原子精度的团簇酶和制备及其在神经系统疾病中的应用

摘要

本发明公开了一种原子精度的团簇酶和制备及其在神经系统疾病中的应用，团簇酶由以下方法制得：配制HAuCl4水为溶液一；3‑巯基丙酸水溶液为溶液二；将溶液一加入到溶液二中搅拌，得到无色透明的混合液；向反应体系中继续加入NaOH水溶液和NaBH4溶液；在室温下密封避光反应，得到棕色溶液，停止反应，将反应液陈化，得到最终的团簇酶。本发明研究发现具有原子精度的团簇酶具有超高的抗氧化活性以及类酶选择性，用于小鼠神经系统疾病的早期干预，能显著促进伤口愈合、体重恢复以及有效提高后期的行为学特征。为神经系统疾病药物的研制和开发提供了重要参考和依据。

权利要求

1.一种原子精度团簇酶，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：(1)配置浓度范围为15‑30mM的HAuCl4水溶液，得到溶液一；

(2)配置浓度范围为15‑20mM的3‑巯基丙酸(MPA)水溶液，得到溶液二；

(3)配置浓度范围为0.9‑1.2mM的NaOH水溶液，得到溶液三；

(4)用0.2M的NaOH水溶液配置浓度范围为15‑25mM的水溶液，得到溶液四；

(5)分别配置15‑25mM的Cu(NO3)2和Cd(NO3)2水溶液，分别得到溶液五和溶液六；

(6)在室温下将上述溶液一和溶液二依次加入到2.35‑2.4mL去离子水中，搅拌5‑7min，然后加入0.3mL溶液三和0.1mL溶液四，密封，避光反应3‑3.5h，得到棕色溶液，停止反应；

(7)将反应液置于4℃下陈化10‑12h，用3K和10K的超滤管在3500‑4000rpm/min下超滤纯化，冷冻干燥,得到MPA配体的不同金属原子掺杂的Au24M1团簇，其中M为Cu或Cd。

2.根据权利要求1所述原子精度团簇酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)配置浓度范围为15‑30mM的HAuCl4水溶液，得到溶液一；

(2)配置浓度范围为15‑20mM的3‑巯基丙酸(MPA)水溶液，得到溶液二；

(3)配置浓度范围为0.9‑1.2mM的NaOH水溶液，得到溶液三；

(4)用0.2M的NaOH水溶液配置浓度范围为15‑25mM的水溶液，得到溶液四；

(5)分别配置15‑25mM的Cu(NO3)2和Cd(NO3)2水溶液，分别得到溶液五和溶液六；

(6)在室温下将上述溶液一和溶液二依次加入到2.35‑2.4mL去离子水中，搅拌5‑7min，然后加入0.3mL溶液三和0.1mL溶液四，密封，避光反应3‑3.5h，得到棕色溶液，停止反应；

(7)将反应液置于4℃下陈化10‑12h，用3K和10K的超滤管在3500‑4000rpm/min下超滤纯化，冷冻干燥,得到MPA配体的不同金属原子掺杂的Au24M1团簇，其中M为Cu或Cd。

3.权利要求1所述原子精度团簇酶在制备预防和治疗神经系统疾病药物中的应用,其特征在于，所述应用是指在修复脑损伤导致体重下降中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，是指在修复脑损伤头皮中的应用。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，是指在修复脑损伤空间学习和记忆能力中的应用。

说明书

原子精度的团簇酶和制备及其在神经系统疾病中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，涉及一种人工酶，具体涉及一种原子精度团簇酶和制备方法及其在神经系统疾病早期干预中的应用。

背景技术

[0002] 神经系统疾病是指影响神经系统的一小类医学病症。该类别包括600多种不同的疾病，包括遗传疾病、感染、癌症、癫痫症、心血管疾病(如中风)、先天性和发育障碍(如脊柱裂)和退行性疾病(如多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症)。其症状可能涉及其他器官系统并导致运动功能障碍、感觉障碍、疼痛等。据全球疾病负担报告，神经系统疾病是全球致死及致残的主要原因之一。随着人口增长和老年化，致残性神经系统疾病的现患率将随着年龄的增长而逐渐增加，其所带来的疾病负担也随之增加。目前多种神经系统疾病仍缺乏有效性治疗措施，因此有效的疾病预防和新的治疗策略将是应对神经系统疾病的主要方向。

