一种用于预防阿尔兹海默症的核桃多肽及其应用转让专利
申请号 : CN202111312857.3
文献号 : CN113845566B
文献日 : 2022-11-01
发明人 : 申烨华 , 林立钶 , 李聪 , 李婷婷 , 陈邦
申请人 : 西北大学
摘要 :
本发明公开了一种用于预防阿尔兹海默症的核桃多肽及其应用，所述核桃多肽自N端到C端的氨基酸序列为Glu‑Pro‑Glu‑Val‑Leu‑Arg。本发明从核桃粕提取核桃蛋白，用胰蛋白酶对核桃蛋白进行酶解得到核桃多肽，1 kDa超滤膜分离后用LC‑MS/MS鉴定多肽的组成。根据液质结果及分子对接模拟多肽与乙酰胆碱酯酶的相互作用，筛选出1条具备改善记忆功效的多肽。通过小鼠实验证明了其可有效改善D型半乳糖带来的脑力损伤，证实其具有预防阿尔兹海默症（AD）的潜力。脑组织HE染色、体外抗氧化实验验和分子对接模拟证实其可减少海马区蛋白斑块、降低体内氧化应激和抑制乙酰胆碱酯酶活性、预防AD。另外，本发明从核桃粕中酶解制备核桃多肽，不仅步骤简便，而且有利于提升核桃价值。
权利要求 :
1.核桃多肽在制备预防阿尔兹海默症药物中的应用，所述核桃多肽自N端到C端的氨基酸序列为Glu‑Pro‑Glu‑Val‑Leu‑Arg。
说明书 :
一种用于预防阿尔兹海默症的核桃多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种来源于核桃粕的可预防阿尔兹海默症的多肽。
背景技术
[0002] 学习和记忆功能是大脑的高级功能，是人类生存的必备能力之一，一直受到高度重视。学习记忆功能障碍常是多种疾病的症状，如脑外伤、智力低下、应激性创伤引起的记忆障碍、柯萨可夫综合征、痴呆、一氧化碳中毒等。随着人口老龄化，痴呆症患者的数量迅速增加。阿尔茨海默病（AD）是痴呆症的一种主要形式，给家庭成员和社会带来沉重的精神和经济负担，受到研究人员的广泛重视。《2018年世界阿尔茨海默病报告》指出，全球每三秒就有一例痴呆症病例。2018年，全球有5000万AD患者，预计到2050年将增加两倍。到目前为止，已有多种药物被批准用于轻中度AD，其中包括：多奈哌齐和加兰他敏等。经过研究发现，它们总体的治疗效果是适度的，但是对长期疾病进展没有影响。而且，现有数据不支持这些药物在非常轻微的AD中使用，即早期AD病人中不支持使用。此外，AD患者在出现临床症状前15～20年，其病理就已经在其大脑中积累，AD其实是一种生物疾病的晚期阶段。因此，早期预防或许是不错的AD治疗策略之一。
[0003] 据报道，氧化应激是AD发病机制、疾病进展和逐渐积累的早期变化之一。氧化应激是体内氧化和抗氧化失衡的一种状态，其特征是体内活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等自由基显着增加。随着氧化应激的发生，大量的ROS和RNS在体内蓄积，导致蛋白质氧化和脂质过氧化，引起蛋白质和脂质的结构和功能紊乱。大脑作为耗氧量高的器官，抗氧化能力较弱，容易被自由基破坏。大脑中自由基的增加会直接导致神经元凋亡和突触丢失。降低体内氧化应激水平是治疗和预防AD的好策略。目前，化学合成的抗氧化剂，如：丁基羟基茴香醚（BHA）和丁基化羟基甲苯（BHT），由于其自身的毒性和副作用，不利于人体健康。因此，研发新的利于人体健康的，且拥有抗氧化和改善记忆的产品尤为重要。
[0004] 此外，在AD过程中还表现为乙酰胆碱（ACh）的大量丢失，ACh在神经信号的传导中起重要作用。ACh在胆碱乙酰转移酶（ChAT）的催化下由胆碱和乙酰辅酶A合成，并在乙酰胆碱酯酶（AChE）的作用下迅速水解为胆碱和乙酸。在AD过程中，ACh的合成和水解平衡被打破，导致ACh水平显著下降。因此，AChE也成为治疗和预防AD的主要靶点。
[0005] 核桃（Juglans regia L.）是胡桃科胡桃属植物，与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃仁中丰富的油脂含量（65.8%）以及多种不饱和脂肪酸，使得核桃可作为植物油的来源之一。核桃仁榨油后，大部分油脂被榨出，余下核桃粕为副产物。核桃粕中含有大量的蛋白质，氨基酸种类齐全，具有抗氧化、提高免疫、改善智力等生物活性，是活性多肽的优良来源。但是大多数核桃粕都被用作饲料或者直接丢弃，不仅造成核桃蛋白资源的浪费，也严重阻碍了核桃产业的发展。
