一种蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的应用

摘要

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的应用。所述蛋白质如下1)或2)：1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质；所述相关生物材料为如下任一所示：31)破坏所述蛋白质的基因的表达和/或降低所述蛋白质的含量的核酸分子；32)含有31)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。通过敲除或抑制该基因可实现水稻对病原菌抗性的提高和品种的改良，所以本发明基因和蛋白对农业生产具有重要意义。

权利要求

1.一种蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述相关生物材料为如下任一所示：

31)破坏所述蛋白质的基因的表达和/或降低所述蛋白质的含量的核酸分子；

32)含有31)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，31)所述基因如下任一所示：A1)SEQ ID NO.2的第1740‑4586位所示的核苷酸序列；

B2)编码SEQ ID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列；

C3)在高严谨条件下可与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交且编码SEQID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列；

D4)与A1)或B 2)或C 3)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码SEQ ID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列。

3.权利要求1中所述的相关生物材料在培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻中的应用。

4.一种构建白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的方法，其特征在于，所述方法包括破坏目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达和/或降低权利要求1中所述蛋白质的含量，得到基因突变水稻。

5.根据权利要求4所述的一种构建白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的方法，其特征在于，所述破坏目的水稻的权利要求1中所述蛋白质的基因的表达和/或降低权利要求1中所述蛋白质的含量的方法为通过对所述目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的基因进行敲除或抑制来实现的。

6.根据权利要求5所述的一种构建白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的方法，其特征在于，所述破坏目的水稻的权利要求1中所述蛋白质的基因的表达和/或降低权利要求1中所述蛋白质的含量的方法为利用RNA干扰、CRISPR/Cas9技术或TALEN技术对目的水稻的权利要求1所述蛋白质的基因敲除或抑制来实现的。

7.根据权利要求6所述的一种构建白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术中的靶序列如SEQ ID NO.3所示。

说明书

一种蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的应用。

背景技术

[0002] 植物为了保护自身免于各种病原菌的侵袭，逐渐进化形成了多层次的防御体系，即先天免疫系统，主要包含PAMP诱导的免疫反应PTI和效应因子诱导的免疫反应ETI。

[0003] PTI主要是利用宿主细胞膜上的正调控因子模式识别受体PRRs识别病原菌的PAMPs，进而激活下游的丝裂原激活蛋白激酶MAPKs的级联信号通路或钙依赖性蛋白激酶通路CDPKs，引发植物的抗病反应抵抗各种病原菌的侵入。拟南芥EDR1作为一个Raf样MAPKKK蛋白激酶，通过与蛋白激酶MKK4/MKK5直接相互作用，负调控MKK4/MKK5‑MPK3/MPK6信号通路。edr1突变体表现出对丁香假单胞杆菌、白粉菌和卵菌的抗病表型；edr1突变体的抗性依赖于糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白LLG1、油菜素类固醇信号激酶BSK1和E3泛素连接酶KEG。LLG1作为一个共受体，与PAMP受体FLS2和EFR互作，调控免疫反应；与调控生长发育关键蛋白激酶FER结合，控制生长发育。BSK1属于胞质型类受体激酶第XII亚家族成员，与FLS2在同一复合体中，对于激活FLS2信号通路至关重要。KEG招募EDR1在反式高尔基体和早胞内体上定位。

[0004] EDR4(Enhanced Disease Resistance4)编码的蛋白包含一个Coiled‑Coil结构域、四个LCRs结构域和一个Duf3133结构域。EDR4蛋白定位于质膜和内膜系统上，负调控对白粉病的抗性，同时该抗性依赖于水杨酸信号途径。EDR4通过与EDR1的相互作用，调控EDR1蛋白在白粉病菌的侵入位置的聚集。由于细胞运输相关网格蛋白重链蛋白亚基CHC2与EDR4在植物体内相互作用，且chc2突变体也影响EDR1蛋白在白粉病菌的侵入位置的聚集，推测EDR4可能作为衔接蛋白与网格蛋白形成复合体参与内吞作用调节EDR1的亚细胞定位来调控植物的抗病反应。网格蛋白介导的内吞作用是胞吞的一个主要途径，尽管CME的其它组分还有待发现，但CME接头蛋白以及其功能分析对我们重新认识CME在植物中作用提供了新的方向。例如，flg22、elf18和pep1触发的FLS2、EFR和PEPR1/2的囊泡运输均表现出依赖CME。最近的研究还发现，EDR4正调控拟南芥对丁香假单胞杆菌的抗性；该抗性依赖于互作蛋白RECEPTOR‑LIKE KINASE 902和BSK1传递的信号通路，其中EDR4和CHC2调节RLK902在细胞内的积累与运输。目前，EDR1在水稻抗白叶枯病病原菌PXO61、PXO86和PXO99的功能已有报道。

