芦笋与意大利野生种间杂交F1代再生植株的培养方法转让专利
申请号 : CN202111315078.9
文献号 : CN113854154B
文献日 : 2022-05-20
发明人 : 汤泳萍 , 周劲松 , 张冰冰 , 叶艳英 , 尹玉玲 , 罗绍春 , 谢启鑫 , 陈光宇
申请人 : 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所
摘要 :
本发明公开了一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代再生植株的培养方法，该方法包括以下步骤：选取种间杂交F1代的适期花蕾，灭菌后剥取花药，培养后将子叶型胚转接至胚萌发培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入生根培养基诱导生根，最后得到可移栽植株。本发明采用蔗糖较高浓度，重点添加适当浓度的吲哚丁酸、萘乙酸和谷氨酰胺共同诱导生根及促进根的发育，并有效解决了芦笋与意大利野生种间杂交F1代花培苗生根困难问题，生根率超过80％。本发明所制备的胚状体能正常生长、成苗率高，且操作简单、省时高效，从开始培养到获得胚状体一般仅需56‑65d时间。
权利要求 :
1.一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在芦笋与意大利野生种间杂交F1代雄株开花前，施加磷钾肥和钙硼镁肥，所述钙硼镁肥由液钙、液硼、悬浮镁和水按照12mL：15mL：12mL：15kg的比例混合得到；至雄株开花初期，选取健壮雄株上的部分花蕾进行保留，其余花蕾全部疏掉，待花蕾发育充分之后，再从该植株上选取适期饱满花蕾，灭菌后剥取花药，接入装有固体培养基和液体培养基的培养皿中，封口；
(2)将培养皿置于4℃的条件下暗培养3‑5d，然后再置于26℃的条件下继续暗培养，培养至第15‑20d，小孢子从花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
(3)培养至第35‑45d，小孢子发育形成球型胚或心型胚；此时再添加5mL液体培养基，培养至第50‑55d，小孢子发育形成鱼雷型胚或子叶型胚；培养至56‑65d，将子叶型胚转接至胚萌发培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株；
所述步骤(1)中的所述固体培养基为：碳源为蔗糖和葡萄糖，添加有琼脂作为凝固剂的pH＝5.8的MS培养基；所述液体培养基为pH＝5.8的添加有营养液的MS培养基，所述营养液‑1 ‑1 ‑1
包括：40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，0.5‑1.0mg﹒L 的6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，0.5‑1.0mg﹒‑1 ‑1 ‑1
L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.1‑1.0mg﹒L 萘乙酸NAA，0.03‑0.05mg﹒L 谷胱甘肽L‑GLU，‑1
200mg﹒L 谷氨酰胺GLU；
将所述固体培养基和所述液体培养基装入所述培养皿的过程为：将所述固体培养基和所述液体培养基灭菌，然后先向培养皿中加入所述固体培养基
15mL，待所述固体培养基凝固后，再加入所述液体培养基10mL；
‑1
所述步骤(3)中的特定激素浓度的生根培养基为：MS培养基添加50g﹒L 的蔗糖，0.5mg﹒‑1 ‑1 ‑1 ‑1
L 吲哚丁酸IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述固体培养基的灭菌条件为：121℃，1.1MPa，20min。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，采用内装有0.22微米微孔滤膜的过滤器对所述液体培养基进行灭菌。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，选取花蕾灭菌接种至培养皿后需要进行预处理，具体过程为：将花蕾灭菌接种至培养皿后置于4℃的条件下3‑
5d。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用石蜡膜进行封口。
说明书 :
芦笋与意大利野生种间杂交F1代再生植株的培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物培养领域，具体涉及芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法。
背景技术
[0002] 芦笋(Asparagus officinalis L.)，又名石刁柏，属天门冬科天门冬属宿根性多年生草本植物，是全球一种重要的经济作物，质嫩味美，营养丰富，风味独特，被誉为“蔬菜
之王”，在国际市场久畅不衰，经济价值高，现为中国加工出口贸易额最大的单一蔬菜品种。
它因富含皂甙、黄酮、植物多糖和天门冬氨酸等多种活性成分，具有很好的抗肿瘤、抗氧化
和降血压等功效。芦笋种植与加工既具有高效农业的特征，又具有生态与健康产业的属性，