[0003] 天然酶因高的催化活性和精准的专一性特点在生物催化、疾病的诊疗中具有广泛应用，但价格昂贵、制备困难及不稳定等缺点限制了其进一步使用。随着材料科学的不断发展，具备类似天然酶催化活性的人工酶因高稳定性、低成本成为了天然酶的更好替代品，并已经广泛应用于生物传感，免疫测定，癌症诊疗，神经保护及干细胞增殖等领域。纳米酶作为一种新型的有前途的人工酶，既具备生物酶特性，又具备纳米材料独特的物化性能。更重要的是，研究者们可以利用成熟的纳米技术对纳米酶进行改善和创新。但是目前开发的纳米酶普遍存在催化活性和选择性远不如天然酶的问题。近些年开发出的单原子纳米酶虽然克服了催化活性的问题，但是催化选择性依然较差。并且现有纳米酶的结构依然是不确定的，并不利于人们在原子水平上实现结构的精准调控。Au25纳米团簇因其较高的稳定性、良好的生物相容性以及原子精确可控的特点，在医学成像、疾病治疗等领域被广泛应用。通过对国内外文献和专利的调研，目前尚未发现有关Au纳米团簇在人工酶方面的研究报道，特别是对原子精度Au纳米团簇进行结构调控以开发性能优异的人工酶的研究尚属空白，更缺乏将其应用于神经系统疾病方面的相关报道。

发明内容

[0004] 为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种原子精度的团簇酶和制备及其在神经系统疾病中的应用，解决现有技术中多种神经系统疾病仍缺乏有效性治疗措施的问题。

[0005] 为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 一种原子精度团簇酶，由以下方法制得：配制HAuCl4水溶液为溶液一；3‑巯基丙酸水溶液为溶液二；将溶液一加入到溶液二中搅拌，得到无色透明的混合液；向反应体系中继续加入NaOH水溶液和NaBH4溶液；在室温下密封避光反应，得到棕色溶液，停止反应，将反应液陈化，得到最终的团簇酶。

[0007] 所述原子精度团簇酶，为不同金属原子掺杂的团簇酶，制备时HAuCl4中被包含了3‑5％摩尔浓度的Cu(NO3)2或Cd(NO3)2。

[0008] 所述原子精度团簇酶的制备方法，配制HAuCl4水为溶液一；3‑巯基丙酸水溶液为溶液二；将溶液一加入到溶液二中搅拌，得到无色透明的混合液；向反应体系中继续加入NaOH水溶液和NaBH4溶液；在室温下密封避光反应，得到棕色溶液，停止反应，将反应液陈化，得到最终的团簇酶。

[0009] 具体包括如下步骤：

[0010] (1)配置浓度范围为15‑25mM的HAuCl4水溶液，得到溶液一；

[0011] (2)配置浓度范围为15‑25mM的3‑巯基丙酸(MPA)水溶液，得到溶液二；

[0012] (3)配置浓度范围为0.9‑1.2mM的NaOH水溶液，得到溶液三；

[0013] (4)用0.2M的NaOH水溶液配置浓度范围为15‑25mM的水溶液，得到溶液四；

[0014] (5)在室温下将上述溶液一和溶液二依次加入到2.35‑2.4mL去离子水中，搅拌5‑7min，然后加入0.3mL溶液三和0.1mL溶液四，密封，避光反应3‑3.5h，得到棕色溶液，停止反应；

[0015] (6)将反应液置于4℃下陈化10‑12h，用3K和10K的超滤管在3500‑4000rpm/min下超滤纯化，冷冻干燥,得到MPA配体的Au25团簇。

[0016] 不同金属原子掺杂的原子精度团簇酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

[0017] (1)配置浓度范围为15‑30mM的HAuCl4水溶液，得到溶液一；

[0018] (2)配置浓度范围为15‑20mM的3‑巯基丙酸(MPA)水溶液，得到溶液二；(3)配置浓度范围为0.9‑1.2mM的NaOH水溶液，得到溶液三；

[0019] (4)用0.2M的NaOH水溶液配置浓度范围为15‑25mM的水溶液，得到溶液四；

[0020] (5)分别配置15‑25mM的Cu(NO3)2和Cd(NO3)2水溶液，分别得到溶液五和溶液六；

[0021] (6)在室温下将上述溶液一和溶液二依次加入到2.35‑2.4mL去离子水中，搅拌5‑7min，然后加入0.3mL溶液三和0.1mL溶液四，密封，避光反应3‑3.5h，得到棕色溶液，停止反应；

[0022] (7)将反应液置于4℃下陈化10‑12h，用3K和10K的超滤管在3500‑4000rpm/min下超滤纯化，冷冻干燥,得到MPA配体的不同金属原子掺杂的Au24M1团簇，其中M为Cu或Cd。

