一种榆黄蘑多糖及其应用

摘要

本发明公开了一种榆黄蘑多糖及其应用，涉及天然产物开发利用领域。所述榆黄蘑多糖包括木糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、果糖和阿拉伯糖。本发明还公开了上述榆黄蘑多糖在制备治疗癌症所致的肌肉减少症药物中的应用。本发明通过结肠癌恶病质小鼠肌肉衰减实验证实，榆黄蘑多糖可增加肌肉减少症小鼠的体重及脾重，恢复肌纤维形态、数量和密度，降低炎症反应及降低肌肉减少症标志性蛋白Atrogin‑1和MuRF‑1的表达，缓解肿瘤所致肌肉减少症状。本发明发现了榆黄蘑多糖的新作用，为榆黄蘑的开发利用以及治疗癌症所致的肌肉减少症提供了新的思路。

权利要求

1.榆黄蘑多糖在制备治疗癌症所致肌肉减少症药物中的应用，其特征在于，所述榆黄蘑多糖为木糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、果糖和阿拉伯糖；

所述木糖占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的50％以上；

所述葡萄糖占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的15％以上；

所述半乳糖占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的4％以上；

所述葡萄糖醛酸占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的1％以上；

所述岩藻糖、果糖、阿拉伯糖分别占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的3％以下；

所述癌症为结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌、淋巴癌或乳腺癌；

所述榆黄蘑多糖的提取方法为：

步骤1，将榆黄蘑的子实体与去离子水按质量比1:40放入破壁机中，于1200W功率条件下破壁提取8min，得到上清液；室温条件下，将上清液减压浓缩为原来的20％，之后用浓缩液4倍体积、体积分数80％的乙醇进行醇沉，得到榆黄蘑粗多糖溶液；

步骤2，向榆黄蘑粗多糖溶液中加入1/4体积的Sevage溶液，所述Sevage溶液是由三氯甲烷和正丁醇按体积比4：1的比例混合而成，用磁力搅拌器充分搅拌1h，静置分层后，收集上层多糖溶液，反复3次操作，直至上下层之间无变性蛋白质为止，挥发出有机试剂即得到榆黄蘑多糖。

说明书

一种榆黄蘑多糖及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及天然产物开发利用领域，特别是涉及一种榆黄蘑多糖及其应用。

背景技术

[0002] 肌肉减少症发生于50％‑80％的肿瘤患者的病程中，该症以炎症反应为主，牵涉到机体多个脏器的综合征，对机体有多方面的、毁灭性的、不可逆的影响，严重影响患者的生活质量，甚至导致死亡。2016年，肌肉减少症与广受关注的阿尔茨海默症、帕金森症等神经性疾病一同被世界卫生组织列为退行性疾病。但是，目前尚未有有效的抗肿瘤所致肌肉减少症的药物。

[0003] 榆黄蘑(Pleurotus citrinopileatus)又称金顶侧耳，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属，自然分布于北半球温带以北的区域，在我国东北三省、河北、湖南、四川以及西藏等地也都有分布。榆黄蘑子实体味道鲜美、营养丰富，味甘、性温，入脾、肺经，有滋补强壮，润肺生津，止痢等功效，并具有降血脂、抗氧化、提高机体免疫力等生物活性。但是对其缓解肿瘤所致肌肉减少症的生物活性、活性成分及其制备方法尚未有研究报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种榆黄蘑多糖及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，改善肿瘤所致的肌肉减少症。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明技术方案之一，一种榆黄蘑多糖，所述榆黄蘑多糖包括木糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、果糖和阿拉伯糖。

[0007] 进一步地，所述榆黄蘑多糖为β型呋喃糖。

[0008] 进一步地，所述木糖占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的50％以上。

[0009] 进一步地，所述葡萄糖占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的15％以上。

[0010] 进一步地，所述半乳糖占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的4％以上。

[0011] 进一步地，所述葡萄糖醛酸占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的1％以上。

[0012] 进一步地，所述岩藻糖、果糖、阿拉伯糖分别占所述榆黄蘑多糖摩尔百分数的3％以下。

[0013] 进一步地，所述榆黄蘑多糖中中性均一组分多糖的分子量为3.00×105～1.00×6 5 5
10Da，酸性均一组分多糖的分子量为1.20×10～3.50×10Da。