[0005] 水稻作为一种重要的粮食作物，白叶枯病是其最严重的细菌性病害，高产水稻品种易感程度高，很容易发生大量减产，因此，如何提高水稻的白叶枯病抗性是本发明要解决的技术问题。

发明内容

[0006] 为解决上述技术问题，本发明的第一个方面，提供一种蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的应用，所述蛋白质如下1)或2)：

[0007] 1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0008] 2)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质；

[0009] 所述相关生物材料为如下任一所示：

[0010] 31)破坏所述蛋白质的基因的表达和/或降低所述蛋白质的含量的核酸分子；

[0011] 32)含有31)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

[0012] 进一步的，1)所述基因如下任一所示：

[0013] A1)SEQ ID NO.2的第1740‑4586位所示的核苷酸序列；

[0014] B2)编码SEQ ID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列；

[0015] C3)在高严谨条件下可与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交且编码SEQ ID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列；

[0016] D4)与A 1)或B 2)或C 3)限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码SEQ ID NO.1所示蛋白质的核苷酸序列。

[0017] 上述高严谨条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0018] 本发明的第二个方面，提供所述的相关生物材料在培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻中的应用。

[0019] 本发明的第三个方面，提供一种构建白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的方法，所述方法包括破坏目的水稻的所述蛋白质的基因的表达和/或降低所述蛋白质的含量，得到基因突变水稻。

[0020] 进一步的，所述破坏目的水稻中所述蛋白质的基因的表达和/或降低所述蛋白质的含量的方法为通过对所述目的水稻中所述蛋白质的基因进行敲除或抑制来实现的。

[0021] 更进一步的，所述破坏目的水稻中所述蛋白质的基因的表达和/或降低所述蛋白质的含量的方法为利用RNA干扰、CRISPR/Cas9技术或TALEN技术对目的水稻的所述蛋白质的基因敲除或抑制来实现的。

[0022] 更进一步的，所述CRISPR/Cas9技术中的靶序列如SEQ ID NO.3所示。

[0023] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0024] 本发明首次通过CRISPR/Cas9的方法验证了水稻中一个与白叶枯病抗性相关的基因。该基因编码区总共有2751个核苷酸组成，两个外显子，序列如SEQ ID NO.2的第1740‑1857位和第1954‑4586位核苷酸所示。所述基因编码的蛋白共有916个氨基酸组成，序列如SEQ ID No.2所示，敲除或抑制该基因可实现水稻对病原菌抗性的提高和品种的改良，所以本发明基因和蛋白对农业生产具有重要意义。

附图说明

[0025] 图1为LOC4329315 sgRNA的靶标序列位置。

[0026] 图2为BGK03载体示意图。

[0027] 图3为LOC4329315基因编辑位置示意图。

[0028] 图4为LOC4329315的CRISPR/Cas9基因编辑水稻的基因编辑效果验证。

[0029] 图5为接种PXO99的基因编辑突变体的病斑长度(A)和表型(B)。

具体实施方式

[0030] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0031] 实施例1：白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的构建

[0032] (一)LOC4329315用于CRISPR/Cas9的sgRNA靶点选择与表达载体的构建[0033] 通过NCBI的BLAST比对，发现拟南芥抗病基因AtEDR4(AT5G05190)的水稻同源基因OsEDR4(LOC4329315)。利用http://www.ricedata.cn/index.htm下载LOC4329315的基因序列(SEQ ID NO.2的第1740‑4586位所示序列，该基因有两个外显子，分别如由SEQ ID NO.2的第1740‑1857位和第1954‑4586位所示，编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质)，根据在线软件http://crispor.tefor.net/搜寻20bp NGG靶标序列(5’‑ATTTCTGTCT ACCAGTGCGG‑3’，如SEQ ID NO.3所示)，并通过BLAST检测序列的特异性，靶标序列位置如图1所示。

[0034] 选择合适的sg序列(5’‑GTTTCTGTCTACCAGTGCGG‑3’，如SEQ ID NO.8所示)后，使用百格基因试剂盒进行载体构建(载体为BGK03，示意图如图2所示)。将获得的重组载体抽提质粒，转入农杆菌EHA105中。

