一种靶向PABPC1的小分子药物及其在慢性髓系白血病中的应用

摘要

本发明公开了一种靶向PABPC1的小分子药物及其在慢性髓系白血病中的应用，所述小分子药物为小分子化合物ML324，本发明首次发现小分子化合物ML324对慢性髓系白血病具有显著的治疗效果，体内和体外的验证实验均表明了小分子化合物ML324对慢性髓系白血病细胞的生长具有显著的抑制作用，本发明为临床上开发治疗慢性髓系白血病的给药方案提供了一种全新的思路。

权利要求

1.靶向PABPC1的小分子化合物在制备用于治疗和/或预防慢性髓系白血病的药物中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为ML324，所述小分子化合物的结构式如式(I)所示：式(I)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物抑制慢性髓系白血病细胞的增殖和生长。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物通过抑制PABPC1的表达抑制慢性髓系白血病细胞的增殖和生长。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物由治疗有效量的如式(I)所示的小分子化合物和药学上可接受的载体和/或辅料组成。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物的使用浓度为0.5‑5 mg/kg。

6.靶向PABPC1的小分子化合物在制备试剂中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为如权利要求1中所述的小分子化合物；所述试剂用于以下任一方面或多种方面：(1) 体外抑制慢性髓系白血病细胞的增殖；

(2) 体外促进慢性髓系白血病细胞的凋亡。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述慢性髓系白血病细胞选自K562、MEG‑

01、K562/G01或JVM‑3。

8.靶向PABPC1的小分子化合物在制备用于治疗和/或预防伊马替尼耐药的慢性髓系白血病患者的药物中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为如权利要求1中所述的小分子化合物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物由治疗有效量的如权利要求1中所述的小分子化合物和药学上可接受的载体和/或辅料组成。

说明书

一种靶向PABPC1的小分子药物及其在慢性髓系白血病中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种靶向PABPC1的小分子药物及其在慢性髓系白血病中的应用，更具体地，本发明涉及一种靶向PABPC1的小分子药物ML324，及其在慢性髓系白血病中的应用。

背景技术

[0002] 慢性髓系白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)是一种血液系统干细胞起源、造血祖细胞驱动的骨髓恶性增殖性疾病，同时也是一种常见的骨髓恶性增殖性肿瘤，约占成人白血病发病率的15％。其遗传学特点是90％以上的患者体内存在特征性的费城染色体，即t(9；22)(q34；q11)染色体易位，形成BCR/ABL融合基因(Taverna S,Giallombardo M,Pucci M,et al.Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth:a possible role for exosomal disposal of miR‑21[J].Oncotarget,2015,6(26):21918‑21933)。其高酪氨酸激酶活性在慢性髓系白血病的发生发展中发挥着重要作用，是当前慢性髓系白血病治疗的特异性靶点。该融合基因编码P210蛋白，使其酪氨酸激酶活性增强并激活下游信号转导通路，抑制细胞凋亡，在促进慢性髓系白血病的发生和发展中发挥着重要作用。

[0003] 目前，伊马替尼是慢性髓系白血病的一线治疗药物，它是靶向BCR/ABL酪氨酸激酶的抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)。虽然多数费城染色体阳性慢性髓系白血病患者伊马替尼治疗后可以取得显著疗效，但耐药成为伊马替尼治疗慢性髓系白血病失败的主要原因(Giles FJ,Cortes JE,Kantarjian HM,et al.Accelerated and blastic phases of chronic myelogenous leukemia[J].Hematol Oncol Clin North Am,2004,18(3):753‑774.)。据统计高达25％的患者对伊马替尼原发性耐药(de Lavallade H,Apperley JF,Khorashad JS,et al.Imatinib for newly diagnosed patients with chronic myeloid leukemia:incidence of sustained responses in an intention to‑treat analysis[J].Clin Oncol,2008,26(20):3358‑3363)。随着临床应用的积累，TKIs耐药现象日益增加，因此，本领域亟需寻找新的具有抗慢性髓系白血病作用的低副作用的候选药物。