[0014] 本发明技术方案之二，上述的榆黄蘑多糖在制备治疗肌肉减少症药物中的应用。

[0015] 进一步地，所述肌肉减少症为癌症所致肌肉减少症。

[0016] 进一步地，所述癌症为结肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、大肠癌、食管癌、淋巴癌或乳腺癌。

[0017] 本发明技术方案之三，一种治疗肌肉减少症的药物，包括权利要求1‑6任一项所述的榆黄蘑多糖以及医学上可接受的辅料。

[0018] 本发明公开了以下技术效果：

[0019] 本发明通过结肠癌恶病质小鼠肌肉衰减实验证实，榆黄蘑多糖可增加肌肉减少症小鼠的体重及脾重，恢复肌纤维形态、数量和密度，降低炎症反应及降低肌肉减少症标志性蛋白Atrogin‑1和MuRF‑1的表达，缓解肿瘤所致肌肉减少症状。

[0020] 本发明发现了榆黄蘑多糖的新作用，为榆黄蘑的开发利用以及治疗癌症所致的肌肉减少症提供了新的思路。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022] 图1为实施例1制得的榆黄蘑多糖中的葡萄糖含量标准曲线；

[0023] 图2为实施例1制得的榆黄蘑多糖中蛋白质含量标准曲线；

[0024] 图3为标准葡聚糖分子量标准曲线；

[0025] 图4为实施例1制得的榆黄蘑多糖的高效凝胶渗透色谱图；

[0026] 图5为实施例1制得的榆黄蘑多糖单糖组成HPLC图；

[0027] 图6为实施例1制得的榆黄蘑多糖的红外光谱图；

[0028] 图7为试验例1中小鼠体重情况图；

[0029] 图8为试验例1中小鼠腓肠肌组织病理形态学的影响图；

[0030] 图9为试验例1中小鼠血清中IL‑6、TNF‑α含量图；

[0031] 图10为试验例1中Atrogin‑1和MuRF‑1的蛋白质印迹图；

[0032] 图11为试验例1中Atrogin‑1和MuRF‑1的mRNA表达量图；

[0033] 图12为实施例1制得的榆黄蘑多糖中的糖醛酸含量标准曲线。

具体实施方式

[0034] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0035] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0036] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0037] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0038] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0039] 本发明实施例中所述的室温如无特殊说明均指20‑25℃。

[0040] 实施例1

[0041] 步骤1，将榆黄蘑的子实体与去离子水按质量比1:40放入破壁机中，于1200W功率条件下破壁提取8min，得到上清液；室温条件下，将上清液减压浓缩为原来的20％，之后用浓缩液4倍体积、体积分数80％的乙醇进行醇沉，得到榆黄蘑粗多糖溶液；

[0042] 步骤2，向榆黄蘑粗多糖溶液中加入1/4体积的Sevage溶液(按体积比，三氯甲烷：正丁醇＝4：1)，用磁力搅拌器充分搅拌1h(Sevage溶液的作用是用来去除多糖溶液中的蛋白质)，静置分层后，收集上层多糖溶液，反复3次操作，直至上下层之间无变性蛋白质为止，挥发出有机试剂即得到榆黄蘑多糖。

[0043] 实施例2

[0044] 步骤1，将榆黄蘑的子实体与去离子水按质量比1:50放入烧杯中，90℃水浴40min后，得到上清液；离心分离，沉淀重复提取2次，将上清液合并，减压浓缩为原来的20％，之后用浓缩液4倍体积、体积分数80％的乙醇进行醇沉，得到榆黄蘑粗多糖溶液；

[0045] 步骤2，向榆黄蘑粗多糖溶液中加入1/4体积的Sevage溶液(按体积比，三氯甲烷：正丁醇＝4：1)，用磁力搅拌器充分搅拌1h(Sevage溶液的作用是用来去除多糖溶液中的蛋白质)，静置分层后，收集上层多糖溶液，反复3次操作，直至上下层之间无变性蛋白质为止，挥发出有机试剂即得到榆黄蘑多糖。

[0046] 实施例3

[0047] 步骤1，将榆黄蘑的子实体与去离子水按质量比1:40放入烧杯中，超声机500W下超声16min，再90℃水浴2h，将上清液减压浓缩为原来的20％，之后用浓缩液4倍体积、体积分数80％的乙醇进行醇沉，得到榆黄蘑粗多糖溶液；

