一种南极磷虾组织蛋白酶及其异源表达方法

摘要

本发明属于一种南极磷虾组织蛋白酶及其异源表达方法，属于分子生物学领域，所述酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。所述组织蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了所述组织蛋白酶的异源表达方法，获得了具有酶活性的组织蛋白酶，所述组织蛋白酶是导致南极磷虾自溶的关键酶，本发明为下一步开发防止南极磷虾自溶的试剂提供了基础。

权利要求

1.一种南极磷虾组织蛋白酶，其特征在于所述酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种南极磷虾组织蛋白酶，其特征在于所述组织蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述组织蛋白酶的制备方法，其特征在于所述方法具体如下：（1）以PET‑28a空载为载体骨架，构建片段序列：NcoI‑‑ATG‑‑sfGFP‑15‑‑3C‑‑南极磷虾组织蛋白酶CLP‑‑Xho1‑‑His tag‑‑Stop codon；

（2）将PET28a‑sfGFP‑3c‑CLP质粒转入BL21(DE3)，放入37℃培养箱24h后，用蓝光仪照射菌板，观察菌落是否有荧光；

（3）挑取3‑5个有荧光单菌落接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6‑

0.8，取各1ml菌液分别500 μ l 保菌和500 μ l 离心弃上清留菌体，制作上样样品留最后进行SDS‑PAGE分析，剩下加入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16‑18 h；

（4）取诱导后菌液500 μ l ，离心弃上清留菌体，制作上样样品进行SDS‑PAGE分析；

（5）挑取蓝光仪照射有荧光的单菌落接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为

0.6‑0.8，取菌液接入1L LB液体培养基进行转接，37℃培养至OD600为0.6‑0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16‑18 h，收集菌体；

（6）用破菌buffer 清洗菌体，再重悬菌体，加入体积比1%的PMSF，置于冰上超声破菌，功率300‑400w，超声处理2s间隔4s，破菌至重悬菌液澄清透光，液体无混沌状；

（7）向破菌后的液体中加入千分之一体积的PMSF，离心，将上清收集至离心管，加入终浓度为10mM的咪唑，0.45μm滤膜过滤，4℃待用；

（8）用破菌buffer平衡Ni‑NTA珠的纯化柱：3倍珠体积破菌buffer洗2次，再用3倍珠体积含有10mM咪唑的破菌buffer洗1次；

（9）将上清取样后加入柱中，于4℃用静音混合器孵育1‑2h；沉淀加水或buffer重悬，取样，制作SDS‑PAGE分析上样样品；

（10）垂直静置至珠子平铺于底部，打开盖子使柱内液体在重力作用下流出，收集流穿液取样；依次用含有不同浓度咪唑的破菌buffer洗脱,分别单独收集这些洗脱液，静置3‑5分钟后收集溶液，取样，制作上样样品进行SDS‑PAGE分析；

（11）收集目的蛋白较纯的梯度，用超滤管浓缩，用储存buffer超滤换液去除咪唑；

（12）检测浓缩蛋白液的纯度，进一步使用分子筛除杂，加入终浓度为10%‑20%的甘油冻存于‑80℃。

说明书

一种南极磷虾组织蛋白酶及其异源表达方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体的涉及一种南极磷虾组织蛋白酶及其异源表达方法。

背景技术

[0002] 南极磷虾分布于南极大陆，年可捕捞量0.13‑1亿吨。南极磷虾含有营养价值极其丰富的蛋白质、磷脂、不饱和脂肪酸等成分，已经成为最富有开发潜力的海洋生物资源之
一。南极磷虾体内具有高效的蛋白酶系统，被捕捞死亡后，肌肉组织在蛋白酶的作用下迅速
发生自溶，严重影响了南极磷虾的品质。现有有技术还没有发现具体是哪些酶导致南极磷
虾自溶。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题在于提供一种南极磷虾组织蛋白酶及其异源表达方法。用荧光定量方法确定了导致南极磷虾自溶的关键蛋白酶为组织蛋白酶CLP；采用Race等分
子生物学方法，获得了组织蛋白酶CLP的氨基酸序列，并在大肠杆菌中进行了可溶性活性表
达，为该蛋白酶的抑制剂筛选和解决南极磷虾自溶的影响奠定了基础。

[0004] 本发明是通过如下技术方案来实现的：

[0005] 一种南极磷虾组织蛋白酶，所述酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。具体如下：atgcgcagcataacggtggcagccttcctggctgtgatagcatgtgcttctgctgtctcattcttttctgtggcattaga
agaatttgaagggtataagcttgagcatgggaagaaatacgattctgatgtagaggaacagttccgtatgaaaatt
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catgtgtggtattgcatctgctgcatcattcccacttgtgtag。