[0004] 基于现有技术的现状，本申请的发明人通过实验研究了PABPC1在慢性髓系白血病发生和发展中的调控作用，进一步以PABPC1为靶点经过多个化合物库的筛选得到7997个小分子化合物(包括FDA药物、生物活性化合物以及天然小分子)，其中，筛选得到的小分子化合物ML324可在体外与PABPC1直接结合，进一步的细胞实验和动物实验证明了ML324可在细胞水平及动物水平上通过靶向RNA结合蛋白PABPC1进而对慢性髓系白血病具有抑制作用。

发明内容

[0005] 本发明为了弥补当前本领域现有技术存在的技术缺陷，提供了一种靶向PABPC1的小分子药物ML324，为临床上开发治疗慢性髓系白血病的给药方案提供了一种全新的思路。

[0006] 本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

[0007] 本发明的第一方面提供了靶向PABPC1的小分子化合物在制备用于治疗和/或预防慢性髓系白血病的药物中的应用。

[0008] 进一步，所述小分子化合物为ML324，所述小分子化合物的结构式如式(I)所示：

[0009]

[0010] 本发明中所述的“小分子化合物”，为ML324，CAS号为1222800‑79‑4，分子式为C21H23N3O2，分子量为349.43，结构式如式(I)所示，全称为N‑(3‑(Dimethylamino)propyl)‑4‑(8‑hydroxyquinolin‑6‑yl)benzamide；所述小分子化合物是本申请的发明人以PABPC1为靶点采用ALPHA screen技术高通量筛选出的化合物之一，所述小分子化合物对PABPC1与polyA的结合具有抑制作用，且进一步的实验验证表明所述小分子化合物可显著抑制慢性髓系白血病细胞的增殖和生长，并且可显著降低外周血中慢性髓系白血病细胞的比例。

[0011] 进一步，所述小分子化合物抑制慢性髓系白血病细胞的增殖和生长；

[0012] 优选地，所述小分子化合物通过抑制PABPC1的表达抑制慢性髓系白血病细胞的增殖和生长。

[0013] 进一步，所述药物由治疗有效量的如式(I)所示的小分子化合物和药学上可接受的载体和/或辅料组成；

[0014] 优选地，所述小分子化合物的使用浓度为0.5‑5mg/kg。

[0015] 在本发明的具体实施例中，所述小分子药物的使用浓度优选为2.5mg/kg，在小分子药物的使用浓度为2.5mg/kg时就已经发挥出了显著的抑制慢性髓系白血病细胞增殖和生长的能力，因此，本领域的技术人员应当清楚本发明所述的小分子药物的使用浓度并不局限于为0.5‑5mg/kg。

[0016] 本发明的第二方面提供了一种用于治疗和/或预防慢性髓系白血病的药物组合物。

[0017] 进一步，所述药物组合物包含治疗有效量的如本发明第一方面中所述的小分子化合物。

[0018] 进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；

[0019] 优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

[0020] 进一步，所述稀释剂包括(但不限于)：乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等。

[0021] 进一步，所述粘合剂包括(但不限于)：淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸、海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等。

[0022] 进一步，所述表面活性剂包括(但不限于)：聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等。

[0023] 进一步，所述致湿剂包括(但不限于)：甘油、淀粉等。

[0024] 进一步，所述吸附载体包括(但不限于)：淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土、皂粘土等。

[0025] 进一步，所述润滑剂包括(但不限于)：硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等。

[0026] 进一步，所述填充剂包括(但不限于)：甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙、碳酸氢钠等。

[0027] 进一步，所述崩解剂包括(但不限于)：交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

[0028] 本发明的第三方面提供了一种筛选用于治疗和/或预防慢性髓系白血病候选药物的方法。

[0029] 进一步，所述方法包括如下步骤：

[0030] (1)以PABPC1为药物靶点，采用ALPHAscreen技术高通量筛选对PABPC1与polyA的结合具有抑制作用的小分子化合物；

[0031] (2)对步骤(1)筛选得到的小分子化合物进行实验验证，再次筛选能够抑制慢性髓系白血病细胞增殖、和/或促进慢性髓系白血病细胞凋亡、和/或降低外周血中慢性髓系白血病细胞的比例的小分子化合物为候选药物；