[0048] 步骤2，向榆黄蘑粗多糖溶液中加入1/4体积的Sevage溶液(按体积比，三氯甲烷：正丁醇＝4：1)，用磁力搅拌器充分搅拌1h(Sevage溶液的作用是用来去除多糖溶液中的蛋白质)，静置分层后，收集上层多糖溶液，反复3次操作，直至上下层之间无变性蛋白质为止，挥发出有机试剂即得到榆黄蘑多糖。

[0049] 试验例1 对实施例1制得的榆黄蘑多糖的活性成分及对结肠癌恶病质小鼠肌肉衰减作用进行检测

[0050] 1、榆黄蘑多糖中各组分含量的测定

[0051] 采用苯酚硫酸法对榆黄蘑中的糖含量进行检测，榆黄蘑多糖中葡萄糖含量标准曲线如图1所示；采用考马斯亮蓝G250法对榆黄蘑中的蛋白质含量进行检测，蛋白质含量标准曲线如图2所示；采用间羟基联苯法测定榆黄蘑多糖糖醛酸含量，糖醛酸含量标准曲线如图12所示，由图1、2、12可知，实施例1制得的榆黄蘑多糖中糖含量为51.09％，蛋白含量为
9.87％，糖醛酸含量为1.24％。

[0052] 2、榆黄蘑多糖分子量的测定：

[0053] 采用高效凝胶渗透色谱法对榆黄蘑多糖进行分子量测定，根据样品的保留时间，确定样品的分子量大小，保留时间越小，分子量越大。色谱条件为RID‑10A视差折光检测器，TSK‑gel G‑3000PWXL色谱柱(7.8×300nm)，流动相为蒸馏水，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，进样量为10μL。

[0054] 标准葡聚糖分子量标准曲线如图3所示，得到分子量标准曲线方程y＝‑0.2282x+2
7.8312，R ＝0.9922。榆黄蘑多糖的高效凝胶渗透色谱图如图4所示，根据保留时间和标准
5 6
曲线，计算榆黄蘑多糖中中性均一组分多糖的分子量为3.00×10～1.00×10 Da，酸性均一
5 5
组分多糖的分子量为1.20×10～3.50×10Da，二者比例为18.3:1。

[0055] 3、榆黄蘑多糖单糖组成分析：

[0056] 称量实施例1制得的榆黄蘑多糖样品5mg，加入配置好的5％TFA酸溶液(三氟乙酸)，121℃加热2小时，通氮气吹干，加入甲醇清洗再吹干，重复3次。加入无菌水溶解，转入干净色谱瓶中待测。设置流动相：A相：ddH2O；B相：200mM NaOH；C相：200mM NaOH/500mM NaAC；流速：0.5mL/min。

[0057] 榆黄蘑多糖单糖组成HPLC如图5所示，由图5能够看出，实施例1制得的榆黄蘑多糖包括木糖、葡萄糖、半乳糖，葡萄糖醛酸、岩藻糖、果糖、阿拉伯糖，摩尔比60.905：26.281：7.754：3.803：0.697：0.418:0.139。

[0058] 4、榆黄蘑多糖红外光谱分析

[0059] 称取1.5mg实施例1制得的榆黄蘑多糖与200mg色谱纯KBr充分混合，用玛瑙研钵进‑1行研磨后压片，另取200mg KBr单独压片作为背景。用红外光谱仪在4000‑500cm 范围内进行红外光谱扫描分析，结果如图6所示，由图6能够知晓实施例1制得的榆黄蘑多糖为β型呋喃糖。

[0060] 5、榆黄蘑多糖抗结肠癌恶病质小鼠肌肉衰减作用

[0061] 5.1动物实验设计及处理

[0062] 5.1.1动物分组

[0063] 将适应性饲养一周后的BALB/c小鼠随机分为正常组、结肠癌恶病质模型组、榆黄蘑多糖低剂量组、榆黄蘑多糖中剂量组、榆黄蘑多糖高剂量组和四君子颗粒阳性对照组，每组10只。

[0064] 5.1.2细胞的处理及建立肿瘤小鼠模型

[0065] 在含有10％的胎牛血清及1％的青霉素‑链霉素双抗的DMEM培养基中正常培养小8
鼠CT26结肠癌细胞，用磷酸盐缓冲液进行调整，收集细胞密度为2×10/mL用于体内造模。
7
除正常组外其余5组小鼠右侧背部皮下注射CT26细胞1×10 (溶于0.1mL PBS+0.1mL基底胶)，观察肿瘤生长情况，7d后开始进行实验。

