一种新型冠状病毒疫苗的佐剂及其应用和新型冠状病毒二价重组疫苗

摘要

本发明公开一种用于新型冠状病毒COVID‑19疫苗的佐剂，及其含有新型冠状病毒流行HuB毒株和南非突变毒株B.1.351抗原研制的二价疫苗。本发明的佐剂具有更佳适合COVID‑19疫苗蛋白稳定的醋酸钠缓冲液体系，以及中和抗体和细胞免疫水平高的优点。在此基础上发明的二价COVID‑19疫苗，能够针对新型冠状病毒，尤其是HuB毒株、南非突变毒株和Delta突变毒株感染具有良好的防护作用。

权利要求

1.一种含有氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示的融合蛋白和佐剂的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂，按5ml溶液计，由下述组份构成：角鲨烯200‑230 mg、吐温‑80 20‑30 mg、司盘‑85 20‑30 mg和醋酸钠水溶液，总体积5ml，pH值5‑6；

所述新型冠状病毒Covid‑19疫苗是针对HuB毒株的疫苗。

2.如权利要求1所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂的pH为5.6。

3.如权利要求2所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂，按5ml溶液计，其由下述组份构成：角鲨烯215 mg、吐温‑80 25 mg、司盘‑85 25 mg和醋酸‑醋酸钠水溶液，总体积5ml。

4.如权利要求1至3任一项所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂的制备方法如下：

称取角鲨烯和吐温‑80和司盘‑85，搅拌混合均匀，作为油相；加入醋酸‑醋酸钠溶液水相中；将油相和水相混匀，经分散机搅拌，形成初乳；再经超声均质机或者高压均质机均质，得精乳。

5.一种含有氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示的融合蛋白和佐剂的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂，按5ml溶液计，由下述组份构成：角鲨烯200‑230 mg、吐温‑80 20‑30 mg、司盘‑85 20‑30 mg和醋酸钠水溶液，总体积5ml，pH值5‑6；

所述新型冠状病毒Covid‑19疫苗是针对南非突变毒株B.1.351的疫苗。

6.如权利要求5所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂的pH为5.6。

7.如权利要求6所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂，按5ml溶液计，其由下述组份构成：角鲨烯215 mg、吐温‑80 25 mg、司盘‑85 25 mg和醋酸‑醋酸钠水溶液，总体积5ml。

8.如权利要求5至7任一项所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂的制备方法如下：

称取角鲨烯和吐温‑80和司盘‑85，搅拌混合均匀，作为油相；加入醋酸‑醋酸钠溶液水相中；将油相和水相混匀，经分散机搅拌，形成初乳；再经超声均质机或者高压均质机均质，得精乳。

9.一种含有氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示的融合蛋白和如 SEQ ID NO.2所示的融合蛋白以及佐剂的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂，按5ml溶液计，由下述组份构成：角鲨烯200‑230 mg、吐温‑80 20‑30 mg、司盘‑85 20‑30 mg和醋酸钠水溶液，总体积5ml，pH值5‑6；

所述氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示的融合蛋白是针对新型冠状病毒Covid‑19的HuB毒株的疫苗，如 SEQ ID NO.2所示的融合蛋白是针对新型冠状病毒Covid‑19的南非突变毒株B.1.351的疫苗。

10.如权利要求9所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂的pH为

5.6。

11.如权利要求10所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂，按5ml溶液计，其由下述组份构成：角鲨烯215 mg、吐温‑80 25 mg、司盘‑85 25 mg和醋酸‑醋酸钠水溶液，总体积5ml。

12.如权利要求9至11任一项所述的新型冠状病毒Covid‑19疫苗，其特征在于，所述佐剂的制备方法如下：

称取角鲨烯和吐温‑80和司盘‑85，搅拌混合均匀，作为油相；加入醋酸‑醋酸钠溶液水相中；将油相和水相混匀，经分散机搅拌，形成初乳；再经超声均质机或者高压均质机均质，得精乳。

说明书

一种新型冠状病毒疫苗的佐剂及其应用和新型冠状病毒二价

重组疫苗

技术领域

[0001] 本发明属于生物及医药技术领域，具体涉及新型冠状病毒的重组亚单位疫苗用的佐剂，及其新型冠状病毒COVID 19的二价疫苗。

背景技术

[0002] 新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60‑140nm。新冠病毒SARS‑CoV‑2的结构蛋白包括S蛋白、N蛋白、E蛋白、M蛋白。对于
SARS‑CoV‑2而言，只有直接针对S蛋白的中和抗体才能够中和病毒的毒力、阻止病毒对机体
的感染，冠状病毒外套膜上的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)是病毒感染过程中识别宿
主细胞受体的一种关键蛋白，S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基中包含受体结合结
构域(Receptor Binding Domain,RBD)介导吸附作用，S2亚基主要体现融合活性。

