0035] 上述乏氧敏感的聚合物A的制备方法如下：
[0036] A1)化合物(4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇的合成
[0037] 将羟基苯甲醇，碳酸钾，对硝基苄溴，三者摩尔比按1:0.5～10:0.1～100的比例加入到N，N‑二甲基甲酰胺中，搅拌使其溶解，溶解完成后溶液为淡黄色，反应5～36小时溶液呈现墨绿色。过滤除去固体不溶物，依次使用饱和氯化钠水溶液、乙酸乙酯洗涤反应液，最后收集的有机相使用无水硫酸镁除去水过滤后，旋转蒸发溶剂即得产物。
[0038] A2)将(4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇溶于二氯甲烷后加入到反应器中，加入三乙胺作为缚酸剂,将反应液置于冰浴下搅拌1～100min使得反应液温度降为较低的温度，在冰浴条件下滴加入丙烯酰氯，(4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇、三乙胺、丙烯酰氯的摩尔比例为1:0.1～10:0.1～10。反应5～36小时后用饱和NaCl水溶液洗涤三次，收集有机相，通过无水硫酸镁除水，过滤除去固体后旋转蒸发溶剂，通过乙酸乙酯：正己烷(体积比1:0.5～
10)柱层析分离产物，产物为丙烯酸4‑((4‑硝基苄基)氧基)苄基酯。
[0039] A3)称取0.1～1g分子量为10K的支状聚乙烯亚胺于反应器中，加入0.1～10mL无水N，N‑二甲基甲酰胺搅拌至聚乙烯亚胺完全溶解，待溶解充分后(无明显粘稠液体)加入0.1～10g丙烯酸4‑((4‑硝基苄基)氧基)苄基酯，室温下搅拌反应2～48小时后转移至45℃水浴锅中反应10～48小时。取碘甲烷0.1～1mL加入反应体系中，避光反应1～24小时。反应完成后，用乙醚沉淀三次，去除未反应的碘甲烷。之后用二氯甲烷沉淀三次，去除未反应的单体，将沉淀后的固体置于真空烘箱中除去残留的溶剂。溶剂去除完成后得到黄色粉末固体，常
温干燥保存。
[0040] 乏氧敏感的聚合物A的响应机理如下
[0041]
[0042] 上述乏氧敏感的聚合物B的制备方法如下：
[0043] B1)将对硝基苯甲醇0.1～10g溶于二氯甲烷后加入100mL的圆底烧瓶中，加入1～10mL三乙胺作为缚酸剂，将反应液置于冰浴下搅拌1～30min使得反应液温度降为较低的温
度，在冰浴条件下缓慢滴加入0.1～10mL丙烯酰氯，反应5～24小时后用饱和氯化钠水溶液
洗涤三次，收集有机相，通过无水硫酸镁除水，过滤除去固体后旋转蒸发溶剂，通过乙酸乙酯：正己烷1:1～10(v/v)柱层析分离产物，第一个点即为产物丙烯酸4‑硝基苄酯。
[0044] B2)称取0.1～1g分子量为10K的支状聚乙烯亚胺于圆底烧瓶中，加入0.1～10mL无水N，N‑二甲基甲酰胺搅拌至聚乙烯亚胺完全溶解，待溶解充分后(无明显粘稠液体)加入
0.1～10g丙烯酸4‑硝基苄酯，室温下搅拌反应2～48小时后转移至45℃水浴锅中反应10～
48小时。取碘甲烷0.1～1mL加入反应体系中，避光反应1～24小时。反应完成后，用乙醚沉淀三次，去除未反应的碘甲烷。之后用二氯甲烷沉淀三次，去除未反应的单体，将沉淀后的固体置于真空烘箱中除去残留的溶剂。溶剂去除完成后得到黄色粉末固体，常温干燥保存。
[0045] 乏氧敏感的聚合物B的响应机理如下：
[0046]
[0047] 上述乏氧敏感的聚合物C的制备方法如下
[0048] C1)将2‑氨基‑1H‑咪唑‑5‑羧酸乙酯1～200mg添加到1～10mL冰醋酸中，然后逐滴添加NaNO2饱和水溶液1～10mL。反应在室温下进行0.1～10小时。用乙酸乙酯萃取溶液，并用水，NaHSO3水溶液和盐水洗涤。有机溶液经无水硫酸钠干燥，并将粗产物通过柱色谱法正己烷和EA(1～20:1，v/v)纯化，获得为褐色固体的化合物2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑羧酸乙酯。
[0049] C2)化合物2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑羧酸乙酯100～200mg，NaBH4(10～100mg)和I2(100～300mg)，将其溶于无水THF中。将混合物在室温下于20～40℃搅拌1～48小时。通过真空旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯萃取溶液，并用去离子水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，粗产物通过柱色谱使用流动相正己烷和乙酸乙酯(1：1～10，v/v)纯化，获得为黄色固体的化合物(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)甲醇。