[0066] 5.1.3动物给药干预

[0067] 7d后观察到成瘤后开始给予小鼠灌胃，正常组和模型组小鼠按每只0.2mL生理盐水进行灌胃，多糖给药组将多糖溶解在生理盐水中，同样按0.2mL/只进行灌胃，给药剂量分别为200，400，600mg/kg，阳性组给药四君子颗粒根据成年人日用剂量换算为2250mg/kg，溶解在生理盐水中，按0.2mL/只进行灌胃，各组确定使用剂量均安全且无毒副作用。期间所有小鼠自由进食和饮水，每两天称量一次小鼠体重，并观察小鼠状况，记录进食和饮水情况，实验给药14天。

[0068] 5.1.4动物处理及样本收集

[0069] 14天时称量所有小鼠体重后眼眶取血并解剖，将收集到的小鼠全血收集在无菌无RNA酶管中在4℃条件下离心2次(3500rpm/min)，每次10min，取其上清液。并将血清保存在‑80℃的超低温冰箱中直至检测。将解剖得到的心肺，肝脏，肾脏，脾脏，腓肠肌一部分放置在
10％的中性福尔马林缓冲液中固定，另一部分放入无菌无RNA酶的管中后液氮迅速冷冻，同样保存在‑80℃中以便使用。粪便从小鼠大肠内小心收集，保存于无菌无RNA酶的管中后液氮迅速冷冻，同样保存在‑80℃中以便使用。

[0070] 结果：对小鼠进行解剖后对小鼠净体、腓肠肌、肿瘤质量进行比较，小鼠体重情况如图7所示，腓肠肌、肿瘤质量如表1所示：

[0071] 表1

[0072]

[0073] 由图7和表1能够知晓，榆黄蘑多糖可提高结肠癌所致肌肉减少症小鼠的体重、腓肠肌质量，并抑制肿瘤生长。

[0074] 5.2腓肠肌苏木精‑伊红染色及部分指标检测

[0075] 将多聚甲醛固定后的腓肠肌组织块按低浓度到高浓度梯度置于乙醇溶液中进行脱水，用二甲苯与无水乙醇、纯二甲苯进行透明。将已透明的组织块放入石蜡和二甲苯等体积的混合液中15min，再放入纯石蜡中20‑30min对组织块进行包埋。将包埋好的组织蜡块按所需要的切片厚度切成薄片，贴到载玻片上，置于恒温箱中烘干。切片经二甲苯脱蜡两次，放入由高浓度到低浓度的梯度乙醇中3‑5min，再置于蒸馏水中3min，用苏木素染液和伊红染液进行染色，95％乙醇洗去多余红色，再置于无水乙醇中3‑5min。切片放入乙醇和二甲苯等体积的混合液中5min，再放入纯二甲苯中进行透明两次，最后用中性树胶封片。将玻片置于显微镜下观察，使用Eclipse Ci‑L拍照显微镜选取组织的目的区域进行200倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。成像完成后使用Image‑Pro Plus 6.0分析软件，统一以毫米作为标准单位，分别计数每张图片中肌纤维数量，以及对应的肌纤维总面积，并计算出单个肌纤维面积＝肌纤维总面积/肌纤维数量，肌纤维密度＝肌纤维数量/视野面积。小鼠腓肠肌组织病理形态学的影响(HE，×400)如图8所示，小鼠肌纤维数量、面积及密度如表2所示：

[0076] 表2

[0077]

[0078] 注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

[0079] 由图8及表2能够知晓用榆黄蘑多糖干预后，肌纤维细胞横径明显增加，细胞间质变小，改善了恶病质导致的肌肉降解，且呈剂量依赖性。而阳性对照组对肌肉纤维也有改善作用，但作用明显小于多糖干预组。结合表2能更明确的发现，榆黄蘑多糖和阳性药干预组肌纤维数量相比模型组升高趋近于正常组，多糖高剂量组的肌纤维数量甚至更多。从肌纤维总面积和肌纤维密度上都能发现给药后对肌肉状况产生了有益影响。

