用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA、试剂盒及其应用

摘要

本发明属于分子生物学和细胞生物学制备技术领域，公开了一种用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA、试剂盒及其应用，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO.2所示的碱基序列。本发明用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA，敲低效率高，适用于以慢病毒为工具的猪源细胞感染实验操作，可使猪源细胞的慢病毒感染效率得到明显提高，应用前景广阔。

权利要求

1.含有用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA的试剂盒在提高慢病毒感染猪源细胞效率中的应用，其特征在于，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括慢病毒包装质粒；所述慢病毒包装质粒包括pLenti‑gfp、pMD2G和pSPAX2三种环状质粒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢病毒包装时采用摩尔比1:1:1为pLenti‑gfp、pMD2G和pSPAX2的三种环状质粒共转染。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA转染至细胞时要求终浓度为

150nM/μL。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述siRNA转染至细胞时转染时机为慢病毒感染细胞前12h。

说明书

用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA、试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学和细胞生物学制备技术领域，涉及一种用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA、试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 慢病毒属隶属于反转录病毒科，多于巨噬细胞、淋巴细胞内原发感染，经过漫长的潜伏期才使个体表现出明显的临床症状，因其特点，此类病毒被称作慢病毒。常用的慢病毒
载体是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV‑1)，具有广泛感染、有效感染分裂期和静止期细胞，在
宿主染色质中插入大的遗传片段，并长期维持稳定转基因表达等优点，因此成为导入外源
基因的有利工具。受限于慢病毒的感染效率，使慢病毒载体的应用被收到限制。另外，目前
还没有找到能够提高不同细胞感染效率的敲低基因。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA、试剂盒及其应用，基因敲低效率高，可使不同猪源细胞的慢病毒感染效率得到明显提高。

[0004] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0005] 本发明提供一种用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链为SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述siRNA的反义链为SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

[0006] 本发明还提供含有上述的siRNA的试剂盒。

[0007] 优选地，所述试剂盒还包括慢病毒包装质粒；所述慢病毒包装质粒包括pLenti‑gfp、pMD2G和pSPAX2三种环状质粒。

[0008] 优选地，所述慢病毒包装时采用摩尔比1:1:1为pLenti‑gfp、pMD2G和pSPAX2的三种环状质粒共转染。

[0009] 优选地，所述siRNA转染至细胞时要求终浓度为150nM/μL。

[0010] 优选地，所述siRNA转染至细胞时转染时机为慢病毒感染细胞前12h。

[0011] 本发明还提供上述试剂盒在提高慢病毒感染猪源细胞效率中的应用。

[0012] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：

[0013] 本发明用于敲低猪SAMHD1基因表达的siRNA，敲低效率高，适用于以慢病毒为工具的猪源细胞感染实验操作，可使不同猪源细胞(如IPAM、BMDM)的慢病毒感染效率得到明显
提高，应用前景广阔。

附图说明

[0014] 图1为不同siRNA转染敲低猪SAMHD1基因表达效率。

[0015] 图2为siRNA‑5在不同转染终浓度下的敲低效率。

[0016] 图3为siRNA‑5在转染不同时间后的敲低效率。

[0017] 图4为质粒共转染后24h通过荧光倒置显微镜观察到的结果。

[0018] 图5为siRNA‑5的荧光定量PCR扩增曲线。

[0019] 图6为荧光定量PCR熔解曲线。

[0020] 图7为siRNA‑5敲低效率检测结果。

[0021] 图8为IPAM细胞在36hpi时间点的显微成像结果。

[0022] 图9为IPAM细胞在48hpi时间点的显微成像结果。

[0023] 图10为IPAM细胞在60hpi时间点的显微成像结果。

[0024] 图11为IPAM细胞在72hpi时间点的显微成像结果。

[0025] 图12为IPAM细胞在84hpi时间点的显微成像结果。

[0026] 图13为IPAM细胞在96hpi时间点的显微成像结果。

[0027] 图14为IPAM细胞在108hpi时间点的显微成像结果。

[0028] 图15为以MOI＝100接毒的各孔IPAM细胞的流式术细胞分群结果。

[0029] 图16为以MOI＝100接毒的各孔BMDM细胞的流式术细胞分群结果。

具体实施方式

[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如
无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从市场购
得。

[0031] 实施例一猪SAMHD1基因敲低效率检测

[0032] 1.1、siRNA设计

[0033] 根据NCBI数据库已公布的猪SAMHD1基因序列(NM_001292105.1)，设计5对siRNA组合，记为siRNA‑1、siRNA‑2、siRNA‑3、siRNA‑4、siRNA‑5，由上海吉玛制药技术有限公司合
成，序列如表1所示。

