一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac及其制备方法和应用，所述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac包含吩噻嗪、乙烯基苯与荧光蛋白亚甲基咪唑啉酮的共轭结构，同时在荧光生色团端基引入丙烯酸芳基酯作为活性硫醇识别位点和光敏剂靶向基团。本发明的红色荧光蛋白类光敏染料分子RFP‑Ac具有双光子吸收特性，斯托克斯位移超过200 nm，抗干扰能力强，灵敏度高，细胞毒性小，生物相容性好，单线态氧产率较高，可作为性能优异的双光子光敏染料和荧光探针，在近红外波段荧光传感、内源性或外源性生物活性硫醇检测、双光子荧光成像、荧光标记、双光子光动力治疗方面具有广泛应用。

权利要求

1.一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac，其特征在于，包括如下结构式：

2.根据权利要求1所述的一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac，其特征在于，所述光敏染料RFP‑Ac通过吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me依次与对羟基苯甲醛和丙烯酰氯反应制备而成，所述RFP‑Me结构式如下：

3.权利要求1或2所述的一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me在惰性气体保护和110℃下与对羟基苯甲醛在无水甲苯中反应后再在室温下与丙烯酰氯反应，柱色谱提纯，得到所述的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac。

4.根据权利要求3所述的一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的制备方法，其特征在于，所述吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me与对羟基苯甲醛的摩尔比为1∶1.2～1∶2.0。

5.权利要求1或2所述的一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料在近红外波段荧光探针、双光子荧光成像、荧光传感或荧光标记中的应用。

6.权利要求1或2所述的一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料在制备作为近红外双光子光动力治疗光敏剂药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为用于对肿瘤细胞进行光动力治疗的药物。

说明书

一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种荧光蛋白类光敏染料，具体涉及一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 在光激发下，光敏染料通过光控能量转移在肿瘤部位产生单线态氧。单线态氧对肿瘤细胞具有高毒性，能与肿瘤细胞中的DNA、RNA、脂质和蛋白质分子反应，导致细胞凋亡，实现对肿瘤细胞的光动力治疗。半胱氨酸和谷胱甘肽是细胞中最具代表性的活性硫醇，它们在肿瘤细胞中的浓度高于正常细胞。半胱氨酸和谷胱甘肽的过度表达会消耗细胞内的活性氧，降低光动力治疗效果。

[0003] 目前绝大多数用于光动力治疗的光敏染料位于可见光区域，生物相容性差，且缺少靶向基团，难以满足生物体系光动力治疗的要求，极大地限制了其应用范围。近红外双光子光敏染料可以有效减少光损伤，在生物组织中穿透力强，安全可靠；硫醇靶向基团有利于消耗肿瘤细胞内过度表达的活性硫醇半胱氨酸和谷胱甘肽，从而增强光动力治疗效果。因此，设计制备性能优异、具有靶向基团的近红外双光子光敏染料是近期的研究热点。

[0004] 荧光蛋白是一种从水母中发现的生物发光大分子，其发光母核结构是亚甲基咪唑啉酮。由于是生物体内的荧光团，荧光蛋白具有优异的生物相容性，毒性低，斯托克斯位移大，受到生物体自身的背景干扰小，安全可靠，但在现有技术中基于红色荧光蛋白结构的近红外双光子光敏染料鲜有报道。

发明内容

[0005] 发明目的：本发明的第一个目的是提供一种性能优异、斯托克斯位移大、抗背景干扰能力强、生物相容性好的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac。

[0006] 本发明的第二个目的是提供上述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的制备方法。

[0007] 本发明的第三个目的是提供了上述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac在近红外波段荧光探针、双光子荧光成像、荧光传感或荧光标记中的应用。

[0008] 本发明的第四个目的是提供上述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac在作为近红外双光子光动力治疗光敏剂中的应用。

[0009] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac，包括如下结构式：

[0010]

[0011] 其中，所述红色荧光蛋白类双光子光敏材料RFP‑Ac通过吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me依次与对羟基苯甲醛和丙烯酰氯反应制备而成，所述吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me结构式如下：

[0012]

[0013] 本发明所述的一种红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的制备方法，包括以下步骤：在惰性气体保护和110℃下，将吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me与对羟基苯甲醛在干燥甲苯中反应后再在室温下与丙烯酰氯反应，柱色谱提纯，得到所述红色荧光蛋白类双光子光敏材料RFP‑Ac。