[0050] C3)将(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)甲醇0.1～10g溶于二氯甲烷后加入100mL的圆底烧瓶中，加入1～10mL三乙胺作为缚酸剂，将反应液置于冰浴下搅拌1～30min使得反应液温度降为较低的温度，在冰浴条件下缓慢滴加入0.1～10mL丙烯酰氯，反应5～24小时后用饱和氯化钠水溶液洗涤三次，收集有机相，通过无水硫酸镁除水，过滤除去固体后旋转蒸发溶
剂，通过乙酸乙酯：正己烷1:1～10(v/v)柱层析分离产物，第一个点即为产物(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)丙烯酸甲酯。
[0051] C4)称取0.1～1g分子量为10K的支状聚乙烯亚胺于圆底烧瓶中，加入0.1～10mL无水N，N‑二甲基甲酰胺搅拌至聚乙烯亚胺完全溶解，待溶解充分后(无明显粘稠液体)加入
0.1～10g(2‑硝基‑1H‑咪唑‑5‑基)丙烯酸甲酯，室温下搅拌反应2～48小时后转移至45℃水浴锅中反应10～48小时。取碘甲烷0.1～1mL加入反应体系中，避光反应1～24小时。反应完成后，用乙醚沉淀三次，去除未反应的碘甲烷。之后用二氯甲烷沉淀三次，去除未反应的单体，将沉淀后的固体置于真空烘箱中除去残留的溶剂。溶剂去除完成后得到黄色粉末固体，常温干燥保存。
[0052] 乏氧敏感的聚合物C的响应机理如下：
[0053]
[0054] 本发明还提供式(I)所示化合物作为药物或基因载体的应用，例如作为抗肿瘤药物载体的应用。
[0055] 本发明提供式(I)所示聚合物在制备药物中的用途。所述药物包括基因药物和其他治疗性分子，例如光热试剂吲哚菁绿、二氢卟吩E6等电负性小分子。
[0056] 根据本发明的实施方案，所述式(I)所示聚合物作为所述药物的载体；所述基因药物选自siRNA或者pDNA；所述药物优选为抗肿瘤药物，所述肿瘤包括中枢神经系统的肿瘤、恶性肿瘤或转移性肿瘤，例如乳腺癌等。在一些实施方式中，当所述药物为基因药物时，将所述式(I)化合物作为载体负载基因用来治疗肿瘤；在另一实施方式中，将所述式(I)化合
物作为载体负载其他治疗性分子用来治疗肿瘤。
[0057] 根据本发明的实施方案，式(I)所示聚合物作为药物载体时，所述聚合物与药物的质量复合比为1:1‑20，例如为1:2‑15，还例如为1:5、1:10。
[0058] 本发明提供的式(I)所示聚合物在硝基还原酶与NADH的共同作用下，硝基还原为氨基后聚合物结构均发生解体，生成了羧酸根，与季胺化的PEI的氨基中和，使得聚合物的电荷减弱，实现对负载基因的快速释放。
[0059] 有益效果
[0060] 本发明的有益效果主要体现在：
[0061] (1)本发明中乏氧响应聚合物的合成步骤简单温和、低能耗；
[0062] (2)本发明中乏氧响应聚合物可在硝基还原酶的条件下结构解体并且发生电荷反转，能够高效率释放出负载的基因药物；
[0063] (3)本发明中乏氧响应聚合物带有大量正电荷，在负载基因的同时可以负载其他类型的带负电的小分子，比如负载二氢卟吩E6实现与光动力疗法结合，增强肿瘤细胞乏氧，可以进一步提高聚合物降解，通过响应型的聚合物实现化学治疗和光动力治疗的协同治疗
效果，增强对肿瘤的联合杀伤能力。
附图说明
[0064] 图1为4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇的1H NMR核磁图
[0065] 图2为丙烯酸4‑((4‑硝基苄基)氧基)苄基酯的1H NMR核磁图
[0066] 图3为乏氧响应基因载体聚合物A的1H NMR核磁图
[0067] 图4为HPLC检测乏氧响应基因载体聚合物A在硝基还原酶下不同反应时间的响应产物检测图
[0068] 图5为TOF‑MS检测乏氧响应基因载体聚合物A在硝基还原酶下响应产物检测图
[0069] 图6为乏氧响应基因载体聚合物A在硝基还原酶的作用下发生电荷翻转的粒径图
[0070] 图7为乏氧响应基因载体聚合物A与siRNA的复合物在硝基还原酶的条件下siRNA释放的凝胶电泳图
[0071] 图8为乏氧响应基因载体聚合物A、其对照物、PEI25K的细胞毒性对比图，图A为乏氧情况下，图B为常氧情况下。