[0023] 原子精度团簇酶在制备预防和治疗神经系统疾病药物中的应用。

[0024] 所述应用为利用其高效的抗氧化活性和类酶选择性特征，有效缓解由于脑损伤而导致的体重下降。

[0025] 所述应用为利用高抗氧化活性和类酶选择性的特点，加速头皮伤口愈合。

[0026] 所述应用为利用其高效的抗氧化活性和类酶选择性特点，修复空间学习和记忆能力。

[0027] 本发明的有益效果为：本发明研究发现具有原子精度的团簇酶具有超高的抗氧化活性以及类酶选择性，用于小鼠神经系统疾病的早期干预，能显著促进伤口愈合、体重恢复以及有效提高后期的行为学特征。为神经系统疾病药物的研制和开发提供了重要参考和依据。

附图说明

[0028] 图1为团簇酶的结构示意图，具有独特的空间笼状结构，在Au25结构的低聚物基序位点替换了单原子Cu和单原子Cd；

[0029] 图2为团簇酶的结构表征：图2a为Cu和Cd原子取代前后Au25团簇酶(黑色曲线)的ESI‑MS；图2b‑c为Cu元素K边和Cd元素L3边的FT‑EXAFS光谱及其在R空间的拟合结果；

[0030] 图3为团簇酶的催化性能：图3a.为各种团簇酶与天然抗氧化剂的总抗氧化能力比较；图3b位各种团簇酶模拟GPx、CAT、SOD活性以及对自由基清除能力的比较；

[0031] 图4为团簇酶干预TBI小鼠前后体重的变化；

[0032] 图5为团簇酶干预TBI小鼠前后头部伤口的愈合效果——各组小鼠的时间依赖的组织愈合代表性图片；

[0033] 图6是团簇酶干预TBI小鼠的前后各组小鼠的Morris水迷宫测试结果(每组n＝7)；图6a为第13～17天和27～31天小鼠到达隐藏平台的距离；图6b为第13～17天和27～31天小鼠到达隐藏平台的时间；图6c为第18天和第32天小鼠在平台I象限所花费的时间百分比；图
6d为第18天和第32天小鼠经过平台位置的时间。

具体实施方式

[0034] 下面结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述。

[0035] 下述实施例中所涉及的原料或试剂若无特别说明，均可通过市售途径购买。所有C57BL/6小鼠均购自于北京斯贝福科技有限公司。

[0036] 实施例1

[0037] 本实施例制备一种原子精度的团簇酶。其制备方法包括如下步骤：

[0038] (1)按比例，将1.7mg HAuCl4·3H2O溶于0.25mL去离子水，得到溶液一；将1.06mg MPA溶于2mL去离子水，得到溶液二；将16mg氢氧化钠溶于0.4mL去离子水，得到溶液三；将0.1mL溶液三加0.4mL去离子水稀释，再加2.15mg硼氢化钠混匀，得到溶液四；在室温下，将上述溶液一和溶液二依次加入到2.35mL水中，搅拌5min，然后加入0.3mL溶液三和0.1mL溶液四，密封，避光反应3h，得到棕色溶液，停止反应，将反应液置于4℃下陈化12h，用3K和10K的超滤管在3500rpm/min下超滤纯化，冷冻干燥,得到MPA配体的Au25团簇酶。

[0039] (2)按比例，将1.7mg HAuCl4·3H2O溶于0.25mL去离子水，得到溶液一；将1.06mg MPA溶于2mL去离子水，得到溶液二；将16mg氢氧化钠溶于0.4mL去离子水，得到溶液三；将0.1mL溶液三加0.4mL去离子水稀释，再加2.15mg硼氢化钠混匀，得到溶液四；分别配置20mM的Cu(NO3)2及Cd(NO3)2金属离子，得到溶液五和溶液六；在室温下，将上述0.23mL溶液一，
0.02mL溶液五或溶液六，及溶液二依次加入到2.35mL水中，搅拌5min，然后加入0.3mL溶液三和0.1mL溶液四，密封，避光反应3h，得到棕色溶液，停止反应，将反应液置于4℃下陈化
12h，用3K和10K的超滤管在3500rpm/min下超滤纯化，冷冻干燥,得到MPA配体的不同金属原子掺杂的Au24M1团簇酶。

[0040] 实验例1

[0041] 将制备得到的团簇酶进行如下表征测试：

[0042] (1)Au25MPA18团簇酶(实施例1制备)的晶体结构，如图1所示，可知：Au25MPA18团簇的结构由25个Au原子和18个MPA配体共同组成，具有独特的笼状结构，其中不同原子掺杂的团簇酶是仅将Au25结构中的低聚物基序位点中的一个Au原子替换成Cu或Cd原子。