[0006] 上述组织蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2，具体如下：

[0007] MRSITVAAFLAVIACASAVSFFSVALEEFEGYKLEHGKKYDSDVEEQFRMKIYMENKHKIAKHNMLFHSEPQQKKYHLRMNKYGDLLHNEFVSMMNGWIGNNTGGSYKENRLHHGATFIEPDNDVLMPKNVDWRDKGAVTPVKD
QGQCGSCWSFSATGSLEGQHFRKTGDLVSLSEQNLIDCSVKYGNNGCNGGLMDYAFKYVKDNKGIDKEDSYPYEAM
DDTCRYSPDESGADDTGFVDVREGSEHALKKALATKGPVSVAIDASHESFQFYNHGVYADPECTAENLDHGVLAVG
YGITEDGDDFWLVKNSWGTTWGDEGYVKIARNQDNMCGIASAASFPLV。

[0008] 本发明还提供一种所述组织蛋白酶的制备方法，具体方法如下：

[0009] （1）以PET‑28a空载为载体骨架，构建片段序列：NcoI‑‑ATG‑‑sfGFP‑15‑‑3C‑‑南极磷虾组织蛋白酶CLP‑‑Xho1‑‑His tag‑‑Stop codon；

[0010] （2）将PET28a‑sfGFP‑3c‑CLP质粒转入BL21(DE3)，放入37℃培养箱24h后，用蓝光仪照射菌板，观察菌落是否有荧光；

[0011] （3）挑取3‑5个有荧光单菌落接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6‑0.8，取各1ml菌液分别500ul保菌和500ul离心弃上清留菌体，制作上样样品留最后进
行SDS‑PAGE分析，剩下加入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16‑18 h；

[0012] （4）取诱导后菌液500ul，离心弃上清留菌体，制作上样样品进行SDS‑PAGE分析；

[0013] （5）挑取蓝光仪照射有荧光的单菌落接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6‑0.8，取菌液接入1L LB液体培养基进行转接，37℃培养至OD600为0.6‑0.8，加
入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16‑18 h，收集菌体；

[0014] （6）用破菌buffer 清洗菌体，再重悬菌体，加入体积比1%的PMSF，置于冰上超声破菌，功率300‑400w，超声处理2s间隔4s，破菌至重悬菌液澄清透光，液体无混沌状；

[0015] （7）向破菌后的液体中加入千分之一体积的PMSF，离心，将上清收集至离心管，加入终浓度为10mM的咪唑，0.45μm滤膜过滤，4℃待用；

[0016] （8）用破菌buffer平衡Ni‑NTA珠的纯化柱：3倍珠体积破菌buffer洗2次，再用3倍珠体积含有10mM咪唑的破菌buffer洗1次；

[0017] （9）将上清取样后加入柱中，于4℃用静音混合器孵育1‑2h；沉淀加水或buffer重悬，取样，制作SDS‑PAGE分析上样样品；

[0018] （10）垂直静置至珠子平铺于底部，打开盖子使柱内液体在重力作用下流出，收集流穿液取样；依次用含有不同浓度咪唑的破菌buffer洗脱,分别单独收集这些洗脱液，静置
3‑5分钟后收集溶液，取样，制作上样样品进行SDS‑PAGE分析；

[0019] （11）收集目的蛋白较纯的梯度,用超滤管浓缩，用储存buffer超滤换液去除咪唑；

[0020] （12）检测浓缩蛋白液的纯度，进一步使用分子筛除杂，加入终浓度为10%‑20%的甘油冻存于‑80℃。

[0021] 本发明与现有技术相比的有益效果：

[0022] 本发明发现了导致南极磷虾自溶的关键酶组织蛋白酶，并成功进行了异源表达，获得了具有酶活性的组织蛋白酶，为下一步开发防止南极磷自溶的试剂提供了研究基础。

附图说明

[0023] 图1为3个不同捕捞群体南极磷虾的5种蛋白酶基因表达量的检测；A、南设得兰群岛南部海域CCAMLR 48.1的群体，B、南设得兰群岛南部海域CCAMLR 48.2的群体，C、南设得
兰群岛南部海域CCAMLR 48.3的群体；

[0024] 图2为SDS‑PAGE检测在不同浓度咪唑洗脱的蛋白纯化情况（8%胶）；

[0025] 图3为组织蛋白酶3个阳性克隆菌株酶解牛奶的实验。

具体实施方式

[0026] 下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

[0027] 实施例1

[0028] 1、南极磷虾RNA的提取，高通量测序及蛋白酶基因片段的获取。

[0029] 本实施例是基于不同捕捞区域的3组南极磷虾样本的总RNA，进行了转录组高通量测序，获取了线粒体加工蛋白酶（MMP）、组织蛋白酶（CLP）、ATP依赖蛋白酶（ATP）、二肽酶及
羧肽酶5种蛋白酶的基因片段。所述的3个不同捕捞区域为南设得兰群岛南部海域CCAMLR 
48.1（A）、48.2(B)和48.3(C) 。