[0072] 图9为乏氧响应基因载体聚合物A(HRP)负载siRNA对4T1细胞luciferase基因沉默效果对比图，左图A为乏氧情况下，右图B为常氧情况下。
[0073] 术语定义与说明
[0074] 术语“卤素”指F、Cl、Br和I。换言之，F、Cl、Br和I在本说明书中可描述为“卤素”。
[0075] 术语“C1‑40烷基”应理解为优选表示具有1～40个碳原子的直连或支链饱和一价烃基，优选为C1‑10烷基和C1‑6烷基。“C1‑10烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直连或支链饱和一价烃基。“C1‑6烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2‑甲基丁基、1‑甲基丁基、1‑乙基丙基、1,2‑二甲基丙基、新戊基、1,1‑二甲基丙基、4‑甲基戊基、3‑甲基戊基、2‑甲基戊基、1‑甲基戊基、2‑乙基丁基、1‑乙基丁基、3,3‑二甲基丁基、2,2‑二甲基丁基、1,1‑二甲基丁基、2,3‑二甲基丁基、1,3‑二甲基丁基或1,2‑二甲基丁基等或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3、4、5或
6个碳原子(即，C1‑6烷基)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子(即，C1‑3烷基)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
[0076] 术语“C1‑40烷氧基”指基团‑OR，其中R为取代或未取代的C1‑40烷基，其中“C1‑40烷基”具有上文给出的定义。类似地，术语“C1‑10烷氧基”指基团‑OC1‑10烷基，“C1‑6烷氧基”指基团‑OC1‑6烷基，“C1‑3烷氧基”指基团‑OC1‑3烷基，其中“C1‑10烷基”、“C1‑6烷基”和“C1‑3烷基”具有上文给出的定义。具体的所述烷氧基包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基和1,2‑二甲基丁氧基。
[0077] 术语“C3‑20环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，可以是螺环或桥环，其具有3～20个碳原子，优选“C3‑10环烷基”。例如，术语“C3‑10环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，可以是螺环或桥环，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述C3‑10环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。例如，术语“C3‑6环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，可以是螺环或桥环，其具有3、4、5或6个碳原子。所述C3‑6环烷基可以是，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、双环[1.1.0]丁基、螺戊基、螺[2.3]己基、双环[1.1.1]戊基、双环[2.1.0]戊基、双环[2.1.1]己基或双环[3.1.0]己基。
[0078] 术语“C6‑20芳基”应理解为优选表示具有6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C6‑14芳基”。术语“C6‑14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环
(“C6‑14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。
[0079] 术语“5‑20元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5～20个环原子且包含1‑5个独立选自N、O和S的杂原子，例如“5‑14元杂芳基”。术语“5‑14元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子，特别是5或6或9或10个碳原子，且其包含1‑5个，优选1‑3各独立选自N、O和S的杂原子并且，另外在每一种情况下可为苯并稠合的。术语“5‑6元杂芳基”应理解为具有5或6个环原子的一价单环芳族环系，其包含1‑3各独立选自N、O和S的杂原子，并且其在每一种情况下可为苯并稠合的。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻‑4H‑吡唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基等。