已被广泛应用于农业、食品加工、医药保健、动物饲料、生态治理、休闲康养等多个领域，经
济效益和生态社会效益也日渐显现。目前，我国芦笋产业发展迅速，种植和销售量均跃居世
界首位。长期以来，由于芦笋具有雌雄异株、基因型高度杂合以及多年生等特点，遗传背景
比较狭窄，其育种难度很大，选育周期很长。为创新芦笋种质资源，我们把收集来的芦笋近
缘野生种意大利野生种与芦笋栽培种进行多年杂交配组，最终获得种间杂交F1代。然而利
用团队授权的“一种芦笋小孢子诱导获得胚状体的培养方法”不能得到该种间杂交材料的
胚状体再生植株，为了更好的利用该种间杂交F1代，利用其优良性状改良芦笋，很有必要建
立该种间杂交材料的快速纯化体系。
之王”，在国际市场久畅不衰，经济价值高，现为中国加工出口贸易额最大的单一蔬菜品种。
它因富含皂甙、黄酮、植物多糖和天门冬氨酸等多种活性成分，具有很好的抗肿瘤、抗氧化
和降血压等功效。芦笋种植与加工既具有高效农业的特征，又具有生态与健康产业的属性，
已被广泛应用于农业、食品加工、医药保健、动物饲料、生态治理、休闲康养等多个领域，经
济效益和生态社会效益也日渐显现。目前，我国芦笋产业发展迅速，种植和销售量均跃居世
界首位。长期以来，由于芦笋具有雌雄异株、基因型高度杂合以及多年生等特点，遗传背景
比较狭窄，其育种难度很大，选育周期很长。为创新芦笋种质资源，我们把收集来的芦笋近
缘野生种意大利野生种与芦笋栽培种进行多年杂交配组，最终获得种间杂交F1代。然而利
用团队授权的“一种芦笋小孢子诱导获得胚状体的培养方法”不能得到该种间杂交材料的
胚状体再生植株，为了更好的利用该种间杂交F1代，利用其优良性状改良芦笋，很有必要建
立该种间杂交材料的快速纯化体系。
[0003] 目前国内外均未见芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子培养方法技术研究的报道。但在天门冬属内，芦笋(Asparagus officinalis L.)研究最为深入，现已建立了
较成熟的花药小孢子培养技术体系。此外，芦笋与兴安天门冬等近缘种间杂交后代花药培
养也先后取得成功。这些天门冬属种质花药小孢子培养技术研究主要都是基于MS培养基中
的不同细胞分裂素和细胞生长素等植物激素的浓度及配比。研究发现，天门冬属种质组培
快繁最大障碍是生根困难，不同种激素浓度及配比差异很大，不同芦笋品种、雄株和雌株激
素浓度及配比也有区别。实践中发现，芦笋与意大利野生种间杂交F1代组培和花培苗生根
相当困难。
较成熟的花药小孢子培养技术体系。此外，芦笋与兴安天门冬等近缘种间杂交后代花药培
养也先后取得成功。这些天门冬属种质花药小孢子培养技术研究主要都是基于MS培养基中
的不同细胞分裂素和细胞生长素等植物激素的浓度及配比。研究发现，天门冬属种质组培
快繁最大障碍是生根困难，不同种激素浓度及配比差异很大，不同芦笋品种、雄株和雌株激
素浓度及配比也有区别。实践中发现，芦笋与意大利野生种间杂交F1代组培和花培苗生根
相当困难。
发明内容
[0004] 本发明旨在针对现有技术缺陷，提供一种芦笋栽培种与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子培养诱导获得胚状体再生植株的培养方法，以解决现有技术中的培养条件下芦
笋栽培种与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导胚状体及再生植株生长情况较差的
技术问题。
笋栽培种与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导胚状体及再生植株生长情况较差的
技术问题。
[0005] 本发明要解决的另一技术问题是现有技术中培养条件下芦笋栽培种与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子培养诱导获得胚状体的再生植株生根困难。
[0006] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，包括以下步骤：
[0008] (1)在芦笋与意大利野生种间杂交F1代雄株开花前，除常规增施磷钾肥外，额外增施钙硼镁肥，所述钙硼镁肥由液钙、液硼、悬浮镁和水按照12mL：15mL：12mL：15kg 的比例混
合得到；促进花芽分化，至雄株开花初期，选取健壮雄株上的部分花蕾进行保留，其余花蕾
全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待花蕾发育充分之后(未经疏掉花蕾步骤所取的花蕾，
培养过程中发现活力差，培养成功率低)，再从该植株上选取适期饱满花蕾，灭菌后剥取花
药，接入装有固体培养基和液体培养基的培养皿中，封口；
合得到；促进花芽分化，至雄株开花初期，选取健壮雄株上的部分花蕾进行保留，其余花蕾
全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待花蕾发育充分之后(未经疏掉花蕾步骤所取的花蕾，
培养过程中发现活力差，培养成功率低)，再从该植株上选取适期饱满花蕾，灭菌后剥取花
药，接入装有固体培养基和液体培养基的培养皿中，封口；
[0009] (2)将培养皿置于4℃的条件下暗培养3‑5d，然后再置于26℃的条件下继续暗培养，培养至第15‑20d，小孢子从花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