[0043] (2)团簇酶(实施例1制备)的ESI‑MS质谱表征，结果如图2a所示，由图可知：3‑
Au25MPA18在m/z≈2271处有最高的分子离子峰，可归属为[Au25MPA18‑3H] 。掺杂原子后最高丰度的分子离子峰的质荷比减小，其中Cu原子掺杂后的团簇在m/z≈2226.6处有最高的分
3‑
子离子峰，对应于[Au24Cu1MPA18‑3H] ；Cd原子掺杂后的团簇在m/z≈2243处有最高的分子
3‑
离子峰，对应于[Au24Cd1MPA18‑3H] 。另外，所有团簇酶除了与之分子量相对应的最高丰度的分子离子峰外，没有其他明显的峰，表明具有较高纯度。团簇酶分别为：Au25MPA18，Au24Cu1MPA18和Au24Cd1MPA18。

[0044] (3)团簇酶(实施例1制备)的FT‑EXAFS光谱表征，结果如图2b‑c所示，由图可知：Cu元素K边的光谱结果和拟合结果显示Cu‑S键的配位数约为 Cd元素L3边的光谱结果和拟合结果显示Cd‑S键的配位数约为 表明Cu原子或Cd原子取代发生在Au25结构的低聚物位点。结合ESI‑MS结果可以判断，团簇酶的结构为单原子Cu和Cd掺杂的Au24Cu1和Au24Cd1，并且Cu和Cd原子的掺杂位点为Au25结构的低聚物位点。

[0045] 实验例2

[0046] 将团簇酶(实施例1制备)进行催化活性测试：

[0047] (1)总抗氧化性能测试：根据ABTS快速法试剂盒说明书中的具体测试方法测定团簇酶的总抗氧化性能力，并和天然抗氧化剂Trolox、花青素的总抗氧化性能力进行比较，如图3a所示。Cu原子和Cd原子取代后的Au24Cu1和Au24Cd1具有超强的抗氧化能力，相比于Au25提高了41倍和48倍，分别是天然抗氧化剂Trolox的137倍和160倍，是花青素的7.5倍和9倍。

[0048] 实验证明，实施例1、2制备的团簇酶具有超越天然抗氧化剂的超高的抗氧化活性。

[0049] (2)类酶活性测定：

[0050] 类CAT酶活性可以利用H2O2在240nm处特有的光学吸收峰，在200μL含有H2O2(53μM)的PBS溶液中加入10ng/μL的团簇酶，然后测定240nm处的吸光度值的变化；二是将LDO101探头的溶解氧仪插入5mL的PBS溶液中并持续通入Ar气使溶液中O2的溶解度降至0.6mg/L以下，再分别加入H2O2和20ng/μL的团簇酶(Au25、Au24Cu1和Au24Cd1)，立即监测溶液中O2溶解度的变化并记录数值。结果如图3b所示，Au24Cu1的类CAT酶活性最好，其次是Au24Cd1，Au25的类CAT酶活性相对较低。

[0051] 类GPx酶活性测试根据文献报道过的方法，在200μL含有H2O2(200μM)的PBS溶液中加入10ng/μL的团簇酶，然后测定340nm处的吸光度变化。结果如图3b所示，Au25的类GPx酶活性最高，然后依次是Au24Cu1和Au24Cd1，所有团簇酶的清除率都超过50％。

[0052] 类SOD酶活性测试是根据SOD活性测定试剂盒中的具体测试方法进行，加入10ng/μL的团簇酶，后测定560nm处的吸光度变化。结果如图3b所示，Au24Cd1的类SOD酶活性最高，Au24Cu1居中，Au25的类SOD酶活性相对较低。

[0053] (3)ROS清除测试：

[0054] ·OH清除测试，以BMPO作为·OH捕获剂，用365nm的紫外激光照射200μL含有H2O2(5mM)的PBS溶液，持续5min，再加入2.7ng/μL的团簇酶，然后测定加入前后ESR光谱的变化来评估团簇酶对·OH的清除能力。结果如图3b所示，Au24Cu1和Au24Cd1对·OH的清除率都超50％，其中Au24Cu1的清除效率接近90％，与类CAT结果相一致。

