LINC00958在制备诊断及监测慢性髓细胞白血病的试剂及试剂盒中的应用

摘要

本发明公开了长链非编码RNA LINC00958在制备慢性髓细胞白血病诊断及病情监测的试剂或含有该诊断试剂的试剂盒中的应用，本发明通过实验发现相较于正常人，患有慢性髓细胞白血病的患者外周血中LINC00958的表达显著下调，在慢性髓细胞白血病急变期患者较慢性期患者外周血中LINC00958的表达显著下调，而完全缓解期的患者外周血中LINC00958的表达量相较于慢性髓细胞白血病慢性期/急变期患者显著上调，针对该结果本发明设计了一种检测LINC00958表达量的试剂盒，用于慢性髓细胞白血病患者的诊断和病情监测。本发明具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确的及观察到并病情变化，以便及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。

权利要求

1.一种检测长链非编码RNA LINC00958表达水平的试剂在制备慢性髓细胞白血病诊断及病情监测的试剂盒中的应用，所述长链非编码RNA LINC00958的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测长链非编码 RNA LINC00958表达水平的试剂包括检测长链非编码 RNA LINC00958的核酸扩增引物对。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO  .2和SEQ ID  NO  .3所示，其引物上游5'‑3'：CTACACAGACGCCAGGTAGC，下游5'‑3'：GGCTGGAGCCCATCCATTAG。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因GAPDH引物对；

所述GAPDH引物对的序列如SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .5所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录试剂、SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液、DEPC水。

说明书

LINC00958在制备诊断及监测慢性髓细胞白血病的试剂及试

剂盒中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及长链非编码RNA LINC00958作为标志物在慢性髓细胞白血病诊断及病情监测中的应用，以及制备相应的检测试剂和试剂盒中的应用。

背景技术

[0002] 慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性克隆性疾病，是我国最常见的白血病之一，约占成年人新发白血病的15％‑20％。费城染色体(philadelphia，Ph)[t(9；22)(q34；q11)]是其特征性的细胞遗传学改变，其编码产生的BCR/ABL1融合蛋白具有强烈酪氨酸激酶活性，异常激活下游多条信号通路持续磷酸化，刺激造血细胞异常增殖和恶性转化，和CML发病密切相关。CML的自然病程通常分为慢性期、加速期及急变期三个阶段，慢性期相对较长且症状可控，近年来靶向药TKIs类药物的应用取得较好的临床疗效，部分患者可以达到完全缓解，但依然存在未及时合理治疗、药物反应不佳和复发等情况，导致疾病进展，经短暂加速期后进入急变期，而一旦急变，预后极差。

[0003] CML现有的治疗措施主要包括化疗、靶向药物治疗及骨髓移植等，病程不同阶段适用治疗方案不同，需准确判断病情，选择行之有效的治疗方案，因此，疾病早期诊断，病情监测及急变预警对于临床治疗有至关重要的指导意义。

[0004] 针对CML疾病的诊断，目前国内外并无统一标准。主要诊断指标有骨髓/外周血原始细胞计数、脾肿大程度、融合基因bcr/abl定量及临床药物反应性等。然而，CML早期无特异性症状，这些指标均过于依赖CML细胞生物学表型和临床表现，只能在某一阶段具有诊断价值，对于早期诊断不够灵敏，且对于疾病不能有效进行病程持续监测，导致临床错失最佳治疗时机。因此，CML早期诊断和病情监测这两个紧密相连的重要环节都亟待寻求突破。

[0005] 癌症的早期改变包括表观遗传事件的失调，例如非编码RNA的异常水平。长链非编码RNA是长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质RNA，可以和DNA、RNA和蛋白质相互作用，通过染色质的重构、转录的整个过程、调控，以及转录后的修饰等方式，在细胞增殖、分化及凋亡等多种生物学过程中起发挥作用，是人类健康和疾病的生物学进展的中的重要角色。长链非编码RNA表达具有器官、组织、细胞类型、发育阶段和疾病状况的时空特异性，使其能够成为诊断和预后生物标志物和基因治疗靶标的候选物。近年来的研究表明，长链非编码RNA和肿瘤发生发展关系密切。回顾研究发现，CML的特征融合基因BCR/ABL1可以被长链非编码RNA调控，且与CML疾病发生和病情进展的密切相关。