[0080] 除非另有说明，杂芳基或亚杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，吡啶基或亚吡啶基包括吡啶‑2‑基、亚吡啶‑2‑基、吡啶‑3‑基、亚吡啶‑3‑基、吡啶‑4‑基和亚吡啶‑4‑基；噻吩基或亚噻吩基包括噻吩‑2‑基、亚噻吩‑2‑基、噻吩‑3‑基和亚噻吩‑3‑基。
具体实施方式
[0081] 下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。
凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0082] 除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
[0083] 实施例1：化合物4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基)甲醇的制备
[0084]
[0085] 准备100mL带支口的圆底烧瓶，加入对羟基苯甲醇固体3.0g(0.024mol),无水碳酸钾5.52g(0.04mol)，加入30mL N，N‑二甲基甲酰胺，搅拌使其对羟基苯甲醇溶解。通入氩气，使其在氩气下搅拌10分钟。将对硝基苄溴溶于20mL N，N‑二甲基甲酰胺中,在氩气吹扫下通过常压滴加漏斗将溶液逐滴加入到圆底烧瓶中。滴加完成后溶液为淡黄色，反应过夜溶液
呈现墨绿色。反应24小时后，过滤除去固体不溶物，依次使用饱和氯化钠水溶液、乙酸乙酯洗涤反应液，最后收集的有机相使用无水硫酸镁除去水过滤后，旋转蒸发溶剂即得黄色固
1
体产物。HNMR(CDCl3,ppm):8.24(d,2H),7.60(d,2H),7.28(d,2H,d),6.96(d,2H),5.18(d,
2H),4.64(d,2H)，所得产物的核磁共振氢谱图如图1所示。
[0086] 实施例2：丙烯酸4‑((4‑硝基苄基)氧基)苄基酯的制备
[0087]
[0088] 首先称取2.6g(0.01mol)实施例1制备的4‑((4‑硝基苄基氧基)苯基甲醇溶于30mL二氯甲烷后加入100mL的圆底烧瓶中，加入1mL(1.1mol)三乙胺作为缚酸剂，将反应液置于
冰浴下搅拌10min使得反应液温度降为较低的温度，在冰浴条件下缓慢滴加入0.83mL丙烯
酰氯(0.012mol)，反应过夜后用饱和NaCl水溶液洗涤三次，收集有机相，通过无水硫酸镁除水，过滤除去固体后旋转蒸发溶剂，通过乙酸乙酯：正己烷体积比1:4柱层析分离产物，第一
1
个点即为产物点。HNMR(CDCl3ppm):8.27(m,2H),7.62(m,2H),7.38(m,2H),6.99(m,2H),
6.41(d,2H),6.18(m,2H),5.85(d,2H),5.21(m,4H)，所得产物的核磁共振氢谱图如图2所
示。
[0089] 实施例3：乏氧响应基因载体聚合物A的制备
[0090]
[0091] 精确称取0.1g分子量为10K的支状聚乙烯亚胺(0.01mM，大约含有2.3mM的NH可进行后续反应)于5mL的圆底烧瓶中，加入1mL无水N，N‑二甲基甲酰胺搅拌至聚乙烯亚胺完全溶解，待溶解充分后(无明显粘稠液体)加入1g(3.4mM)实施例2制备的丙烯酸4‑((4‑硝基苄基)氧基)苄基酯，室温下搅拌反应48小时后转移至45℃水浴锅中反应24小时。取碘甲烷
0.44mL(7mM)加入反应体系中，避光反应过夜。反应完成后，用乙醚沉淀三次，去除未反应的碘甲烷。之后用二氯甲烷沉淀三次，去除未反应的单体，将沉淀后的固体置于真空烘箱中除
1
去残留的溶剂。溶剂去除完成后得到黄色粉末固体，常温干燥保存。HNMR(氘代DMSO，ppm):
8.27,7.62,7.38,6.99,单体苯环出峰位置都出现聚合峰型，同时6.41(d,2H,a),6.18(m,
2H,a),5.85(d,2H,b)的单体峰在核磁图上面消失，说明已经成功合成出聚合物，通过核磁
算出其重均分子量为Mw＝25000，接枝率为18％，并且已经将未反应的单体清除干净，所得产物的核磁共振氢谱如图3所示。
[0092] 实施例4：HPLC检测乏氧响应基因载体聚合物A在硝基还原酶下的响应产物