发明内容
[0006] 为了解决上述问题，本发明以核桃粕为原料，经脱脂后，采用碱提酸沉法提取脱脂核桃粕中的蛋白，再用胰蛋白酶酶解得到核桃多肽酶解产物，使用1 kDa超滤膜超滤后，滤液采用液相色谱‑质谱联用技术（LC‑MS/MS）鉴定核桃多肽的序列，并利用分子对接技术筛选具备预防阿尔兹海默症多肽功效的片段，针对对接得分最低的多肽进行人工合成并验证其功效。
[0007] 本发明提供的预防阿尔兹海默症的核桃多肽，其自N端到C端的氨基酸序列为：Glu‑Pro‑Glu‑Val‑Leu‑Arg，以下简称为EPEVLR。
[0008] 本发明核桃多肽可用于制备预防阿尔兹海默症的药物。在使用该核桃多肽时，可通过人工合成或核桃粕酶解后分离纯化获得。
[0009] 本发明的有益效果如下：
[0010] 本发明以核桃粕为原料，采用胰蛋白酶对核桃蛋白进行酶解，得到核桃多肽。通过LC‑MS/MS测定其多肽序列，并利用分子对接技术筛选具备预防阿尔兹海默症功效的片段，筛选出1条打分最好的核桃多肽，然后通过固相人工合成该核桃多肽进行动物活体实验，验证其改善记忆的能力。根据脑部海马区HE染色结果，证实了EPEVLR可从减少海马区蛋白斑块方面预防AD；根据体外抗氧化实验结果（IC50=1.44 mg/mL），验证EPEVLR从降低氧化应激方面预防AD的潜力。进一步通过分子对接技术对EPEVLR与AChE进行分子对接，分析其相互作用的关键氨基酸及作用力，为核桃粕的深度开发利用奠定了理论基础。分子对接结果表明，EPEVLR与AChE之间主要通过π‑σ、π‑烷基键以及氢键相连接。另外，本发明从核桃粕中酶解制备核桃多肽，不仅步骤简便，而且有利于提升核桃价值。
附图说明
[0011] 图1是水迷宫实验中小鼠穿越平台次数。
[0012] 图2是水迷宫实验中小鼠在平台所在象限路程占比。
[0013] 图3是水迷宫实验中小鼠在平台所在象限有效停留时间。
[0014] 图4是跳台实验中小鼠的错误次数。
[0015] 图5是跳台实验中小鼠的第一次潜伏期。
[0016] 图6是脑组织海马区HE染色切片图，模型组（左）和EPEVLR组（右）。
[0017] 图7是EPEVLR与AChE分子对接2D图。
[0018] 图8是EPEVLR与AChE分子对接3D图。
具体实施方式
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
[0020] 实施例1
[0021] （1）核桃粕预处理
[0022] 将核桃粕用高速粉碎机粉碎成核桃粕粉，按照料液比为 1 g:5 mL，将核桃粕粉加入正己烷中，室温下搅拌 40 min、抽滤，该操作重复两次；室温过夜风干以除去多余的正己烷，获得脱脂核桃粕，4 ℃保存。
[0023] （2）提取核桃蛋白
[0024] 按照料液比为1 g:10 mL，将脱脂核桃粕加入蒸馏水中，搅拌均匀，使用1 mol/L NaOH水溶液调节pH至9.0，超声处理10 min后，于45 ℃水浴搅拌浸提30 min，静置冷却，8000 rpm下离心15 min，收集滤液，用1 mol/L HCl 水溶液调pH至4.5从滤液中沉淀蛋白，4 ℃下放置4 h，4 ℃ 8000 rpm下离心15 min，收集沉淀物用1 mol/L NaOH水溶液或HCl水溶液调节pH至7.0，冷冻干燥，得到核桃粕蛋白质粉，保存于‑80 ℃。
[0025] （3）核桃蛋白的酶解
[0026] 按照料液比为1 g:25 mL，将核桃粕蛋白质粉加入去离子水中，85 ℃加热预处理20 min，冷却后，用1 mol/L NaOH水溶液或HCl水溶液调pH至9，加入核桃粕蛋白质粉质量4%的胰蛋白酶，在55 ℃的水浴锅中酶解4 h。酶解过程中，使用0.5 mol/L NaOH水溶液控制pH为9.0 ± 0.1。酶解结束后，于90℃水浴锅中灭酶10 min后，10000 rpm离心10 min收集上清液，使用截留分子量为1 kDa的超滤膜对上清液进行超滤，对分子量范围为＜1 kDa的滤液进行LC‑MS/MS分析，鉴定出3080条不同序列的多肽，根据软件打分（ALC%＞95%），相对含