[0032] 优选地，所述验证实验包括细胞增殖实验、细胞凋亡实验、慢性髓系白血病动物模型实验。

[0033] 进一步，步骤(2)中筛选得到的用于治疗和/或预防慢性髓系白血病的候选药物为小分子化合物ML324，所述小分子化合物的结构式如式(I)所示：

[0034]

[0035] 进一步，目前尚未有在慢性髓系白血病中针对PABPC1筛选药物的相关研究，本发明为首次以PABPC1为靶点筛选用于治疗和/或预防慢性髓系白血病小分子化合物的研究，并筛选出对PABPC1与polyA的结合具有显著抑制作用的小分子化合物ML324，经细胞实验和动物实验验证发现，所述小分子化合物ML324可显著抑制慢性髓系白血病细胞的增殖和生长，且能显著降低外周血中慢性髓系白血病细胞的比例，对慢性髓系白血病具有显著的治疗效果。

[0036] 本发明所述的“ALPHAscreen技术”，同“ALPHAscreen方法”，是一种药物活性测试技术，该技术是基于生物分子物质的相互作用的原理发展起来的，如抗原抗体反应、蛋白DNA相互作用、蛋白相互作用等，通过分子之间的相互作用形成供体微珠、受体微珠和相互作用分子的复合物。使用680nm的激光激发供体微珠导致单线态氧分子释放，引发能量转移级联反应，受体微珠发射520～620nm的光波，具有较强的抗淬灭能力。若生物分子不存在特异的相互作用，单体氧将无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生。

[0037] 本发明的第四方面提供了靶向PABPC1的小分子化合物在制备试剂中的应用。

[0038] 进一步，所述小分子化合物为如本发明第一方面中所述的小分子化合物；所述试剂用于以下任一方面或多种方面：

[0039] (1)体外抑制慢性髓系白血病细胞的增殖；

[0040] (2)体外促进慢性髓系白血病细胞的凋亡；

[0041] 优选地，所述慢性髓系白血病细胞包括K562、MEG‑01、K562/G01、JVM‑3。

[0042] 在本发明的具体实施例中，所述慢性髓系白血病细胞为K562、MEG‑01、K562/G01，本领域的技术人员应当清楚本发明所述的慢性髓系白血病细胞并不局限于K562、MEG‑01、K562/G01。

[0043] 本发明的第五方面提供了靶向PABPC1的小分子化合物在制备用于治疗和/或预防伊马替尼耐药的慢性髓系白血病患者的药物中的应用。

[0044] 进一步，所述小分子化合物为如本发明第一方面中所述的小分子化合物。

[0045] 进一步，所述药物由治疗有效量的如本发明第一方面中所述的小分子化合物和药学上可接受的载体和/或辅料组成。

[0046] 进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料在Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。

[0047] 进一步，所述药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

[0048] 进一步，所述药物组合物中还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等，如需要，也可以向药物组合物制剂中添加其它材料，上述药物组合物可以制成多种剂型，包括(但不限于)：片剂、皮下埋植剂、阴道或子宫腔内给药制剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等，上述各种剂型的药物组合物均可以按照药学领域中的常规方法进行制备，使用上述剂型可以经注射给药，所述注射给药包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腔内注射等；腔道给药，如经子宫腔内和阴道给药；呼吸道给药，如经鼻腔给药；粘膜给药。

[0049] 相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

[0050] (1)本发明首次发现小分子化合物ML324对慢性髓系白血病具有显著的治疗效果，体内和体外的验证实验均表明了小分子化合物ML324对慢性髓系白血病细胞的增殖和生长具有显著的抑制作用；

[0051] (2)本发明首次以PABPC1为靶点筛选用于治疗和/或预防慢性髓系白血病的小分子化合物，研究结果首次表明了小分子化合物ML324通过抑制PABPC1与靶RNA序列polyA结合，从而显著抑制慢性髓系白血病细胞的增殖和生长，进而达到显著抑制慢性髓系白血病疾病进程的作用；