[0034] 表1依据猪SAMHD1基因设计的siRNA

[0035]

[0036]

[0037] 1.2、siRNA转染

[0038] 待IPAM细胞密度生长至80％时，使用jetPRIME Polyplus Transfection试剂盒(Ref#114‑15/1.5mL)将siRNA转染至IPAM细胞，分别选取转染终浓度为空白(NC)、50nM/μL、
100nM/μL、150nM/μL和200nM/μL。在siRNA转染后4‑6h将培养基更换为等体积无血清RPMI 
1640培养基。

[0039] 1.3、慢病毒包装

[0040] 1.3.1、各质粒转染体积计算

[0041] 使用NanoDrop one超微量分光光度计测定pLenti‑gfp、pMD2G和pSPAX2三种环状质粒浓度。根据各质粒核酸链长度按照摩尔比1:1:1计算出转染总质量为10μg时，各质粒需
转染的质量，结果如表2所示。制作含有siRNA和三种环状质粒的jetPRIME Polyplus 
Transfection试剂盒。

[0042] 表2转染时各质粒质量

[0043]

[0044] 1.3.2、质粒的共转染

[0045] 将10mL体积293T细胞悬液以2×105/mL密度置于10cm细胞培养皿中，待细胞数生6
长至6×10时，使用jetPRIME Polyplus Transfection试剂盒(Ref#114‑15/1.5mL)将试剂
盒提供质粒按照计算后体积共转染至293T细胞，转染后4h将细胞培养上清更换为10mL无血
清DMEM培养基。

[0046] 1.3.3、慢病毒的收集与储存

[0047] 质粒共转染后48h，将慢病毒包装使用10cm细胞培养皿置于‑80℃冰箱，反复冻融后收集培养皿液相于无菌的15mL离心管中，经2000rpm离心5min后收集上清。将离心所得上
清经过0.45μm滤膜过滤后，分装于无菌的1.5ml微量离心管中，即可使用或保存于‑80℃冰
箱备用。

[0048] 1.4、慢病毒感染IPAM细胞

[0049] 在siRNA转染后12h、24h和36h分别对实验待处理猪源细胞进行慢病毒感染。Lentivirus‑gfp作为目标实验阳性对照。

[0050] 1.4.1siRNA转染以每孔2mL体积将IPAM细胞悬液以2×105/mL密度分别置于6孔细胞培养板中，6孔共使用12mL，待细胞密度生长至约80％时，使用jetPRIME Polyplus 
Transfection试剂盒(Ref#114‑15/1.5mL)将试剂盒提供的siRNA以150nM/μL终浓度转染至
3孔细胞中，作为实验组；另外3孔细胞转染相同浓度的NC‑siRNA，作为对照组。

[0051] NC‑siRNA的核酸序列如下：正义链：5’‑UUCUCCGAACGUGUCACGUTT‑3’；反义链：5’‑ACGUGACACGUUCGGAGAATT‑3’。

[0052] 各组细胞在siRNA转染后4h，将培养基更换为等体积无血清RPMI 1640培养基。

[0053] 1.5.2RNA提取与反转录

[0054] 转染后12h，分别收集每孔细胞沉淀，使用TRIZOL裂解法提取细胞沉淀的RNA，溶解于30μL无RNA酶水中。

[0055] 使用反转录试剂盒(TAKARA PrimeScriptTMRT Master Mix,RR036A)将所提取的RNA反转录成cDNA，立即使用或保存于‑20℃。

[0056] 1.5.3荧光定量PCR检测siRNA敲低效率

[0057] 表3荧光定量PCR反应体系

[0058]

[0059] 检测引物，包括SAMHD1检测引物和β‑actin检测引物。

[0060] SAMHD1检测引物对的核酸序列如下：

[0061] 上游引物：5’‑TGGCAAATAAAAGAAATGGC‑3’

[0062] 上游引物：5’‑CTCACAGACACGGGCGAAT‑3’。

[0063] β‑actin检测引物核，酸序列如下：

[0064] 上游引物：5’‑CCGCACCACTGGCATTGTC‑3’