[0093] 将乏氧响应基因载体聚合物A(HRP)溶于二甲基亚砜中，配置为50mg/mL的溶液，取0.05mL加入0.95mL二甲基亚砜，再到加入9mL Tris‑HCl缓冲液中，随后加入NADH使之浓度为100mM，加入20μg硝基还原酶(NTR)，使其浓度为2μg/mL。在相应的反应时间点，离心吸取上清液，加入二氯甲烷萃取水溶液，收集有机层，旋蒸除尽溶液，再用色谱级甲醇溶解。将所获得的溶液过0.45μm的尼龙66膜，再取10μL滤液进行分析。以甲醇/0.1％磷酸缓冲液作为流动相，流速为0.8mL/min，对比对羟基苯甲醇标准位置出峰，定性分析其释放产物。由图4中的HPLC流出曲线可以看出，随着时间的增加对羟基苯甲醇的峰逐渐出现，并且随着时间
增加出峰面积在增加，而聚合物出峰面积逐渐减少，通过计算可以得到反应4小时后70％的聚合物发生水解(如图4)。实验证明了水解产物有对羟基苯甲醇生成，符合我们对该聚合物结构硝基还原酶响应的猜想。
[0094] 实施例5：TOF‑MS检测乏氧响应基因载体聚合物A在硝基还原酶下响应产物
[0095] 将乏氧响应基因载体聚合物A溶于二甲基亚砜中，配置为50mg/mL的溶液，取0.05mL加入0.95mL DMSO，再加入9mL Tris‑HCl缓冲液中。加入NADH使之浓度为100mM，加入
10μg硝基还原酶，使其浓度为1μg/mL。反应6h后将溶液离心，将所获得的上清液用二氯甲烷萃取。萃取后收集有机溶剂旋蒸除去溶剂，用色谱纯的甲醇溶解后进行TOF‑MS测定。从图5中可以看出萃取液在124的位置出峰，正好为对羟基苯甲醇的分子离子峰，即可在质谱层面说明还原产物即为对羟基苯甲醇，验证反应机理即为先将硝基还原为氨基，然后对羟基苄
醚掉落，再发生电子重排，导致对羟基甲醇掉落。
[0096] 实施例6：乏氧响应基因载体聚合物A在硝基还原酶的作用下发生电荷翻转
[0097] 将乏氧响应基因载体聚合物A溶于二甲基亚砜中，配置为50mg/mL的溶液，取0.05mL加入0.95mL二甲基亚砜，再加入到9mL Tris‑HCl缓冲液中，加完后测定该溶液的粒径和电位。之后加入NADH使之浓度为100mM，加入10μg硝基还原酶，使其最终浓度1μg/mL。加入五分钟后将溶液离心，将所获得的上清液再次测定粒径和电位。将聚合物与NTR以及NADH反应之后，置于粒度仪中测试粒径以及zeta电位，从图6中可以看出聚合物在加入硝基还原酶之前粒径(图6A)为75.4nm，zeta电位为27.02mV。当加入硝基还原酶反应之后(图6B)，电荷变为‑19.03mV，并且粒径变成303.07nm，证明纳米粒子发生了电荷反转并且解体。
[0098] 实施例7：凝胶阻滞电泳验证乏氧响应基因载体聚合物A与siRNA的复合物在硝基还原酶的条件下siRNA的释放
[0099] 精确称取乏氧响应基因载体聚合物A 20mg溶于二甲基亚砜中，形成20mg/mL的溶液。用浓度为10mM，pH 7.4的Hepes缓冲液进行稀释到2mg/mL。然后再将2mg/mL的母液稀释为0.6μg/μL、0.8μg/μL、1μg/μL、1.2μg/μL、1.40μg/μL、1.60μg/μL溶液备用。将购买的1OD siRNA(≈33μg)用330μL DEPC水溶解后备用，将各浓度的聚合物溶液按照体积比1:1与
siRNA溶液10μL等体积混合涡旋震荡20s后静置二十分钟使得聚合物与siRNA进行静电吸
附，从而能够得到不同质量比(聚合物：siRNA为6、8、10、12、14、16)的纳米复合物。
[0100] 向不同质量比(聚合物：siRNA为6、8、10、12、14、16)的纳米复合物中加入硝基还原酶/NADH使得最终浓度为硝基还原酶为1μg/mL，NADH为100mM。反应30分钟后，取样品于琼脂糖凝胶上分别点样后调节电压为100V进行电泳，以纯的siRNA样品作为对照，待样品条带离开胶板到第二道时，关闭电源，将凝胶放入凝胶成像仪中在紫外灯下进行检测。当聚合物与siRNA紧密结合的时候便无法在凝胶成像系统中观察到基因条带，若再游离出来便可观察到。将样品加入硝基还原酶/NADH 30分钟之后，分别取样进行琼脂糖凝胶电泳。由图7中A图中可以看出孵育30分钟之后各个质量比均出现条带，即说明能够将负载的siRNA释放出来。
而无法在硝基还原酶下水解的对照物PEI‑BA(图7B)，加酶后并不能置换出siRNA条带。
[0101]
[0102] 实施例8：使用MTT测试乏氧响应基因载体聚合物A的细胞毒性并且与其对照物(PEI‑BA)、PEI25K)进行比较