[0052] (3)本发明提供的靶向PABPC1的小分子化合物ML324在制备治疗和/或预防慢性髓系白血病药物中的用途属于首次公开，为慢性髓系白血病的临床治疗提供了新方法和新思路，具有非常好的临床应用前景。

附图说明

[0053] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0054] 图1显示ALPHAscreen示意图；

[0055] 图2显示本发明高通量筛选得到7997个小分子化合物的结果图；

[0056] 图3显示小分子化合物ML324的结构式示意图；

[0057] 图4显示检测小分子化合物ML324与PABPC1体外结合力的结果图；

[0058] 图5显示检测小分子化合物ML324在不同的慢性髓系白血病细胞系中的IC50值的结果图，其中，A图：K562细胞，B图：MEG‑01细胞；

[0059] 图6显示小分子化合物ML324对初诊CML患者造血干祖细胞的增殖生长影响结果图，其中，A图：Patient 1#，B图：Patient 2#，C图：Patient 3#，D图：Patient4#；

[0060] 图7显示小分子化合物ML324对TKI(BCR‑ABL抑制剂)耐药CML细胞株的增殖能力影响的结果图；

[0061] 图8显示小分子化合物ML324对CML小鼠模型治疗效果的结果图，其中，A图：实验流程图，B图：ML324对外周血中白血病细胞数量影响的结果图，C图：ML324对CML小鼠的生存率影响的结果图。

具体实施方式

[0062] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

[0063] 实施例1筛选对PABPC1与polyA的结合具有抑制作用的小分子化合物

[0064] RNA结合蛋白PABPC1在细胞正常生命活动的维持中起着重要作用，PABPC1通过与特定RNA序列polyA结合发挥调控RNA稳定性及翻译功能，发明人在前期实验中发现PABPC1在慢性髓系白血病的发生发展中发挥着重要的调控功能。基于此，本发明通过筛选能够抑制RNA结合蛋白PABPC1与其靶RNA polyA结合的小分子化合物，进而为慢性髓系白血病的临床治疗提供新的候选药物。

[0065] 1、采用ALPHA screen方法体外检测PABPC1与ployA的结合，并筛选对PABPC1与polyA的结合具有抑制作用的小分子化合物

[0066] 所述ALPHA screen的示意图见图1，具体实验步骤如下：

[0067] (1)使用assay buffer：50mM Tris‑HCl(pH 7.4)，150mM NaCl，0.1％BSA(使用前配置)稀释蛋白PABPC1‑his(Fitzgerald公司，80R‑3949)、RNA polyA‑bio(北京天一辉远公司合成)至所需浓度；

[0068] (2)使用声波加样仪于384微孔板(PerkinElmer公司，OptiPlateTM)中打入小分子库(清华大学药学技术中心活性筛选平台)进行高通量筛选；assay buffer稀释ML324小分子至使用浓度；

[0069] (3)在384微孔板中加入5μL RNA(终浓度为2nM)，加入5μL PABPC1(终浓度为15nM)；大规模筛选时该步骤终体积为10μL，小分子库体积为20nL忽略不计；ML324体外实验中，小分子药物体积为5μL，该步骤终体积为15μL；

[0070] (4)加样完成后，使用避光黑膜覆盖，1000rpm常温离心1min；

[0071] (5)室温孵育1.5小时；

[0072] (6)避光配置beads mix(ALPHA screen kit，PerkinElmer公司，6760619M)：使用assay buffer配置beads mix，Donor and Acceptor beads的终浓度均为20μg/mL，总体积为10μL；

[0073] (7)在步骤(5)孵育后的384孔板中加入10μL beads mix，使用避光黑膜覆盖，1000rpm常温离心1min；

[0074] (8)室温孵育1h；

[0075] (9)酶标仪读数：发射波长为680nm。

[0076] 2、实验结果

[0077] 结果显示，高通量筛选共得到7997个小分子化合物(包括FDA药物、生物活性化合物以及天然小分子)，其中，小分子化合物ML324对PABPC1与polyA的结合抑制作用较为明显(见图2)。所述小分子化合物ML324的CAS号为1222800‑79‑4，分子式为C21H23N3O2，分子量为349.43，结构式如图3所示，全称为N‑(3‑(Dimethylamino)propyl)‑4‑(8‑hydroxyquinolin‑6‑yl)benzamide。