[0065] 下游引物：5’‑CTCCTTGATGTCCCGCACG‑3’。

[0066] 1.5.4siRNA敲低效率计算

[0067] 根据荧光定量PCR测得各样本ct值，计算出siRNA敲低效率，使用GraphPad Prism 6统计分析软件计算得出siRNA的敲低效率。

[0068] 1.5.5结果与分析

[0069] 不同siRNA转染敲低猪SAMHD1基因表达效率如图1所示。从图1可以看出，siRNA‑5的敲低效率最佳，最终确定siRNA‑5。

[0070] siRNA‑5在不同转染终浓度下的敲低效率如图2所示。从图2可以看出，siRNA转染要求终浓度为150nM/μL的敲低效率好且经济。

[0071] siRNA‑5在转染不同时间后的敲低效率如图3所示。从图3可以看出，在转染后12h再感染慢病毒，GFP荧光百分数提高效率最高，故选定siRNA转染时机为慢病毒感染前12h。

[0072] 质粒共转染后24h通过荧光倒置显微镜观察到的结果如图4所示，图中1为对照组，2为实验组，在荧光倒置显微镜下观察有细胞发出绿色荧光。

[0073] siRNA‑5的荧光定量PCR扩增曲线如图5所示，图中红色曲线(上方)代表其检测引物靶向β‑actin基因；蓝色曲线(下方)代表其检测引物靶向SAMHD1基因。从图5中可看出，各
待检测样本呈现S型扩增曲线；阴性样品无扩增曲线或ct值大于37。

[0074] 荧光定量PCR熔解曲线如图6，图中红色曲线代表其检测引物靶向β‑actin基因；蓝色曲线代表其检测引物靶向SAMHD1基因。从图6中可看出，SAMHD1与β‑actin两对检测引物
各自呈现独立的峰，且峰值对应温度恒定。

[0075] siRNA‑5敲低效率检测结果如图7所示。从图7可以看出，siRNA‑5的敲低效率达91.9％，基因敲低效率高，且与对照相比，差异极显著。

[0076] 实施例二测定慢病毒感染效率

[0077] 2.1、慢病毒包装

[0078] 参见实施例一1.3。

[0079] 2.2、siRNA的转染及分组以每孔1mL体积将IPAM细胞悬液以2×105/mL密度置于12孔细胞培养板中，1板共使用12mL。待细胞密度生长至约80％时，使用jetPRIME Polyplus 
Transfection试剂盒(Ref#114‑15/1.5mL)将试剂盒提供的siRNA以150nM/μL终浓度转染至
其中6孔细胞中，作为实验组；另外6孔细胞转染相同浓度的NC‑siRNA，作为对照组。各组细
胞在siRNA转染后4h，将培养基更换为无血清RPMI 1640培养基。

[0080] 2.3、慢病毒接毒与分组

[0081] 转染了试剂盒提供的siRNA的6孔细胞，以MOI＝100终浓度向其中3孔细胞内加入Lenti‑gfp，该分组记作S1；另外3孔细胞不做接毒处理，仅加入相同体积DMEM无血清培养
基，该分组记作S0；

[0082] 转染了试剂盒提供的NC‑siRNA的6孔细胞，以MOI＝100终浓度向其中3孔细胞内加入Lenti‑gfp，该分组记作NC1；另外3孔细胞不做接毒处理，仅加入相同体积DMEM无血清培
养基，该分组记作NC0；

[0083] 慢病毒接毒后2h，弃去各孔细胞上清，更换为PRIM‑1640无血清培养基，每孔0.5mL。

[0084] 2.4、慢病毒感染效率检测

[0085] 接毒后36h开始，每隔12h在荧光倒置显微镜下观察各孔细胞荧光变化并留存图像。

[0086] 接毒后108h收集各孔细胞沉淀，使用PBS重悬，离心弃上清，重复3次，然后将各孔细胞分别使用300μL体积4％多聚甲醛重悬，收集于流式细胞检测管中，避光置于冰上，使用
流式细胞仪检测FITC通道荧光信号。

[0087] 实验量化数据通过GraphPad Prism 6统计分析软件分析并形成图像，

[0088] 2.5、结果与分析

[0089] 各实验组IPAM细胞在36hpi、48hpi、60hpi、72hpi、84hpi、96hpi、108hpi时间点的显微成像结果如图8‑图14所示。

[0090] Lentivirus‑gfp以MOI＝100接毒的各孔IPAM细胞的流式术细胞分群结果如图15所示。根据统计学分析显示，在MOI＝100感染水平上，IPAM细胞的感染效率达40％，与对照
相比，差异显著。

[0091] 实施例三慢病毒感染BMDM细胞

[0092] 实验过程参考实施例二感染BMDM细胞。Lentivirus‑gfp以MOI＝1000接毒的各孔BMDM细胞的流式术细胞分群结果如图16所示。根据统计学分析显示，在MOI＝100感染水平
上，BMDM细胞的感染效率也达25％，与对照相比，差异显著。

[0093] 以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技
术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的
变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。