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量（Area＞1×10），筛选出144条多肽。然后，筛选出多肽序列中谷氨酸（Glu，E）、精氨酸（Arg，R）、色氨酸（Trp，W）和酪氨酸（Tyr，Y）的含量高的10条确定序列的核桃多肽。最后，利用分子对接技术模拟多肽与乙酰胆碱酯酶的相互作用（其结果见表1，对接分数越低说明多肽与乙酰胆碱酯酶相互作用越强），筛选出一条对接效果最佳的多肽序列，其自N端到C端的氨基酸序列为：Glu‑Pro‑Glu‑Val‑Leu‑Arg，EPEVLR。
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量（Area＞1×10），筛选出144条多肽。然后，筛选出多肽序列中谷氨酸（Glu，E）、精氨酸（Arg，R）、色氨酸（Trp，W）和酪氨酸（Tyr，Y）的含量高的10条确定序列的核桃多肽。最后，利用分子对接技术模拟多肽与乙酰胆碱酯酶的相互作用（其结果见表1，对接分数越低说明多肽与乙酰胆碱酯酶相互作用越强），筛选出一条对接效果最佳的多肽序列，其自N端到C端的氨基酸序列为：Glu‑Pro‑Glu‑Val‑Leu‑Arg，EPEVLR。
[0027] 表1 多肽与乙酰胆碱酯酶的对接结果
[0028]多肽序列 对接分数 (kcal/mol)
ELEWER ‑7.8
ETASELPR ‑7.8
LADSFR ‑7.7
LNQLPR ‑7.5
EELEELFR ‑8.3
EPEVLR ‑8.6
FVPTER ‑8.2
VEDELR ‑7.3
LLTHDSR ‑8.5
SGFDEEFLR ‑8.1
ELEWER ‑7.8
ETASELPR ‑7.8
LADSFR ‑7.7
LNQLPR ‑7.5
EELEELFR ‑8.3
EPEVLR ‑8.6
FVPTER ‑8.2
VEDELR ‑7.3
LLTHDSR ‑8.5
SGFDEEFLR ‑8.1
[0029] （4）固相合成多肽
[0030] 采用Fmoc固相多肽合成策略进行多肽EPEVLR的合成，以 Fmoc‑AA‑Wang 树脂为起始固相载体，无水 DMF 为反应溶剂，利用乙醇胺除去氨基末端 Fmoc 保护基，HBTU、HoBt 及 N‑甲基吗啉为活化剂，活化 Fmoc保护氨基酸的羧基，并与树脂上游离的氨基偶联。偶联结束后，采用三氟乙酸脱掉侧链保护基，并从树脂上裂解得到游离多肽。利用半制备反相液相色谱纯化固相合成多肽，反相液相色谱的流动相为：A: 0.1% TFA/水，B: 0.1% TFA/乙腈，流动相条件为：0%～90% B/30 min～90% B/10 min，色谱柱为：依利特5 μm 10.0 mm ×250 mm C18，进样量为100 μL，流速为1 mL/min，检测波长为220 nm，利用 LC‑MS/MS鉴定组分的氨基酸序列。
[0031] （5）核桃多肽预防AD活性的测试
[0032] 通过小鼠实验验证核桃多肽预防AD的活性。小鼠隔离检疫一周并进行适应性饲养，随机分组，主要有3组：正常对照组、模型组、多肽组。模型组和核桃多肽组小鼠先进行D型半乳糖（D‑gal）造模处理，两组小鼠接受500 mg/kg/d连续皮下注射8周，自第5周开始，模型组同时灌胃生理盐水，多肽组同时灌胃核桃多肽EPEVLR。正常组自由进食。饲养结束后，通过行为学实验验证核桃多肽预防AD的功效。
[0033] 行为学实验：小鼠的行为学实验主要分为跳台实验和水迷宫实验。训练四天后，开始测试。跳台实验结束30 min后开始水迷宫实验。
[0034] 水迷宫实验：水迷宫直径1.2 m，高0.5 m，站台直径0.09 m，高0.3 m，站台隐藏于水面之下1 cm左右。向水池内注入自来水，水池的温度需要维持在23℃左右。参数设定为：游泳时间（60 s）、平台上停留时间（10 s）、选择小鼠实验模式，调整红线圆圈使之分别准确框定水池及平台范围。选择平台所在象限的对位象限为研究象限，将小鼠放入水中，立即用软件记录小鼠自入水、寻找平台到稳定爬上平台所需时间。小鼠若能在60 s内爬上站台并稳定站立3 s，记录使用时间；若入水后60 s内未能找到站台则记录潜伏期为60 s，并将小鼠引导上站台稳定站立15 s后拿下来，休息30～60 s再进行下一次训练，训练完成注意擦拭干小鼠毛发。