[0078] 实施例2小分子ML324与PABPC1体外结合能力的验证

[0079] 本实施例基于实施例1中筛选得到的小分子化合物ML324，通过微量热涌动实验(MST)检测PABPC1与小分子ML324是否可以体外直接结合。

[0080] 1、实验方法

[0081] (1)使用NanoTemper Monolith NT.115仪器(NanoTemper Technologies，Germany)测定PBABC1与小分子ML324之间的结合亲和力；

[0082] (2)首先将PABPC1蛋白调整到10μM的浓度，使用Monolith NT.115Protein Labeling Kit RED‑NHS(NanoTemper Technologies，Germany)进行标记；

[0083] (3)蛋白标记实验完成后，用结合缓冲液(20mM HEPES，pH 7.4，100mM NaCl，0.005％Tween 20)稀释PABPC1，确保MST检测时PABPC1的荧光强度约为500RU；在本实验中，PABPC1与ML324混合后的最终浓度为20nM；

[0084] (4)用结合缓冲液从0.5mM连续1：2稀释ML324，至16个浓度梯度，然后与等量稀释后的PABPC1在室温下孵育3h、8h、16h；

[0085] (5)孵育后，将样品加载到经过优质处理的毛细管中，并在NanoTemper Monolith NT.115仪器中进行测量；结合力KD值由NanoTemper Monolith亲和软件(NanoTemper Technologies，Germany)采用1：1结合模式进行拟合。

[0086] 3、实验结果

[0087] 结果显示，本发明筛选得到的小分子化合物ML324可在体外与PABPC1直接结合，亲和力测定的结果显示，ML324(CAS 1222800‑79‑4)体外与PABPC1的结合力为23.2nM(见图4)。

[0088] 实施例3 CCK8实验检测小分子化合物ML324在两种癌细胞系中的IC50值

[0089] 1、实验材料

[0090] 本发明所述的两种癌细胞系为慢性髓系白血病细胞系，分别为K562细胞系和MEG‑01细胞系，其中，K562细胞系来源于申请人的实验室存种；MEG‑01细胞系购自于中国医学科学院基础医学研究所国家生物医学实验细胞资源库(BMCR)；

[0091] 2、实验方法

[0092] (1)ML324小分子作用的浓度梯度设置为：100μM，10μM，1μM，100nM，10nM；背景DMSO为0.1％；

[0093] (2)使用培养基配置10X上述步骤(1)中的ML324小分子浓度；

[0094] (3)收取培养2天的细胞K562及MEG‑01，800rpm，5min离心，1mL培养基重悬细胞并使用CountStar计算细胞浓度，稀释细胞至浓度为9000cells/90μL；

[0095] (4)在96孔板中铺入步骤(3)中稀释后的细胞，每孔90μL，每浓度设置3个复孔，细胞周围孔加100μL PBS缓冲液；

[0096] (5)在细胞中加入10μL步骤(2)中稀释的药物；轻拍混匀，培养箱(37℃、5％CO2)培养48小时；

[0097] (6)48小时后，避光条件下，在每孔细胞中加入10μL CCK8 Assay试剂(DOJINDO公司，NV546)，置入37℃孵箱中作用2小时，检测前去除细胞悬液中的气泡、轻拍混匀；

[0098] (7)Bio‑Tek酶标仪读数检测：发射波长为450nm‑630nm；Graphpad prism6.0计算IC50值。

[0099] 3、实验结果

[0100] 结果显示，在K562细胞中，小分子化合物ML324的IC50值为3.755μM；在MEG‑01中，小分子化合物ML324的IC50值为4.767μM(见图5A和图5B)，表明了小分子化合物ML324对慢性髓系白血病细胞系具有抑制作用。