[0010] (3)培养至第35‑45d，小孢子发育形成球型胚或心型胚；此时再添加5mL液体培养基，培养至第50‑55d，小孢子发育形成鱼雷型胚或子叶型胚；培养至56‑65d，将子叶型胚转
接至胚萌发培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激
素浓度的生根培养基生根，最后得到可移栽植株；因本种间杂交后代属难生根型，经多次不
同配方反复比较试验，需再转入特定激素浓度的生根培养基诱导生根，最后才更容易获得
根系健壮植株；
接至胚萌发培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激
素浓度的生根培养基生根，最后得到可移栽植株；因本种间杂交后代属难生根型，经多次不
同配方反复比较试验，需再转入特定激素浓度的生根培养基诱导生根，最后才更容易获得
根系健壮植株；
[0011] 因碳源种类、用量及部分激素水平对培养成功关系大，所以经实验反复筛选后确定所述步骤(1)中的所述固体培养基为：碳源为蔗糖和葡萄糖，添加有琼脂作为凝固剂的pH
＝5.8 的MS培养基；所述液体培养基为pH＝5.8的添加有营养液的MS培养基，所述营养液包
‑1 ‑1 ‑1
括： 40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，0.5‑1.0mg﹒L 的6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，0.5‑1.0mg ﹒
‑1 ‑1 ‑1
L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.1‑1.0mg﹒L 萘乙酸NAA，0.03‑0.05mg﹒L 谷胱甘肽L ‑
‑1
GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU；
＝5.8 的MS培养基；所述液体培养基为pH＝5.8的添加有营养液的MS培养基，所述营养液包
‑1 ‑1 ‑1
括： 40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，0.5‑1.0mg﹒L 的6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，0.5‑1.0mg ﹒
‑1 ‑1 ‑1
L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.1‑1.0mg﹒L 萘乙酸NAA，0.03‑0.05mg﹒L 谷胱甘肽L ‑
‑1
GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU；
[0012] 将所述固体培养基和所述液体培养基装入所述培养皿的过程为：
[0013] 将所述固体培养基和所述液体培养基灭菌，然后先向培养皿中加入所述固体培养基15 mL，待所述固体培养基凝固后，再加入所述液体培养基10mL。
[0014] 所述步骤(3)中，特定激素浓度的生根培养基为：MS培养基添加50g﹒L‑1的蔗糖， ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
0.5mg﹒L 吲哚丁酸IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
0.5mg﹒L 吲哚丁酸IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
[0015] 优选地，所述固体培养基的灭菌条件为：121℃，1.1MPa，20min。
[0016] 优选地，采用内装有0.22微米微孔滤膜的过滤器对所述液体培养基进行灭菌。
[0017] 优选地，所述步骤(1)中，选取花蕾灭菌接种至培养皿后需要进行预处理，具体过程为：将花蕾灭菌接种至培养皿后置于4℃的条件下3‑5d。
[0018] 优选地，所述步骤(1)中采用石蜡膜进行封口。
[0019] 本发明的有益效果为：本发明所制备的胚状体能正常生长、成苗率高，且操作简单、省时高效，从开始培养到获得胚状体一般仅需56‑65d时间，显著提高了选择效率，节省
了大量人力、物力，为加速芦笋栽培种与意大利野生种间杂交后代稳定、纯化及高效选育芦
笋新品种等提供了新途径。
了大量人力、物力，为加速芦笋栽培种与意大利野生种间杂交后代稳定、纯化及高效选育芦
笋新品种等提供了新途径。
[0020] 在营养条件方面，在整个花药小孢子培养过程中，添加谷氨酰胺作为有机氮源和碳源，有效促进了花药小孢子诱导胚状体和胚状体生长分化。本发明重点添加使用吲哚丁
酸、萘乙酸促进生根。其中吲哚丁酸是内源生长素，具有长效性和专一性的特点，能促进细
胞分裂与细胞生长，可作用于植株全身各生长旺盛部位，诱导根源体形成，可促进新根生
长，还能生根壮根，配合适度浓度的萘乙酸可达到不错的壮根效果，能获得粗大的多分枝
根。有效解决了芦笋与意大利野生杂交F1代花培苗生根困难问题，自花药小孢子培养至胚
状体再生植株移栽周期2.5～3个月，生根率超过80％。为芦笋与意大利野生杂交F1代保存
与利用奠定了基础。此方法也可为芦笋等其他天门冬属近缘种花培及组培快繁提供借鉴。