[0035] 跳台实验：跳台为长方形反射箱，共有八个区域，底部铺以可通适当的电流的铜栅。每个小的区间有一个高和直径均为4.5 cm的小平台。设置参数为：时间（5 min）、刺激强度（0.6 mA）。将小鼠放在铜栅上，待其情绪稳定后通电，记录每只小鼠受到电击的次数（错误次数），第一次跳下的时间（潜伏期）。
[0036] （6）小鼠脑组织海马区HE染色
[0037] 小鼠经过行为学活性测试后，处死前12 h对小鼠进行断食但不断水操作。浓度为2%～3%异氟烷对小鼠进行吸入式麻醉。小鼠麻醉后，断颈椎处死。小心地取小鼠大脑组织出来，用生理盐水冲洗，将其放置在4%多聚甲醛溶液中进行后固定。固定后，使用石蜡对其进行包埋处理，获得组织石蜡包埋蜡块。然后对石蜡块进行切片，设置切片厚度为4 μm。最后，使用苏木素（Hematoxylin）‑伊红（Eosin）染色法组织切片染色，在显微镜明场下面观察。
[0038] （7）抗氧化活性的测试
[0039] 取不同浓度多肽与DPPH溶液（5 mg/100 mL，无水乙醇配制）等体积混合，室温避光静置30 min，517 nm测定吸光值；用2 mL 无水乙醇溶液代替DPPH溶液为样品参比组；空白组为2 mL DPPH溶液与2 mL去离子水。样品的DPPH自由基清除活力根据下式进行计算：
[0040]
[0041] 式中A0为空白组吸光度值；A为样品组吸光度值；B为参比组吸光度值。
[0042] （8）分子对接
[0043] AChE（PDB ID：1gqr）从PDB蛋白数据库下载，使用Autodock tools1.5.6软件对受体AChE进行加氢、去除水分子等。采用ChemDraw3D 18.1绘制鉴定出的小分子多肽结构，将小分子结构能量最小化后转化为pdbqt格式文件。
[0044] Autodock Vina作为对接软件，对接中心坐标设置为（x: 3.302，y: 65.556，z: 63.181），盒子大小为（x: 40，y: 40，z: 40）。软件会将多肽分别与AChE受体蛋白进行对接，并对配体的不同构象与AChE的晶体结构进行契合度计算并且依次进行打分，对接能一般为负值，值越小表明对接结果得分越高，即配体与AChE受体蛋白之间的结合越紧密，相互作用最强，越可能具有AChE抑制活性。随后，采用Discovery studio软件对单个小分子与配体之间的相互作用进行可视化分析。
[0045] （9）实验结果
[0046] 小鼠水行为学结果如图1～5所示，模型组通过D‑gal造模后，其水迷宫实验中穿越平台次数、平台所在象限路程占比以及平台所在象限有效停留时间交空白对照组均明显降低，跳台实验中错误次数明显增加，第一次潜伏期也明显低于空白组，表明小鼠老化模型造模成功。然而，多肽EPEVLR灌胃后的小鼠，其行为学实验相关指标均十分接近空白对照组，表明EPEVLR具有预防AD的功效。
[0047] 小鼠行为学结束后，取其脑部组织进行HE染色，观察海马区蛋白斑块的数量，结果如图6所示，灌胃EPEVLR多肽小鼠脑部海马区的蛋白斑块数量明显低于模型组，表明EPEVLR可从减少脑部蛋白斑块方面预防AD。此外，从EPEVLR的体外抗氧化测定结果为IC50=1.44 mg/mL，表明EPEVLR拥有较好的抗氧化性质，可从减少小鼠氧化应激的方面预防AD。EPEVLR和乙酰胆碱酯酶的分子对接结果如图7和图8所示，分子对接分数为‑8.6，低的对接分数表明EPEVLR可有效抑制小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的活性，有助于提升乙酰胆碱含量。其中，AChE的Asn‑85、Asp‑72、Aer‑81、Tyr‑121、Ser‑286、Trp‑279和Leu‑282可以与EPEVLR上侧链的H原子以及N端和C端的N和O原子形成以氢键结合；Phr‑330与EPEVLR上吡咯环形成π‑σ共轭；Phe‑331、Ile‑287、His‑440和Ttrp‑279与EPEVLR以π‑烷基键连接。