[0080] 5.3血清指标检测

[0081] 使用晶美试剂盒应用双抗体夹心法测定小鼠血清样品中白介素IL‑6，肿瘤坏死因子TNF‑α的含量。将标准品按说明书要求进行稀释。在酶标板标准品孔中加入不同浓度的标准品50μL，在样品孔中加入样品稀释液40μL和待测样品10μL，轻轻晃动混匀。加入酶标试剂100μL，封板膜封板置于37℃温育60min。温育好后弃去液体，每孔加满稀释后洗涤液反复洗涤，最后拍干。每孔加入显色剂A和B各50μL震荡混匀，37℃避光显色15min后，加终止液50μL终止反应。在450nm处波长依序测量各孔的吸光度值。

[0082] 小鼠血清中IL‑6、TNF‑α含量如图9所示，由图9能够看出与正常组相比，模型组肿瘤恶病质小鼠血清中的IL‑6和TNF‑α的含量均明显上升，与模型组相比，榆黄蘑多糖干预组与阳性药组中IL‑6和TNF‑α的含量均明显下降，说明榆黄蘑多糖给药干预能明显改善恶病质导致的机体炎症反应。

[0083] 5.4 Western blot检测肌肉组织蛋白表达

[0084] 5.4.1细胞处理及其总蛋白提取

[0085] 将L6细胞接种在6孔板中，过夜细胞贴壁后，按表3所示分组对细胞进行处理。用PBS洗涤细胞2‑3次后，加入适当的RIPA裂解缓冲液于培养板内，低温静置3‑5min后刮取细胞，收集至1.5mL离心管中，4℃静置2h以确保细胞完全裂解。12000rpm，4℃条件下离心10min，收集上清液至新离心管中，即为总蛋白溶液。用BCA试剂盒测定蛋白含量，样品蛋白浓度归一化，100℃下煮样15min以变性蛋白，将变性蛋白分装后收入‑20℃冰箱保存备用。

[0086] 5.4.2电泳

[0087] 按实验需求配制所需浓度的分离胶及5％的浓缩胶，将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中，浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。

[0088] 5.4.3转膜

[0089] 准备滤纸和PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。在加有转膜液的盒里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，滤纸和经过活化的PVDF膜。将夹子打开分别垫好海绵及三层滤纸。将分离胶小心剥下置于滤纸上，将PVDF膜盖于胶上，避免产生气泡。按一定电压及时间转膜。

[0090] 5.4.4免疫反应

[0091] 将转好的膜于室温下用5％的脱脂牛奶(0.5％TBST配)封闭1h放于摇床上。封闭后将PVDF膜置于一抗稀释液中(TBST溶解的5％脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5％BSA)，摇床轻柔摇动，4℃孵育过夜。取出PVDF膜后，用TBST在室温下洗三次，每次5min。洗涤后将PVDF膜再置于二抗稀释液中(用TBST稀释3000倍)，室温孵育30min，用TBST在室温下洗三次，每次5min。

[0092] 5.4.5化学发光

[0093] 二抗孵育完成后，取出PVDF膜，在暗室中将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1‑2min后，去尽残液，盖上上面的一层薄膜开始曝光。曝光后的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。

[0094] 5.4.6凝胶图像分析

[0095] 将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

[0096] Atrogin‑1和MuRF‑1的蛋白质印迹如图10所示，Atrogin‑1和MuRF‑1蛋白表达量如表3所示：

[0097] 表3

[0098]

[0099] 由图10及表3能够看出实施例1制备的榆黄蘑多糖可下调肌肉减少癌症标志基因Atrogin‑1和MuRF‑1的蛋白表达。

[0100] 5.5 Real‑time PCR检测肌肉组织mRNA表达

[0101] 5.5.1组织总RNA提取

[0102] 采用异硫氰酸胍‑苯酚‑氯仿提取法抽提腓肠肌中的总RNA(miRNA)。精确称量100mg组织用1mL的TRIzol试剂对组织进行裂解。加入0.2mL氯仿，剧烈摇匀，室温下静置3分钟后4℃12000g离心15分钟，RNA溶解在上层水相。将上层水相转移到1.5mL的离心管，按照每1mL的TRIzol加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇，室温下放置10min，4℃12000g离心10分钟，移除上清，底部会有白色的RNA。加入无RNA酶的水配制的75％乙醇，涡旋混合20s，7500g离心5min。移除上清，空气中静置5‑10min，待底部RNA刚好变无色，加入20ul无RNA酶的水，60℃水浴15min进行反转录或者放在‑70℃保存。