[0003] 南非突变株是一种通俗的叫法，是指最早于2020年12月18日在南非被检测发现的的新型冠状病毒的一个突变谱系(lineage)。该突变系随后以其极快的速度蔓延全球,起初
被称之为501Y.V2,以区别于英国突变株的N501Y突变。他们都属于B系谱突变。根据新冠谱
系命名法南非突变株谱系被命名为(B.1.351)。此后，该变体已成为本地主导。B.1.351除
D614G外还包含多个刺突突变，包括NTD中的一簇突变(例如242‑244del和R246I)，RBD中的3
个突变(K417N，E484K和N501Y)和弗林蛋白酶裂解位点附近一个突变(A701V)。王鹏飞等在
Nature杂志发表研究论文(AntibodyResistance of SARS‑Cov‑2 VariantsB.1.351and 
B.1.1.7,Nature,2021)，揭示了部分中和抗体和疫苗免疫血清对南非突变株的保护效率。
通过中和活性的对比，发现针对英国突变株B.1.1.7的中和活性基本未变，但针对南非突变
株B.1.351的中和活性则明显降低(12.4倍，Moderna；10.3倍，辉瑞)

[0004] 新型冠状病毒COVID‑19严重危害人们的生命健康，重在预防，疫苗能够非常有效的预防病毒感染和由此导致的重症肺炎。针对新型冠状病毒COVID‑19，已经有一些研究获
得相关的疫苗，目前已经上市的疫苗均针对HuB株(又称湖北毒株)新冠病毒开发，因此，对
南非突变株B.1.351的保护力均不佳，所以，急需开发针对南非突变株B.1.351的新型冠状
病毒有效的疫苗。

发明内容

[0005] 本发明人分别针对新型冠状病毒的HuB毒株和南非突变毒株B.1.351研制了疫苗(申请号202011454175.1和202110659137.8)。后续通过佐剂的优化，疫苗配比的优化研究，
本发明成功研制了二价疫苗，能够对上述两种新冠病毒感染和感染导致的疾病具有良好的
防护作用。

[0006] 本发明提供一种新型冠状病毒疫苗用的佐剂，其特征在于，其由下述之一的组份构成：

[0007] a.角鲨烯、吐温‑80、司盘‑85、柠檬酸钠、柠檬酸和水；

[0008] b.角鲨烯、吐温‑80、司盘‑85、醋酸‑醋酸钠构成的水溶液；

[0009] c.角鲨烯、司盘‑85、SDS、SolutolHS‑15、醋酸‑醋酸钠构成的水溶液。

[0010] 优选地，按5ml溶液计，其由下述之一的组份构成：

[0011] a.角鲨烯190‑200mg、吐温‑80 20‑30mg、司盘‑85 35‑40mg、柠檬酸钠12‑14mg、柠檬酸0.8‑0.9mg和水5ml；

[0012] b.角鲨烯200‑230mg、吐温‑80 20‑30mg、司盘‑85 20‑30mg、醋酸‑醋酸钠水溶液5ml构成；

[0013] c.角鲨烯200‑230mg、司盘‑85 20‑30mg、SDS 20‑30mg、SolutolHS‑15 40‑60mg、醋酸钠水溶液5ml构成。

[0014] 更优选地，按5ml溶液计，其由下述组份构成：角鲨烯215mg、吐温‑80 25mg、司盘‑85 25mg、醋酸‑醋酸钠水溶液5ml。

[0015] 在一个具体实施方式中，所述佐剂的制备方法如下：

[0016] 称取角鲨烯和吐温‑80和司盘‑85，或/和SDS搅拌混合均匀，作为油相；加入醋酸‑醋酸钠水溶液水相中，将油相和水相混匀，经分散机搅拌，形成初乳；再经超声或者高压均
质机或者微射流仪器均质，得精乳。

[0017] 本发明进一步提供所述佐剂在制备新型冠状病毒疫苗制剂中应用。

[0018] 优选地，所述疫苗是新型冠状病毒COVID‑19抗原表位的下述融合蛋白：由新型冠状病毒COVID‑19抗原表位片段和免疫球蛋白Fc片段构成，其中新型冠状病毒COVID‑19疫苗
的抗原表位片段是S1亚基中的RBD片段和SD1片段。更优选地，所述新型冠状病毒疫苗是新
型冠状病毒的HuB毒株疫苗和/或南非突变毒株B.1.351疫苗。