[0103] 将4T1细胞培养至对数生长期，以5×103细胞/孔加入96孔板，放入37℃细胞培养箱(边缘36孔加入100μL PBS缓冲液以防止边缘效应)。待细胞贴壁生长后，吸除培养基，将药物(HRP、PEI‑BA、PEI25K)分别用培养基稀释后按照不同浓度加入孔中，每孔100μL，共设置7个浓度梯度(分别为125μg/mL,62.5μg/mL,31.25μg/mL,15.6μg/mL,7.8μg/mL,3.9μg/mL)每个样品设6个复孔，并设6个阴性对照孔(细胞自然生长组)和3个调零组(100μL含MTT
培养基+100μLFormazan)。
[0104] 细胞分为两组分别在含氧条件(37℃、5％CO2)和乏氧条件(37℃、5％CO2、1％O2)条件下继续培养24h后，去除培养基，每孔加入100μL培养基和MTT溶液(MTT的含量为1％)，继续将96孔板在培养箱内孵育4小时后，加入预热好的Formazan。4小时后用酶标仪测试在570nm处的吸光度，计算不同药物浓度下细胞存活率，计算方法为：细胞存活率＝(Ax‑Ab)/(Ac‑Ab)×100％。其中Ax为各样品的吸光度值，Ab为凋零组吸光度值，Ac为阴性对照组吸光度值。
[0105] 进行MTT测定后，由图8中可以看出，在乏氧条件下HRP以及PEI‑BA的毒性都较常氧下小，是因为乏氧条件下，细胞摄入药物量减少，从而使得毒性降低。在乏氧下条件下，尽管HRP以及PEI‑BA浓度已经达到125μg/mL也对细胞产生很低的毒性，而在常氧下也还有近80％的细胞存活，而我们的用量远远低于这个浓度。与此同时，PEI25K在常氧和乏氧下都具有极高的毒性，所以相较与PEI25K，HRP的安全性更好。
[0106] 实施例9：乏氧响应基因载体聚合物A(HRP)负载siRNA对4T1细胞luciferase的基因沉默
[0107] 将稳定表达luciferase的4T1细胞以5000细胞/孔接种至不透光的96孔板中，常氧组在常氧恒温培养箱中培养24小时。乏氧组在常氧常氧恒温培养箱中培养18小时后，在三
气(1％O2、5％CO2、94％N2)培养箱培养6小时。分别将free‑GL3siRNA、HRP、HRP负载的
scrambled siRNA(HRP/scrambled)、HRP负载的GL3siRNA(HRP/GL3siRNA)纳米复合物按照
实施例7的方法制备，以siRNA浓度为2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0μg/mL加入到
96孔板中，在无血清的培养基中孵育4小时后，小心吸走培养基，加入有血清培养基。常氧组置于恒温培养箱中培养，乏氧组置于三气(1％O2、5％CO2、94％N2)培养箱中培养24小时后，用PBS缓冲液清洗两次，向每孔中加入100μL，浓度为150μg/mL D‑luciferin，加完置于培养箱避光培养20分钟后，使用多功能酶标仪检测生物发光。能够表达luciferase基因的4T1细胞，会在体内表达荧光素酶基因，可以催化luciferin发出生物荧光，基因沉默效率和发光强度呈相关性。由于聚合物本身具有毒性，所以将HRP组作为毒性对照组，从图9中可以看出不管是在乏氧还是常氧条件下，free‑GL3siRNA没有明显的沉默效率。对照组的荧光降低更多是体现在其聚合物的毒性上，而HRP/GL3siRNA在siRNA为1μg/mL时沉默效率最佳，同时观察到乏氧条件下的沉默效果要优于常氧组，说明在乏氧的条件下，该纳米粒子能够更好地
释放基因，提高疗效。
[0108] 以上使用的siRNA的序列如下所示
[0109] Scrambled siRNA
[0110] 上游引物(核苷酸序列SEQ ID NO:1)5’–CAGUCAGGAGGAUCCAAAGdTdT3’；
[0111] 下游引物(核苷酸序列SEQ ID NO:2)5’‑CUUUGGAUCCUCCUGACUGdTdT‑3’；
[0112] GL3siRNA
[0113] 上游引物(核苷酸序列SEQ ID NO:3)5’–CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT‑3’；
[0114] 下游引物(核苷酸序列SEQ ID NO:4)5’‑UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT‑3’。
[0115] 其中，所述引物的末端，dTdT为两个悬挂碱基。
[0116] 以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