[0014] 采用本发明的制备方法制得的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的产率为47％～52％。

[0015] 其中，所述吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me与对羟基苯甲醛的摩尔比为1：1.2～1：2.0。

[0016] 本发明内容还包括所述的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac在近红外波段荧光探针、双光子荧光成像、荧光传感或荧光标记中的应用。

[0017] 本发明内容还包括红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac在近红外双光子光动力治疗光敏剂中的应用。

[0018] 其中，所述应用为对肿瘤细胞进行光动力治疗。

[0019] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明所述的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac包含吩噻嗪、乙烯基苯与荧光蛋白生色团亚甲基咪唑啉酮的共轭结构，并在荧光团端基连接丙烯酸芳基酯作为生物活性硫醇识别位点和光敏剂靶向基团。该荧光分子可以作为活性硫醇荧光探针，对半胱氨酸及谷胱甘肽能够实现选择性识别，该荧光探针分子斯托克斯位移高达260nm，灵敏度高。在近红外激光照射下，红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac能高效释放单线态氧，抑制癌细胞迁移并促使肿瘤细胞凋亡，实现对肿瘤细胞的光动力治疗。光敏染料分子RFP‑Ac具有双光子吸收特性，斯托克斯位移大，抗背景干扰能力强，灵敏度高，细胞毒性小，生物相容性好，单线态氧产率高，可作为性能优异的近红外双光子光敏染料，在近红外波段荧光探针、双光子荧光成像、荧光传感、荧光标记、双光子光动力治疗、内源性或外源性活性硫醇检测方面具有广泛应用。

附图说明

[0020] 图1a1～a3是在生物活性硫醇Cys/GSH存在下红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac与A‑549细胞共同孵化的荧光成像，其中a1红光通道，a2明场通道，a3混合场通道；图1b1～b3无硫醇存在下红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac与A‑549细胞共同孵化的荧光成像，其中b1红光通道，b2明场通道，b3混合场通道。

[0021] 图2为红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac与斑马鱼共同孵育的双光子荧光成像，激发波长为800nm。

具体实施方式

[0022] 实施例1

[0023] (1)红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的制备：

[0024] 在氮气保护和110℃下，称取0.23g吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me溶于30mL干燥甲苯中，加入0.12g对羟基苯甲醛，再滴入5d冰醋酸，搅拌反应6h。反应结束后，用柱色谱分离提纯。称取0.08g所得物溶于20mL干燥二氯甲烷中，在0℃冰水浴中滴加0.15g丙烯酰氯，然后升至室温反应8h。反应结束后，经萃取、洗涤、干燥、柱色谱分离，即得所述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac，产率52％。

[0025] 红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的合成路线如下：

[0026]

[0027] 其中，吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me按文献方法制备(项雯晖，张磊，支旭，钱鹰，吩噻嗪‑荧光蛋白生色团类似物的合成、S原子促进的光动力治疗及双光子荧光成像.有机化学，2021，41(9)，3578‑3584)。

[0028] (2)红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的结构表征：

[0029] 核磁共振氢谱1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.08(s，1H)，8.06‑7.93(m，2H)，7.63(d，J＝7.4Hz，1H)，7.22(d，J＝7.4Hz，2H)，7.13(d，J＝6.5Hz，3H)，6.84(s，3H)，6.63(t，J＝14.0Hz，2H)，6.34(dd，J＝17.3，10.4Hz，1H)，6.05(d，J＝10.4Hz，1H)，4.43(s，2H)，4.01(s，
2H)，1.81(s，2H)，1.46(s，9H)，1.30(dd，J＝39.9，16.2Hz，2H)，0.97(t，J＝6.7Hz，3H).[0030] 高分辨质谱HRMS：m/z calcd for C37H37N3NaO5S[M+Na]+658.2346，found 
658.2367

[0031] 由此确认所获得红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的结构式为：

[0032]