酸、萘乙酸促进生根。其中吲哚丁酸是内源生长素，具有长效性和专一性的特点，能促进细
胞分裂与细胞生长，可作用于植株全身各生长旺盛部位，诱导根源体形成，可促进新根生
长，还能生根壮根，配合适度浓度的萘乙酸可达到不错的壮根效果，能获得粗大的多分枝
根。有效解决了芦笋与意大利野生杂交F1代花培苗生根困难问题，自花药小孢子培养至胚
状体再生植株移栽周期2.5～3个月，生根率超过80％。为芦笋与意大利野生杂交F1代保存
与利用奠定了基础。此方法也可为芦笋等其他天门冬属近缘种花培及组培快繁提供借鉴。
具体实施方式
[0021] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
[0022] 实施例1：
[0023] 一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，包括以下步骤：
[0024] (1)配制固体培养基和液体培养基并装入培养皿中：
[0025] 固体培养基：在MS培养基中，加入7g﹒L‑1的琼脂、20g﹒L‑1的蔗糖和10g﹒L‑1的葡萄‑1 ‑1 ‑1
糖，pH5.8；液体培养基：在MS培养基中，加入40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，0. 5mg﹒L 的
‑1 ‑1
6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，0.5mg﹒L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，0.03mg﹒
‑1 ‑1
L 谷胱甘肽L‑GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，pH5.8；
糖，pH5.8；液体培养基：在MS培养基中，加入40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，0. 5mg﹒L 的
‑1 ‑1
6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，0.5mg﹒L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，0.03mg﹒
‑1 ‑1
L 谷胱甘肽L‑GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，pH5.8；
[0026] 固体培养基于121℃，1.1MPa条件下灭菌20分钟，液体培养基用内装有0.22微米微孔滤膜的过滤器过滤灭菌，从而保证液体培养基的无菌状态；之后进行分装，灭菌后未凝固
前向培养皿先注入固体培养基15mL，等固体培养基凝固后，培养皿中再加入液体培养基10
mL；
前向培养皿先注入固体培养基15mL，等固体培养基凝固后，培养皿中再加入液体培养基10
mL；
[0027] (2)选生长健壮的芦笋种间杂交后代作为试验材料；在芦笋与意大利野生种间杂交F1代雄株开花前，除常规增施磷钾肥外，额外增施液钙12mL、液硼15mL、悬浮镁12mL(30
斤水)，促进花芽分化，至雄株开花初期，从生长健壮的雄株上选取部分花蕾进行保留，其余
花蕾全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待花蕾发育充分之后，于上午8点前，从该植株上选
取适期花蕾，经常规灭菌，然后剥取花药，保持花药完好无损，将花药接入上述(1)准备好的
培养皿中，石蜡膜封口；
斤水)，促进花芽分化，至雄株开花初期，从生长健壮的雄株上选取部分花蕾进行保留，其余
花蕾全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待花蕾发育充分之后，于上午8点前，从该植株上选
取适期花蕾，经常规灭菌，然后剥取花药，保持花药完好无损，将花药接入上述(1)准备好的
培养皿中，石蜡膜封口；
[0028] (3)培养皿放于4℃的培养箱内，暗培养3d后，再转入26℃培养箱内，继续暗培养，同时进行振荡以增加空气，此时，花药漂浮在液体培养基的液面上，培养至第18d，小孢子从
花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
[0029] (4)培养至第40d，小孢子发育形成球型胚或心型胚；此时再添加5mL液体培养基，培养至第52d，小孢子发育形成鱼雷型胚或子叶型胚；培养至58d，将子叶型胚转接至胚萌发
培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生
根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株(每植株4条根及以上)。
培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生
根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株(每植株4条根及以上)。
[0030] 特定激素浓度的生根培养基为：MS培养基添加50g﹒L‑1的蔗糖，0.5mg﹒L‑1吲哚丁酸‑1 ‑1 ‑1
IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