[0019] 本发明进一步提供一种针对新型冠状病毒的二价重组疫苗，其特征在于，包括针对HuB毒株和南非突变毒株的重组疫苗的组合，其中所述针对新型冠状病毒的HuB毒株疫苗
由新型冠状病毒HuB毒株的抗原表位片段和免疫球蛋白Fc片段构成，其中新型冠状病毒HuB
毒株的抗原表位片段是S1亚基中的RBD片段和SD1片段；所述针对新型冠状病毒的南非突变
毒株B.1.351疫苗由新型冠状病毒南非突变毒株B.1.351的抗原表位片段和免疫球蛋白Fc
片段构成，其中新型冠状病毒南非突变毒株B.1.351的抗原表位片段是S1亚基中的RBD片段
和SD1片段。..

[0020] 优选地，其佐剂采用上述所述的佐剂；优选地，针对新型冠状病毒的HuB毒株疫苗和南非突变毒株B.1.351的疫苗剂量比为2：1，优选地，两者为60μg:30μg、40μg:20μg、30μg:
15μg，更优选地，两者为40μg:20μg的配比剂量。

[0021] 更优选地，针对新型冠状病毒的HuB毒株疫苗的融合蛋白如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；针对新型冠状病毒的南非突变毒株B.1.351疫苗的融合蛋白如SEQ ID NO.2所示
的氨基酸序列。

[0022] 本发明人针对新型冠状病毒的HuB毒株和南非突变毒株B.1.351研制的疫苗，研究所得到优化的佐剂，具有含有更佳适合新冠疫苗蛋白稳定的醋酸‑醋酸钠缓冲液体系，以及
中和抗体和细胞免疫水平高的优点。在此基础上，研究得到本发明的二价重组疫苗，且其具
有广谱性，实验证实了对HuB毒株、南非突变株和Delta突变毒株均能提供防护。本发明的二
价重组疫苗还具有协同作用，在一个实验中表明，当以2:1组合时，中和活性从5337提高到
16188，HuB毒株的中和抗体水平比单独的HuB毒株疫苗提高了大约3倍，南非毒株的中和抗
体水平从629提高到了3658，提高了大约5倍。此外，实验也表明对Delta突变株也具有非常
好的免疫保护作用，这个效果是意想不到的，更说明了该两价疫苗具有广谱性，这样开发疫
苗的成本将会降低很多基于此。因此，有理由相信，对于其他类型的突变株，本发明的二价
疫苗同样具有协同保护作用。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的阐述，以更有利于理解本发明，但并不构成对本发明的限制。

[0024] 实验方案和过程，如果没有特别说明，按常规操作方法。

[0025] 实施例一、佐剂配置及优化

[0026] 1、佐剂配方

[0027] 由于参考的阳性对照MF59佐剂主要成分为角鲨烯，吐温80，司盘85，缓冲液为柠檬酸体系，除此以外，重组表达的新冠蛋白，经过初步研究表明，在PH5.6左右的醋酸钠缓冲体
系中更加稳定，因此，分别进行了柠檬酸缓冲体系和醋酸钠缓冲体系的佐剂优化，同时，增
加了和吐温80有类似蛋白保护功能的SDS、SolutolHS‑15和RH40的研究。

[0028] 佐剂的配置佐剂试验配方如下表：

[0029]

[0030] 称取角鲨烯和吐温‑80和司盘‑85、或/和SDS，搅拌混合均匀，作为油相。加入醋酸‑醋酸钠溶液水相中。将油相和水相混匀，分别经分散机搅拌，1000～10000转/分钟，搅拌5～
20分钟，形成初乳，再经微射流仪器500～3000bar处理1～5个循环均质，得精乳。

[0031] 2、小鼠免疫和中和抗体检测

[0032] 将HuB毒株重组蛋白(其制备方法见202110659137.8)分别与上述佐剂组合分别混合，并免疫小鼠。采购100只6‑8周雌性BALB/c小鼠，随机分成2组(实验组和阴性对照组)，每
组10只。每只小鼠肌肉免疫1ug蛋白。隔两周加强免疫一次，共免疫两次。从第一次免疫开
始，隔两周采集小鼠血液，离心取上清，进行中和抗体滴度检测。