[0101] 实施例4检测小分子化合物ML324对CML病人细胞的增殖抑制能力1、磁珠分选CML患者骨髓CD34阳性造血干祖细胞

[0102] (1)CML患者信息：共4例CML患者，均为BCR‑ABL(p210)阳性的初治CML患者，分别表示为Patient 1#、Patient 2#、Patient 3#、Patient 4#；

[0103] (2)配制无菌分选buffer：PBS，2％FBS，0.4％0.5M EDTA，1％双抗；

[0104] (3)分离CML病人骨髓单核细胞：4倍体积的EDTA‑PBS充分稀释骨髓血样，2：1体积比沿壁加在HISTOPAQUE(Sigma，10771)上，室温、速度慢升慢降、680g离心20min；将白膜层及其上下部分液体吸出，分选buffer稀释并洗掉HISTOPAQUE，室温1600rpm离心10min后吸取弃上清；

[0105] (4)磁珠抗体(美天旎，130‑046‑702)标记CD34+细胞(避光操作)：每1×108个细胞加入300μL分选buffer、100μL阻断剂、100μL CD34+磁珠重悬细胞沉淀并充分混匀，4℃孵育30min，每隔10min轻晃混匀细胞悬液；50mL分选buffer洗1次细胞，室温1500rpm离心10min后吸取弃上清；

[0106] (5)分选CD34+细胞(避光操作)：3mL分选buffer重悬细胞，用细胞过滤器过滤细胞悬液、再用1mL分选Buffer冲洗滤器3次得6mL单细胞悬液；磁力架即MidiMACS Separator(美天旎，130‑042‑302)上安装吸附柱即LS Columns(美天旎，130‑042‑401)，3mL分选buffer润洗柱子(避免产生气泡，柱中液体不能断流)；6mL单细胞悬液过吸附柱，3mL分选buffer清洗吸附柱，弃流出液；卸下吸附柱，3mL分选buffer洗脱吸附柱2次、用推杆迅速大力推出剩余液体来收集细胞至新的15mL离心管；

[0107] (6)CD34+细胞培养

[0108] 使用CountStar计算细胞浓度；取1×105个细胞进行CD34‑APC(默克ebioscience，SAB4700161)流式抗体染色，流式检测CD34阳性率；

[0109] 用于培养骨髓CD34+细胞的培养基配方如下：IMDM‑Gluta MAX(Gibco，31980097)、10％FBS、1％Penicillin‑Streptomycin(Gibco，10378016)、55μM 2‑Mercaptoethanol(Sigma，M6250)、10ng/mL IL‑6(Peprotech，AF‑200‑06)、20ng/mL IL‑3(Peprotech，AF‑
213‑13)、100ng/mL FLT3L(Peprotech，AF‑300‑19)、50ng/mL TPO(Peprotech，AF‑300‑18)、
100ng/mL SCF(Peprotech，AF‑300‑07)；细胞培养2‑4天内进行实验处理。

[0110] 2、CCK8 Assay检测初诊CML患者造血干祖细胞增殖

[0111] CCK8 Assay检测小分子化合物ML324处理后初诊CML患者造血干祖细胞的增殖生长能力。具体实验步骤如下：

[0112] (1)取5个96孔板，分为0h、24h、48h、72h、96h组，每板设定实验组(5μM ML324组)和对照组(0.1％DMSO组)，每组设5个复孔，每孔约5000个细胞，每板按照相同的设定顺序种100μL实验组和对照组细胞悬液，周围孔加100μL PBS缓冲液，轻拍混匀后、放入培养箱(37℃、5％CO2)中培养；

[0113] (2)铺板后0h、24h、48h、72h、96h，向每100μL细胞悬液中加入10μLCCK8溶液(东仁化学，CK04)，轻拍混匀，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育2h，去除细胞悬液中的气泡、轻拍混匀后，Bio‑Tek酶标仪检测每个样品孔450nm、630nm波长的吸光度。选取3个复孔数值作为三个生物学重复，Graphpad prism6.0计算Mean±SD、比较不同时间点各组细胞脱氢酶活性的差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