[0031] 实施例2：
[0032] 一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，包括以下步骤：
[0033] (1)配制固体培养基和液体培养基并装入培养皿中：
[0034] 固体培养基：在MS培养基中，加入7.5g﹒L‑1的琼脂和20g﹒L‑1的蔗糖，10g﹒L‑1的葡萄‑1 ‑1 ‑1
糖，pH5.8；液体培养基：在MS培养基中，加入40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，0.8mg﹒L 的
‑1 ‑1
6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，1.0mg﹒L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.5mg﹒ L 萘乙酸NAA，
‑1 ‑1
0.03mg﹒L 谷胱甘肽L‑GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，pH5.8；
糖，pH5.8；液体培养基：在MS培养基中，加入40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，0.8mg﹒L 的
‑1 ‑1
6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，1.0mg﹒L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.5mg﹒ L 萘乙酸NAA，
‑1 ‑1
0.03mg﹒L 谷胱甘肽L‑GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，pH5.8；
[0035] 固体培养基于121℃，1.1MPa条件下灭菌20分钟，液体培养基用内装有0.22微米微孔滤膜的过滤器过滤灭菌，从而保证液体培养基的无菌状态；之后进行分装，灭菌后未凝固
前向培养皿先注入固体培养基15mL，等固体培养基凝固后，培养皿中再加入液体培养基10
mL；
前向培养皿先注入固体培养基15mL，等固体培养基凝固后，培养皿中再加入液体培养基10
mL；
[0036] (2)选生长健壮的芦笋种间杂交后代作为试验材料；在芦笋与意大利野生种间杂交F1代雄株开花前，除常规增施磷钾肥外，额外增施液钙12mL、液硼15mL、悬浮镁12mL(30
斤水)，促进花芽分化，至雄株开花初期，从生长健壮的雄株上选取部分花蕾进行保留，其余
花蕾全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待花蕾发育充分之后，于上午8点前，从该植株上选
取适合花蕾，经常规灭菌，然后剥取花药，保持花药完好无损，将花药接入上述(1)准备好的
培养皿中，石蜡膜封口；
斤水)，促进花芽分化，至雄株开花初期，从生长健壮的雄株上选取部分花蕾进行保留，其余
花蕾全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待花蕾发育充分之后，于上午8点前，从该植株上选
取适合花蕾，经常规灭菌，然后剥取花药，保持花药完好无损，将花药接入上述(1)准备好的
培养皿中，石蜡膜封口；
[0037] (3)培养皿放于4℃的培养箱内，暗培养4d后，再转入26℃培养箱内，继续暗培养，同时进行振荡以增加空气，此时，花药漂浮在液体培养基的液面上，培养至第16d，小孢子从
花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
[0038] (4)培养至第35d，小孢子发育形成球型胚或心型胚；此时再添加5mL液体培养基，培养至第49d，小孢子发育形成鱼雷型胚或子叶型胚；培养至56d，将子叶型胚转接至胚萌发
培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生
根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株(每植株4条根及以上)。
培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生
根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株(每植株4条根及以上)。
[0039] 特定激素浓度的生根培养基为：MS培养基添加50g﹒L‑1的蔗糖，0.5mg﹒L‑1吲哚丁酸‑1 ‑1 ‑1
IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
[0040] 实施例3：
[0041] 一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，包括以下步骤：
[0042] (1)配制固体培养基和液体培养基并装入培养皿中：
[0043] 固体培养基：在MS培养基中，加入8.0g﹒L‑1的琼脂和20g﹒L‑1的蔗糖，10g﹒L‑1的葡萄‑1 ‑1 ‑1
糖，pH5.8；液体培养基：在MS培养基中，加入40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，1.0mg﹒L 的