[0035] (二)水稻日本晴的遗传转化

[0036] 利用水稻粳稻品种日本晴的成熟胚诱导愈伤组织，以潮霉素作为抗性筛选剂，通过共培养、抗性筛选、预分化、分化和生根等过程获得20株基因编辑T0代植株。之后使用中科瑞泰基因组DNA提取试剂盒提取水稻T0代叶片的基因组DNA，基因编辑植株可利用靶序列的上下游引物SG‑OsEDR4‑F/R进行PCR扩增和测序，在Lasergene 7.0软件中序列比对和分析编辑情况。SG‑OsEDR4‑F/R引物(表1)是在SG序列前300bp左右的位置设一个上游引物F，序列后150bp左右设计一个下游引物R，全长460bp。

[0037] 表1基因编辑的测序引物序列

[0038]

[0039] 测序结果表明，20个不同T0代转基因植株中的OsEDR4第一外显子中SG序列位置存在4个独立的纯合突变的转基因株系，其中T0‑5、7、16均发生一个碱基T的插入，T0‑15发生一个碱基A的插入(图3所示)。根据以上的测序结果，基因编辑主要是在SG序列发生了A或者T的单碱基插入，进而造成蛋白翻译的提前终止。

[0040] 实施例2：白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的分子标记验证

[0041] (一)PCR‑RE引物的设计

[0042] 将以上的T0代种植收种后，为了便于在T1代进行OsEDR4的基因编辑遗传效果的检测，我们进行了PCR‑RE引物的设计。利用dCAPS(wustl.edu)设计网站，我们设计出OsEDR4‑EDIT‑F/R的dCAPS引物(表2)用于后续的基因编辑检测。

[0043] 表2基因编辑的检测引物序列

[0044]

[0045] (二)基因编辑水稻的分子鉴定

[0046] T1代基因编辑植株在苗期幼嫩叶片，液氮研磨均匀成细粉后进行DNA提取。使用中科瑞泰基因组DNA提取试剂盒提取水稻T1代叶片的基因组DNA，利用引物OsEDR4‑EDIT‑F/R进行PCR扩增和相应限制性内切酶的酶切，4％琼脂糖凝胶电泳分析结果。结果如图4所示，四个基因编辑T1代纯合水稻植株与野生型水稻日本晴对照均可以扩增出T0代所测基因编辑位置前后164bp(前25bp和后139bp)的片段(图中PCR字母位置标示)；经HhaI酶切扩增片段(图中HhaI字母位置标示)，发现野生型日本晴NB扩增出的片段因为没有发生基因编辑保留了HhaI酶切位点，可以被切除25bp，从而出现139bp片段；四个基因编辑T1代纯合水稻植株因为插入了A或者T的单碱基，所以HhaI酶切位点消失，无法被切割仍然保持164bp。综上所述，T1代OsEDR4基因编辑纯合植株的基因由于基因插入造成表达丧失，失去自身功能。

[0047] 实施例3：白叶枯病抗性增强的基因突变水稻抗病表型分析

[0048] (一)病原菌的培养和接种

[0049] 供试的白叶枯病菌菌种PXO99在‑80℃冰箱保藏，用前取出在土豆培养基(1L：土豆300g，蛋白胨5g，十二水合磷酸氢二钠2g，硝酸钙0.5g，蔗糖15g，琼脂粉20g)中活化备用，用
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无菌水稀释至5×10细胞/毫升。配制的菌液在2小时内采用剪叶法接种处于T1代分蘖期植株和日本晴对照植株。接种14天后，统计病叶的病斑长度，以此来衡量发病情况。

[0050] (二)编辑水稻抗病表型分析

[0051] 与对照日本晴相比，接种PXO99的基因编辑突变体T1‑5、T1‑7、T1‑16和T1‑15表现出更短的病斑长度，对PXO99(P6)感病性降低(图5)。结果表明，OsEDR4功能缺失突变体增强了水稻对白叶枯病病原菌PXO99的抗病性。

[0052] 由于实施例3中OsEDR4基因编辑出2种突变类型的4个单独的突变体接种白叶枯病菌后表型类似，进一步证明突变体表现出白叶枯病抗性增强的表型是由于LOC4329315基因翻译提前终止进而造成基因功能缺失产生的。

[0053] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0054] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。