[0114] 3、实验结果

[0115] 结果显示，相比于对照组，初诊CML患者造血干祖细胞中加入5μM ML324后细胞增殖能力明显下降，表明了本发明筛选得到的小分子化合物ML324可显著抑制CML患者细胞的增殖与生长(见图6A‑图6D)。

[0116] 实施例5检测小分子化合物ML324在CML耐药株中的增殖抑制能力

[0117] 1、实验材料

[0118] 本实施例中所述的TKI(BCR‑ABL抑制剂)耐药CML细胞株K562/G01(人慢性髓系白血病细胞耐伊马替尼细胞，简称KG细胞)由中国医学科学院血液学研究所提供。

[0119] 2、实验方法

[0120] CCK8 Assay检测小分子化合物ML324处理后TKI耐药CML细胞株K562/G01的细胞增殖情况，具体实验步骤如下：

[0121] (1)用于培养KG细胞的培养基配方如下：RPMI 1640+10％FBS+1％双抗，培养条件均为无菌、37℃、5％CO2及饱和湿度；

[0122] (2)细胞铺板、吸光度检测计算；选取3个复孔数值作为三个生物学重复，Graphpad prism 6.0计算Mean±SD、比较不同时间点各组细胞脱氢酶活性的差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

[0123] 3、实验结果

[0124] 结果显示，相比于对照组而言，KG细胞中加入5μM ML324后细胞增殖能力明显下降，表明了小分子化合物ML324可显著抑制TKI耐药CML细胞株K562/G01的增殖与生长(见图7)。

[0125] 实施例6小分子化合物ML324对CML小鼠模型的治疗效果

[0126] 1、实验材料

[0127] 本实施例中所述的C57小鼠购自于维通利华公司，为6‑8周龄雌鼠；本实施例中所述的细胞悬液：C57小鼠股骨中取出骨髓细胞，经过5‑FU处理后稳定转染MSCV‑BCR‑ABL‑GFP质粒(该质粒参考文献Methods Mol Biol.2016；1438:225‑43.doi:10.1007/978‑1‑4939‑3661‑8_13.Chronic Myeloid Leukemia(CML)Mouse Model in Translational Research
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中的构建方法构建得到)，PBS清洗并重悬细胞制备成1×10个/mL的细胞悬液。

[0128] 2、实验分组和实验方法

[0129] 本实施例的实验流程图见图8A，详细实验步骤如下：

[0130] (1)取10只C57小鼠，经10Gy致死剂量的γ射线照射后的24h内，将上述细胞悬液经尾静脉注射到小鼠体内，发病之后随机分为对照组和ML324治疗组，5只/组；

[0131] (2)尾静脉注射约10天后，从小鼠尾静脉取外周血，裂红获得单个核细胞、PBS清洗细胞并制备成单细胞悬液后，通过流式检测GFP+细胞所占比例即白血病细胞嵌合率约为10％，提示小鼠慢性髓系白血病的发病迹象。随后将小鼠随机分为两组，对照组和ML324治疗组小鼠分别经尾静脉注射PBS和ML324(2.5mg/kg)，每天相同时间点注射一次，连续注射八天后，从小鼠尾静脉取外周血通过流式检测小鼠外周血单个核细胞中GFP+细胞所占比例即白血病细胞嵌合率。组内数值取Mean±SD，Graphpad prism 6.0比较各组GFP+细胞占比的差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；

[0132] (3)CML细胞移植两个月期间统计各组小鼠存活数量，并绘制生存曲线。

[0133] 3、实验结果

[0134] 结果显示，相比于对照组，经ML324治疗后的慢性髓系白血病小鼠外周血中白血病细胞所占比例显著下降，小鼠生存期显著延长、更不易发病(见图8B和图8C)，表明了本发明筛选得到的小分子化合物ML324能够抑制慢性髓系白血病的发生与发展，进一步表明了ML324有望成为治疗慢性髓系白血病的新型化合物，具有较好的临床应用前景。

[0135] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。