‑1 ‑1
6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，1.0mg﹒L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.5mg﹒ L 萘乙酸NAA，
‑1 ‑1
0.03mg﹒L 谷胱甘肽L‑GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，pH5.8；
糖，pH5.8；液体培养基：在MS培养基中，加入40g﹒L 的蔗糖，20g﹒L 的葡萄糖，1.0mg﹒L 的
‑1 ‑1
6‑苄胺基腺嘌呤6‑BA，1.0mg﹒L 的2,4‑二氯苯氧乙酸2,4‑D，0.5mg﹒ L 萘乙酸NAA，
‑1 ‑1
0.03mg﹒L 谷胱甘肽L‑GLU，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，pH5.8；
[0044] 固体培养基于121℃，1.1MPa条件下灭菌20分钟，液体培养基用内装有0.22微米微孔滤膜的过滤器过滤灭菌，从而保证液体培养基的无菌状态；之后进行分装，灭菌后未凝固
前向培养皿先注入固体培养基15mL，等固体培养基凝固后，培养皿中再加入液体培养基10
mL；
前向培养皿先注入固体培养基15mL，等固体培养基凝固后，培养皿中再加入液体培养基10
mL；
[0045] (2)选生长健壮的芦笋种间杂交后代作为试验材料；在芦笋与意大利野生种间杂交F1代雄株开花前，除常规增施磷钾肥外，额外增施液钙12mL、液硼15mL、悬浮镁12mL(30
斤水)，促进花芽分化，至雄株开花初期，从生长健壮的雄株上选取部分花蕾进行保留，其余
花蕾全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待其发育充分之后，于上午8点前，从该植株上选取
适合花蕾，经常规灭菌，然后剥取花药，保持花药完好无损，将花药接入上述(1)准备好的培
养皿中，石蜡膜封口；
斤水)，促进花芽分化，至雄株开花初期，从生长健壮的雄株上选取部分花蕾进行保留，其余
花蕾全部疏掉，让入选的花蕾营养充足，待其发育充分之后，于上午8点前，从该植株上选取
适合花蕾，经常规灭菌，然后剥取花药，保持花药完好无损，将花药接入上述(1)准备好的培
养皿中，石蜡膜封口；
[0046] (3)培养皿放于4℃的培养箱内，暗培养5d后，再转入26℃培养箱内，继续暗培养，同时进行振荡以增加空气，此时，花药漂浮在液体培养基的液面上，培养至第19d，小孢子从
花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
花药开裂处自然释放，进入液体培养基；
[0047] (4)培养至第42d，小孢子发育形成球型胚或心型胚；此时再添加5mL液体培养基，培养至第53d，小孢子发育形成鱼雷型胚或子叶型胚；培养至62d，将子叶型胚转接至胚萌发
培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生
根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株(每植株4条根及以上)。
培养基中，进行每天12‑14h光照培养即可发育形成健壮丛生芽，再转入特定激素浓度的生
根培养基诱导生根，最后得到根系健壮的可移栽植株(每植株4条根及以上)。
[0048] 特定激素浓度的生根培养基为：MS培养基添加50g﹒L‑1的蔗糖，0.5mg﹒L‑1吲哚丁酸‑1 ‑1 ‑1
IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
IBA，0.1mg﹒L 萘乙酸NAA，200mg﹒L 谷氨酰胺GLU，8g﹒L 的琼脂粉。
[0049] 最后，获得的所有再生植株均取幼嫩拟叶提取DNA，通过分子标记鉴定雌雄性别和倍性鉴定后用于芦笋培育新品种。
[0050] 对比例1：
[0051] 一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，其过程步骤与实施例2仅生根培养基不同，采用的是常规的生根培养基诱导生根，
得到的再生植株的生根率仅能达到40％，而且根系数量少(每植株只有1‑2条根)，不够健
壮。
得到的再生植株的生根率仅能达到40％，而且根系数量少(每植株只有1‑2条根)，不够健
壮。
[0052] 对比例2：
[0053] 一种芦笋与意大利野生种间杂交F1代花药小孢子诱导获得胚状体再生植株的培养方法，其过程步骤与实施例2仅取材的花蕾不同，采用的花蕾是健壮雄株开花前未额外增
施液钙12 mL、液硼15mL、悬浮镁12mL(30斤水)，而且未经疏蕾处理步骤，直接选取该健壮雄
株适期花蕾，得到的胚状体仅为实施例2的20％。
施液钙12 mL、液硼15mL、悬浮镁12mL(30斤水)，而且未经疏蕾处理步骤，直接选取该健壮雄
株适期花蕾，得到的胚状体仅为实施例2的20％。
[0054] 以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范
围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。