[0033] 中和抗体滴度检测采用新冠病毒假病毒中和法，实验方法如下：

[0034] (1)细胞准备：实验前一天，将约为1x104个细胞/孔的接种量把待感染细胞接种于96孔细胞培养板中。

[0035] (2)假病毒感染：取出冻存的假病毒置融化，待完全融化后，吸取所需量假病毒加入细胞培养体系中感染目的细胞，病毒感染后6‑8H后更换新鲜培养基继续培养。

[0036] (3)感染检测：细胞感染假病毒48‑72H后,通过观察检测荧光素酶的活性判定感染效率。

[0037] (4)以抑制50％的感染时血清的最大稀释倍数作为中和抗体滴度。结果如下表。

[0038]

[0039]

[0040] 中和抗体实验结果表明，二免二周后的小鼠血清，佐剂处方5、8、9，这三种处方的中和抗体水平最高，滴度能达到6000左右，而3、6、7、10号佐剂处方和阳性对照MF59佐剂的
中和抗体水平相当，均约为3500左右。佐剂处方1、2、4的中和抗体水平明显比其他处方的中
和抗体水平低。

[0041] 3、小鼠细胞免疫水平检测

[0042] (1)ELISPOT包被：每孔加入20μl的70％乙醇预湿PVDF膜、甩干。用无菌PBS洗涤，每孔加入100μl，洗涤2次去除乙醇。用灭菌PBS稀释包被抗体，每孔加入100μl已稀释好的包被
抗体(终浓度10μg/ml)到各实验孔。4℃包被过夜或室温包被2小时。

[0043] (2)封闭：倾倒包被液，用无菌PBS洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。每孔加入200μl细胞培养液封闭，室温孵育1小时。

[0044] (3)细胞培养：倾倒封闭液，须洗涤，直接加入准备好的细胞。(初次进行试验，应作刺激物浓度梯度、和/或细胞计数梯度预实验)实验组孔加入细胞和刺激物，阳性对照组每
孔加入10μl PHA(PHA终浓度1‑4ug/mL)，阴性对照组每孔只加细胞。37℃二氧化碳培养箱中
培养16‑24h。

[0045] (4)检测：用PBS/0.05％Tween‑20洗板3次。甩干,用抗体稀释液(PBS+1％BSA)稀释检测抗体。每孔加入1：1000稀释好的生物素记检测抗体100μl，室温孵育2h。用PBS/0.05％
Tween‑20洗板3次。甩干,用抗体稀释液(PBS+1％BSA)稀释酶亲和素，每孔加入1：1000稀释
好的酶亲和素，室温孵育1h。

[0046] (5)显色：用PBS/0.05％Tween‑20洗板3次，PBS洗板1次。拍干。加入50μl BCIP·NBT显色液。室温静置15‑45min，注意避光。

[0047] (6)终止显色，自来水冲洗板子，室温干燥后在倒置显微镜下观察结果，进行斑点计数，结果如下表。

[0048]

[0049]

[0050] ELISPOT法检测细胞因子IFN‑r和IL‑2，结果表明5，8，9这三种佐剂处方和阳性对照MF59佐剂有明显的阳性，表明有细胞免疫。而其它处方均为阴性，表明没有细胞免疫。

[0051] 通过以上十种佐剂处方的研究，由于8号佐剂用的醋酸钠缓冲液体系更佳适合新冠疫苗蛋白的稳定，并且中和抗体和细胞免疫水平综合最高，因此选择其中8号处方作为新
冠疫苗的佐剂，并且命名为KL02佐剂。

[0052] 实施例二、不同佐剂对新冠疫苗中和抗体水平的影响

[0053] 将HuB毒株重组蛋白(其制备方法见202110659137.8)分别与不同佐剂组合分别混合，并免疫小鼠。每组10只。每只小鼠肌肉免疫1ug蛋白。隔两周加强免疫一次。从第一次免
疫开始后三周采集小鼠血液，离心取上清，进行假病毒法中和抗体滴度检测和ELISPOT法细
胞因子检测。第二次免疫后两周收集小鼠血清，进行假病毒分中和抗体检测。

[0054]

[0055] 结果表明，在二次免疫后二周收集的血清中，KL02佐剂和MF59佐剂组的中和活性明显比氢氧化铝佐剂，磷酸铝佐剂和CpG佐剂组高。

[0056]

[0057] 结果表明，在一次免疫后三周收集的血清中，KL02佐剂和MF59佐剂组的细胞因子为阳性，而氢氧化铝佐剂，磷酸铝佐剂和CpG佐剂组均为阴性，表明KL02佐剂和MF59佐剂组
具有细胞免疫，而其他佐剂组没有细胞免疫。