[0030] 2、荧光定量PCR确定导致南极磷虾自溶的关键蛋白酶。

[0031] 将获取的五种蛋白酶基因设计相应的引物，以真核生物18SRNA基因为内参，引物序列如表1，进行了5种蛋白酶基因的表达量的检测，用（SYBR Green）荧光定量试剂盒（天根
生化科技有限公司，北京）按照说明书在MA‑6000实时定量扩增仪上进行qRT‑PCR反应。扩增
长度为126 bp。

[0032] 表1 南极磷虾基因表达分析所用引物

[0033]引物 引物序列 （5’‑3’） 用途
ATP1‑F GGGGTAGTAACATCTGGACTTGGA 定量引物
ATP1‑R CCAGCAGCCAGGAGTAATGAA 定量引物
CBP1‑F GTGTTTACTCTGGCTTGCATCCT 定量引物
CBP1‑R CTGTCTGTTGTCCTCCCACTCTT 定量引物
CLP1‑F CACTCCGAGCCTCAACAGAA 定量引物
CLP1‑R AGAGAACCAGTAGCAGAGAATGACC 定量引物
DP1‑F GGCATACACAGCAATGTTAGAGAAA 定量引物
DP1‑R GACACCCAACAAGTGACCAAGA 定量引物
MMP1‑F AGCCGCAAGCTATGAGCAA 定量引物
MMP1‑R  CGAGAGCCAGTATCAATCCAGAG 定量引物
18S‑F CCTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTA 定量内参引物
18S‑R TGCTTTCGCAGTAGTTCGTCT 定量内参引物

[0034] 实验结果如图1中的A、B、C所示。在三组样品中，组织蛋白酶的表达量都明显高于其它蛋白酶，初步确定组织蛋白酶为导致南极磷虾自溶的关键蛋白酶。

[0035] 3、组织蛋白酶氨基酸序列的获取。

[0036] 采用Race等分子生物学手段，获取了组织蛋白酶CLP的基因序列和氨基酸序列，结果如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。获得的组织蛋白酶的氨基酸序列与红螯螯虾同源比对相
似性为74%。

[0037] 4、南极磷虾组织蛋白酶CLP在大肠杆菌中的可溶性表达

[0038] （一）质粒载体的构建

[0039] 以PET‑28a空载为载体骨架，构建片段序列：NcoI‑‑ATG‑‑sfGFP‑15‑‑3C‑‑南极磷虾组织蛋白酶CLP‑‑Xho1‑‑His tag‑‑Stop codon

[0040] atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgcgcggcgagggcgagggcgatgccaccaacggcaagctgaccctgaagttcatc
tgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagcc
gctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccat
cagcttcaaggacgacggcacctacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatc
gagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaacttcaacagccaca
acgtctatatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccgaatttgaaattcgtcataatgtggaagatgg
cagcgtgcagctggcggatcattatcagcagaataccccgattggcgatggcccagtgctgctgccggatgaccac
tatctgagcaccgaaagcgtgctgagcaaagatccgaatgaagatcgtgatcatatggtcctgctggaatttgtga
ccgcggcaggcattgatctgggcatggatgaactgtataaattggaggttttgttccagggtccaCTAGAAGAATT
CGAAGGATACAAACTAGAACACGGGAAAAAATACGATAGCGATGTGGAGGAGCAGTTTCGTATGAAGATTTACATG
GAGAACAAGCACAAAATCGCGAAGCACAACATGCTGTTCCACAGCGAACCGCAGCAAAAGAAATACCACCTGCGTA
TGAACAAATATGGTGACCTGCTGCACAACGAGTTTGTGAGCATGATGAACGGTTGGATCGGCAACAACACCGGTGG
CAGCTACAAGGAGAACCGTCTGCACCACGGTGCGACCTTCATTGAACCGGACAACGATGTGCTGATGCCGAAAAAC
GTTGACTGGCGTGATAAGGGCGCGGTGACCCCGGTTAAAGACCAGGGTCAATGCGGCAGCTGCTGGAGCTTTAGCG
CGACCGGTAGCCTGGAGGGTCAGCACTTTCGTAAGACCGGTGACCTGGTGAGCCTGAGCGAACAAAACCTGATCGA
TTGCAGCGTTAAATACGGTAACAACGGCTGCAACGGTGGCCTGATGGACTACGCGTTCAAGTATGTGAAAGATAAC
AAGGGCATTGACAAAGAGGACAGCTACCCGTATGAAGCGATGGACGATACCTGCCGTTATAGCCCGGATGAGAGCG
GTGCGGATGATACCGGCTTTGTGGATGTTCGTGAGGGTAGCGAACACGCGCTGAAGAAAGCGCTGGCGACCAAAGG
CCCGGTGAGCGTTGCGATTGACGCGAGCCACGAGAGCTTCCAGTTTTACAACCACGGTGTTTATGCGGACCCGGAG
TGCACCGCGGAAAACCTGGATCACGGCGTGCTGGCGGTTGGTTACGGCATCACCGAGGATGGTGACGATTTTTGGC
TGGTGAAGAACAGCTGGGGCACCACCTGGGGTGACGAAGGCTATGTTAAAATTGCGCGTAACCAAGATAATATGTG
CGGCATTGCGAGCGCGGCGAGCTTCCCGCTGGTTcTCGAGcacCACCACCACCACCACCACTGA。