[0055] O2·‑清除测试，以KO2作为O2·‑的产生源、DEPMPO作为自旋捕获剂，通过测定加入·‑ ·‑2.7ng/μL团簇酶前后O2 在ESR光谱上信号强度的变化来评估其对O2 的清除能力。结果如·‑
图3b所示，Au24Cd1对O2 具有优异的清除能力，清除效率超过80％，与类SOD结果相一致。

[0056] 实验证明，实施例1制备的团簇酶具有类酶活性选择性，其中Au25的类GPx酶活性最·‑高、Au24Cu1的类CAT酶活性和·OH清除效率最高，Au24Cd1的类SOD酶活性和O2 清除效率最高。

[0057] 实验例3

[0058] 本实施例评价实施例1制得的团簇酶对小鼠神经系统疾病早期干预的功效。

[0059] 动物水平试验：

[0060] 小鼠创伤性脑损伤模型(TBI)的构建方法：以7‑9周龄(雄性)C57BL/6J小鼠为脑损伤动物模型进行试验，分组如下：(1)假手术组；(2)TBI对照组；(3)Au25治疗组(实施例1制备)；(4)Au24Cu1治疗组(实施例1制备)；(5)Au24Cd1治疗组(实施例1制备)；每组49只。第一步用水合氯醛(10％，10mg/kg)麻醉小鼠，小鼠进入深度麻醉后将其头皮切开，然后对小鼠进行CCI损伤：在小鼠顶颞皮质右侧方钻一个直径为2mm的病灶，然后利用电磁CCI损伤设备(20°垂直角，速度5m/s，深度0.61mm，持续时间150ms)打击小鼠头部。打击完后对小鼠头皮进行缝合，将其放在电热毯直至苏醒。对于假手术组，不需要进行CCI损伤，只需缝合小鼠头皮，待小鼠苏醒后通过尾静脉注射200μL PBS(0.01M)溶液；对于TBI组，小鼠苏醒后通过尾静脉注射200μL PBS(0.01M)溶液；对于团簇酶治疗组，小鼠苏醒后通过尾静脉注射200μL 0.01M PBS溶解的剂量为50mg/kg的团簇酶溶液。将所有小鼠做好标记，在损伤后每天对小鼠进行称重；用异氟烷气体麻醉小鼠，拍摄小鼠伤口图片；在小鼠损伤后13～18天和28～32天进行Morris水迷宫实验。

[0061] 治疗结束后通过水迷宫试验评估小鼠的学习和空间记忆能力，具体方法如下：

[0062] 将一个圆形水池分为四个象限(Ⅰ、Ⅱ、III、IV)，平台放置在水池象限Ⅰ中，并融入两袋奶粉隐藏平台，保持水温在25℃±1℃。(1)定位航行试验：每天13：00‑18：00对小鼠进行训练，让小鼠面向水池壁，将小鼠放入水中，人为的将在60s内找不到平台的小鼠放置在平台上15s。训练5天后将小鼠面向水池壁放入水池中，记录小鼠找到隐藏平台需要的时间，以此来研究小鼠的空间学习能力。(2)空间探索试验，完成实验(1)后，撤去水中隐藏的平台，将小鼠面向水池壁放入水池中，记录下小鼠的游泳轨迹，记录小鼠在平台象限的时间百分比和穿越原来平台放置位置的次数，以此研究小鼠的空间记忆能力。

[0063] 体重结果如图4所示，由图可知：在试验前几天，所有小鼠的体重均降低。随着时间的推移，团簇酶治疗组的体重开始升高，并趋于平稳，但是TBI组的小鼠体重在后期一直降低，显著低于假手术组和团簇酶治疗组，且团簇酶治疗组小鼠的体重均高于假手术组。以上结果表明，团簇酶对于TBI小鼠的体重有恢复作用。

[0064] 伤口恢复结果如图5所示，由图可知：经过团簇酶治疗的小鼠在第六天伤口基本痊愈，而TBI组在第八天时还未完全恢复。以上结果表明，团簇酶可以加速TBI小鼠头皮伤口愈合。

[0065] 水迷宫试验结果如图6所示，由图可知：经过团簇酶治疗的小鼠相对于TBI组小鼠，其找到水池隐藏平台游过的距离和需要的时间明显减少；在试验第18天和第32天的结果表明，团簇酶治疗组小鼠比TBI组小鼠呆在平台象限的时间更长，通过隐藏平台所在位置的次数更多，尤其是经过Au24Cu1和Au24Cd1治疗的小鼠更接近于没有脑损伤的假手术组。以上结果表明，团簇酶可以显著增强TBI小鼠的空间学习和记忆能力，可以使TBI小鼠的行为学恢复到几乎正常水平。