[0103] 5.5.2 cDNA的合成

[0104] 在0.2mL的Ep管内，按照ABI反转录试剂盒说明书配制反应液，具体操作如表4‑1。

[0105] 表4‑1 RNA提取操作步骤

[0106]

[0107] 5.5.3引物的设计与合成

[0108] 通过对Gen Bank上已报道基因序列比对，使用Primer 5.0等相关生物学软件对上述基因设计特异性引物，用于后续实验，所设计引物序列见表4‑2。

[0109] 表4‑2 基因引物设计与合成

[0110]

[0111] 5.5.4 Real‑time PCR

[0112] 将上述反转录所得cDNA进行q‑PCR反应，以检测基因表达水平，反应体系如表4‑3。

[0113] 表4‑3 qPCR反应体系

[0114]

[0115]

[0116] 检测了细胞中目的基因Atrogin‑1、MuRF‑1和内参基因β‑actin的表达量，根据qPCR反应曲线得出Ct值，采用△△Ct进行相对定量。

[0117] Atrogin‑1和MuRF‑1的mRNA表达量如图11所示，由图11能够看出实施例1制备的榆黄蘑多糖可下调肌肉减少癌症标志基因Atrogin‑1和MuRF‑1的mRNA表达。

[0118] 综上表明，榆黄蘑多糖能够缓解结肠癌所致的肌肉减少症状。

[0119] 试验例2

[0120] 对实施例1制得的榆黄蘑多糖进行大肠癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为大肠癌细胞CT‑26，结果证明本实施例制得的榆黄蘑多糖能够缓解大肠癌所致的肌肉减少症状。

[0121] 试验例3

[0122] 对实施例2制得的榆黄蘑多糖进行肝癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为肝癌细胞H22，结果证明本实施例制得的榆黄蘑多糖能够缓解肝癌所致的肌肉减少症状。

[0123] 试验例4

[0124] 对实施例2制得的榆黄蘑多糖进行与实施例1相同的检测，结果表明实施例2制得的榆黄蘑多糖由木糖、葡萄糖、半乳糖，葡萄糖醛酸、岩藻糖、果糖、阿拉伯糖按摩尔比59.938：26.485：7.234：5.172：0.665：0.396:0.125组成。

[0125] 试验例5

[0126] 对实施例2制得的榆黄蘑多糖进行胃癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为胃癌细胞MFC，结果证明实施例2制得的榆黄蘑多糖能够缓解胃癌所致的肌肉减少症状。

[0127] 试验例6

[0128] 对实施例2制得的榆黄蘑多糖进行食管癌癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为食管癌细胞AKR，结果证明实施例2制得的榆黄蘑多糖能够缓解食管癌癌所致的肌肉减少症状。

[0129] 试验例7

[0130] 对实施例2制得的榆黄蘑多糖进行肺癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为肺细胞lewis，结果证明实施例2制得的榆黄蘑多糖能够缓解肺癌所致的肌肉减少症状。

[0131] 试验例8

[0132] 对实施例2制得的榆黄蘑多糖进行胰腺癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为胰腺细胞PANC02，结果证明实施例2制得的榆黄蘑多糖能够缓解胰腺癌所致的肌肉减少症状。

[0133] 试验例9

[0134] 对实施例2制得的榆黄蘑多糖进行淋巴癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为淋巴癌细胞EL4，结果证明实施例2制得的榆黄蘑多糖能够缓解淋巴癌所致的肌肉减少症状。

[0135] 试验例10

[0136] 对实施例3制得的榆黄蘑多糖进行淋巴癌恶病质小鼠肌肉衰减效果验证，试验过程同试验例1，不同之处在于所用肿瘤细胞为乳腺癌细胞4T1，结果证明实施例2制得的榆黄蘑多糖能够缓解乳腺癌所致的肌肉减少症状。

[0137] 试验例11

[0138] 对实施例3制得的榆黄蘑多糖进行与实施例1相同的检测，结果表明实施例3制得的榆黄蘑多糖由木糖、葡萄糖、半乳糖，葡萄糖醛酸、岩藻糖、果糖、阿拉伯糖按摩尔比56.410：29.059：9.235：3.464：0.915：0.644:0.157组成。

[0139] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。