[0041] （二）CLP蛋白诱导表达与纯化：

[0042] （1）将PET28a‑sfGFP‑3c‑CLP质粒转入BL21(DE3)，放入37℃培养箱24h后，用蓝光仪照射菌板，观察菌落是否有荧光。

[0043] （2）挑取3‑5个单菌落（蓝光仪照射有荧光）接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6‑0.8，取各1ml菌液分别500ul保菌和500ul离心弃上清留菌体，制作上样样品
留最后进行SDS‑PAGE分析，剩下加入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16‑18 h。

[0044] （3）取诱导后菌液500ul，离心弃上清留菌体，制作上样样品进行SDS‑PAGE分析。

[0045] （4）挑取蓝光仪照射有荧光的单菌落接入10ml的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6‑0.8，取4ml菌液接入400ml培养基（1:100进行转接）37℃培养至OD600为0.6‑
0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，18℃诱导16‑18 h，收集菌体。

[0046] （5）用破菌buffer （50 mM Tris‑HCl, 150 mM NaCl，1 mM TCEP, pH 8.0）清洗菌体2次，再重悬菌体至30ml。加入终浓度1mM的PMSF（即重悬菌液的液体百分之一体积1：
100），置于冰上超声破菌，功率300‑400w，超声处理2s间隔4s，总时长视情况而定，破菌至重
悬菌液澄清可透光，液体无混沌状。

[0047] （6）向破菌后的液体中加入千分之一体积的PMSF，4℃13000rpm离心15min或4℃8000rpm离心30min。将上清收集至洁净离心管，加入终浓度为10mM的咪唑，0.45μm滤膜过
滤，4℃待用。

[0048] （7）用破菌buffer平衡Ni‑NTA珠的纯化柱：3倍珠体积破菌buffer洗2次。再用3倍珠体积含有10mM咪唑的破菌buffer洗1次。

[0049] （8）将上清取样后加入柱中，于4℃用静音混合器孵育1‑2h。沉淀可加水或buffer至20ml‑30ml重悬，取样，制作SDS‑PAGE分析上样样品（40ul样液+10ul（ 5xSDS loading 
buffer），100℃煮10min）。

[0050] （9）垂直静置至珠子平铺于底部，打开盖子使柱内液体在重力作用下流出，收集（流穿液）取样。依次用含有不同浓度咪唑（10 mM、20Mm、 50 mM、 300 mM、600mM）的破菌
buffer洗脱，分别单独收集这些洗脱液。10 mM、20mM和50 mM这三个咪唑梯度最少用3倍珠
体积的buffer洗脱，300 mM和600mM咪唑浓度用1倍珠体积的buffer洗脱，都静置3‑5分钟后
收集溶液，取样，制作上样样品进行SDS‑PAGE分析，如图2所示。

[0051] （10）收集目的蛋白较纯的梯度，用超滤管浓缩，用储存buffer（50 mM Tris‑HCl，pH 8.0）超滤换液去除咪唑。

[0052] （11）取10ul（浓缩的蛋白液）+30ul（buffer/ddH2O）+10ul （5xSDS loading buffer）制作上样样品进行SDS‑PAGE分析，若观察超滤的蛋白液很杂，则过一下分子筛除
杂。用酶标仪测蛋白质浓度。加入终浓度为10%‑20%的甘油冻存于‑80℃。

[0053] （三）CLP酶活测定

[0054] CLP南极磷虾组织蛋白经计算蛋白等电点为5.1，为酸性蛋白，检测37℃酶的活性。

[0055] 牛奶平板预测酶活：

[0056] 50ml ddH2O+1.5g琼脂粉与50ml ddH2O+1.5g奶粉分别加热，混合倒入空平板制备牛奶平板，冷凝后滴入10ul待测酶液，放入37℃培养箱30min‑1h，观测是否有水解圈出现，
如有则初步推测蛋白有活性。如图3所示：3个检测区域与buffer区域有明显差别，CLP初步
检测有蛋白酶活性。