[0033] 实施例2红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的制备

[0034] 在氮气保护和110℃下，称取0.23g吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me溶于30mL干燥甲苯中，加入0.09g对羟基苯甲醛，再滴入5d冰醋酸，搅拌反应6h，结束反应并分离所得物。称取0.08g所得物溶于20mL干燥二氯甲烷中，在0℃冰水浴中滴加0.15g丙烯酰氯，然后升至室温反应8h。反应结束后，经萃取、洗涤、干燥、柱色谱分离，即得所述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac，产率50％。

[0035] 实施例3红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac的制备

[0036] 在氮气保护和110℃下，称取0.20g吩噻嗪荧光蛋白类似物RFP‑Me溶于30mL干燥甲苯中，加入0.06g对羟基苯甲醛，再滴入5d冰醋酸，搅拌反应6h，结束反应并分离所得物。称取0.08g所得物溶于20mL干燥二氯甲烷中，在0℃冰水浴中滴加0.15g丙烯酰氯，然后升至室温反应8h。反应结束后，经萃取、洗涤、干燥、柱色谱分离，即得所述红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac，产率47％。

[0037] 实施例4红色荧光蛋白类双光子染料RFP‑Ac作为光动力治疗光敏剂方面的应用[0038] 实施例1制备的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac最大紫外‑可见吸收波长在498nm，最大荧光发射波长在758nm，斯托克斯位移高达260nm，极大的斯托克斯位移使得探针RFP‑Ac具有抗背景干扰、灵敏度高等优异性质。

[0039] 以1，3‑二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧捕获剂，二氯化‑三‑联吡啶钌(Ru(bpy)3Cl2)为参比，测定单线态氧量子产率。红色荧光蛋白类双光子染料RFP‑Ac在活性硫醇半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)诱导下，近红外激光照射，迅速产生单线态氧，单线态氧量子产率为36％，半抑制浓度IC50为4.2μM。

[0040] 将红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac与A‑549细胞共同孵化，用共聚焦荧光显微镜拍照。红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac可以很快的进入细胞内，无硫醇时荧光较弱，在活性硫醇Cys/GSH存在下显示出很强红色荧光。在激光照射下，红色荧光蛋白类光敏染料RFP‑Ac在A‑549细胞体内迅速产生了单线态氧，有效杀死肿瘤细胞，并抑制肿瘤细胞的迁移并促使肿瘤细胞凋亡，实现对肿瘤细胞的光动力治疗。图1a1～a3是在生物活性硫醇Cys/GSH存在下红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac与A‑549细胞共同孵化的荧光成像，其中a1红光通道，a2明场通道，a3混合场通道；图1 b1～b3无硫醇存在下红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac与A‑549细胞共同孵化的荧光成像，其中b1红光通道，b2明场通道，b3混合场通道。

[0041] 实施例5红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac作为斑马鱼双光子荧光成像方面的应用

[0042] 将斑马鱼卵孵化3天，再把斑马鱼均匀地分散在共聚焦盘中。实施例1制备的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac(浓度为2μM)加入含有斑马鱼的共聚焦盘中染色半小时，在波长为800‑900nm的飞秒激光激发下为对斑马鱼进行双光子荧光成像。近红外双光子光敏染料RFP‑Ac可以很快进入斑马鱼体内，并在红光通道进行双光子荧光成像。图2为在800nm激光激发下斑马鱼的双光子荧光成像图。

[0043] 综上所述，本发明的红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac包含吩噻嗪、乙烯基苯与荧光蛋白亚甲基咪唑啉酮的共轭结构，同时在荧光生色团端基引入丙烯酸芳基酯作为活性硫醇识别位点和光敏剂靶向基团。该荧光分子可以作为生物活性硫醇荧光探针，对半胱氨酸及谷胱甘肽能够实现选择性识别。在近红外激光激发下，红色荧光蛋白类双光子光敏染料RFP‑Ac能高效释放单线态氧，抑制癌细胞迁移并促使肿瘤细胞凋亡，实现对肿瘤细胞的光动力治疗。红色荧光蛋白类光敏染料分子RFP‑Ac具有双光子吸收特性，斯托克斯位移超过200nm，抗干扰能力强，灵敏度高，细胞毒性小，生物相容性好，单线态氧产率较高，可作为性能优异的双光子光敏染料和荧光探针，在近红外波段荧光传感、内源性或外源性生物活性硫醇检测、双光子荧光成像、荧光标记、双光子光动力治疗方面具有广泛应用。