[0058] 实施例三、抗原剂量的研究

[0059] 将HuB毒株重组蛋白(其制备方法见202110659137.8)分别与KL02佐剂或氢氧化铝佐剂混合，并免疫恒河猴。KL02佐剂组设两个剂量，分别免疫4只猴子，氢氧化铝佐剂组设一
个剂量，共计12只恒河猴。隔4周加强免疫一次，共免疫三次。分别在二次和三次免疫后收集
血清，用新冠HuB毒株活病毒，采用新冠活病毒中和抗体检测法检测中和抗体。

[0060] 新冠活病毒中和抗体检测方法：采用细胞病变效应(cytopathic efficiency)检测方法检测50％活病毒中和抗体滴度。血清样品在56℃孵育灭活30min。Vero E6细胞按
4
1x10/孔接种后在96孔板上培养18～24h。第二天，将灭活后血清按每级3倍进行梯度稀释，
每个稀释度重复6次。取70μL已梯度稀释的血清，在96孔板中与70μL 140TCID50新冠病毒混
合，37℃(5％CO2)孵育2h，然后取100μL混合液加入到铺满Vero E6细胞的96孔板中，孵育培
养4天。在显微镜下观察记录每孔的细胞毒性效应，采用Reed‑Muench法计算确定能抑制
50％细胞样品发生病变的血清最大稀释倍数，作为其中和抗体滴度。

[0061]

[0062] (备注：此次实验血清最高稀释倍数为1:128，结果为1:128的血清实际中和抗体滴度水平要超过1:128。)

[0063] 结果表明，所有处理三次免疫后血清中和抗体滴度均比二次免疫后中和抗体滴度高，表明本疫苗3次免疫比2次免疫效果更佳；三次免疫后血清，KL02佐剂组的低剂量和高剂
量的中和抗体滴度比氢氧化铝佐剂组明显的高，而且KL02佐剂组20μg抗原免疫的实验结果
表明，4只猴子中2只抗体滴度为64，两只为128，而60μg抗原免疫组，4只猴子的抗体滴度均
为128，说明60μg抗原免疫组效果更佳；除此以外，5号恒河猴二免二周时只有16，但是到三
免二周时就能达到128，表明60μg剂量能更大的消除个体差异。因此，剂量选择，优选60μg，
可以提供更好的中和抗体保护。

[0064] 实施例四、二价新冠疫苗的抗原配比研究

[0065] 将不同比例的HuB毒株和南非株的重组蛋白(其制备方法分别见202011454175.1和202110659137.8)分别与KL02佐剂分别混合，并免疫小鼠。每组10只。每只小鼠肌肉免疫
共计3μg蛋白。隔两周加强免疫一次。从第三次免疫开始后二周采集小鼠血液，离心取上清，
进行假病毒法中和抗体滴度检测。

[0066]

[0067] 实验结果表明，HuB毒株：南非株的抗原配比为2:1时中和抗体滴度最高。同时结果表明，两个蛋白组分组成二价疫苗后，对流行株和南非株均能提供防护，而且除了增加了疫
苗的广谱性外，实验结果表明两者中和抗体水平还具有协同增强作用，2:1组合时，中和活
性抗体滴度从1:5337提高到了1:16188，流行株假病毒的中和抗体水平比单独的流行株疫
苗提高了大约3倍，南非株假病毒的中和抗体水平从1:629提高到了1:3658，提高了大约5
倍。

[0068] 结合恒河猴的剂量实验，本发明确定两价疫苗中，采用HuB毒株：南非毒株为2:1，分别为60μg:30μg的配比和剂量为较佳的剂量配比，每剂疫苗为0.5ml。

[0069] 实施例五、二价新冠疫苗对其他型的协同保护作用

[0070] 将实施例四中确定好抗原配比的抗原(HuB毒株：南非株的抗原配比为2:1)与KL02佐剂混合，并免疫小鼠10只。每只小鼠肌肉免疫共计3μg蛋白。隔两周加强免疫一次。从第三
次免疫开始后二周采集小鼠血液，离心取上清，用新冠活病毒中和抗体检测法检测中和抗
体，所列数值为平均值。

[0071]

[0072] 从上述列表数据可知，二价疫苗免疫小鼠之后，除了对HuB毒株，南非突变毒株有保护作用外，对Delta突变株也具有非常好的免疫保护作用，这个效果是意想不到的，说明
该两价疫苗具有广谱性，这样开发疫苗的成本将会降低很多。