[0006] 长链非编码RNA LINC00958是一种新发现的非编码RNA,其长度为1576个核昔酸。本发明首次发现LINC00958的异常水平和CML进展的密切相关，过表达LINC00958可以抑制CML进展，其作用机制需进一步研究，目前LINC00958在CML中的作用尚未见报道。本发明研究发现LINC00958可以作为一种新的生物标志物用于CML患者，因此，本发明首次阐明了以LINC00958来对患者进行CML诊断及病情监测的可行性。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种能够对慢性髓细胞白血病准确早期诊断和病情监测的诊断试剂和诊断试剂盒，以及使用所述试剂或试剂盒检测LINC00958表达量的方法。

[0008] 本发明的一个方面在于提供了LINC00958用于制备慢性髓细胞白血病诊断及病情监测的试剂或含有所述诊断及病情监测试剂的试剂盒中的用途，所述LINC00958核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明的另一个方面在于：提供了诊断受试者是否是慢性髓细胞白血病的诊断及病情监测的方法，该方法包括至少三个步骤：(a)测定怀疑处于慢性髓细胞白血病的受试者外周血PBMCs标本中LINC00958的表达量；和

[0010] (b)根据LINC00958的表达量，评估该受试者是否患有慢性髓细胞白血病；和[0011] (c)根据LINC00958的表达量，评估该受试者处于慢性髓细胞白血病慢性期/急变期/完全缓解期病情阶段。

[0012] 作为本发明优选的实施方案，所述评估包括：

[0013] (1)将根据所测定的LINC00958的表达量，评估该受试者是否患有慢性髓细胞白血病；表达量与预确定的阈值进行比较，表达量低于阈值a，指示该受试者患有慢性髓细胞白血病。

[0014] (2)将根据所测定的LINC00958的表达量，评估该受试者是否处于慢性髓细胞白血病慢性期；表达量与预确定的阈值进行比较，表达量低于阈值a且高于阈值b，指示该受试者处于慢性髓细胞白血病慢性期。

[0015] (3)将根据所测定的LINC00958的表达量，评估该受试者是否处于慢性髓细胞白血病急变期；表达量与预确定的阈值进行比较，表达量低于阈值b，指示该受试者处于慢性髓细胞白血病急变期。

[0016] (4)将根据所测定的LINC00958的表达量，评估该受试者慢性髓细胞白血病病情是否完全缓解；表达量与预确定的阈值进行比较，表达量高于阈值c，指示该受试者处病情完全缓解。

[0017] 作为本发明优选的实施方案，所述诊断及病情监测试剂包含检测长链非编码RNA LINC00958或其部分片段表达水平的物质的试剂。

[0018] 作为本发明优选的实施方案，所述诊断及病情监测试剂盒包含检测长链非编码RNA LINC00958或其部分片段表达水平的物质的试剂。

[0019] 作为本发明优选的实施方案，所述检测长链非编码RNA LINC00958或其部分片段表达水平的物质的试剂包括检测长链非编码RNALINC00958的核酸扩增引物对。

[0020] 作为本发明优选的实施方案，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其引物上游5'‑3'：CTACACAGACGCCAGGTAGC，下游5'‑3'：GGCTGGAGCCCATCCATTAG。

[0021] 作为本发明优选的实施方案，所述诊断及病情监测试剂盒包括LIN00958的核酸扩增引物对和/或检测内参基因GAPDH的核酸扩增引物对。

[0022] 作为本发明优选的实施方案，所述检测LIN00958的核酸扩增引物对，其引物上游5'‑3'：CTACACAGACGCCAGGTAGC，下游5'‑3'：GGCTGGAGCCCATCCATTAG。所述检测内参基因GAPDH的核酸扩增引物对，其引物上游5'‑3'：TGCACCACCAACTGCTTAGC3，下游5'‑3'；
GGCATGGACTGTGGTCATGAG。

[0023] 作为本发明优选的实施方案，所述试剂盒还包括逆转录试剂、SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液、DEPC水。

[0024] 本发明具有的有益效果为：

[0025] 本发明将LINC00958用于慢性髓细胞白血病诊断及病情监测，具有较高的灵敏度和特异性，可以更简单、准确的方法及早观察到疾病进展，及时采取治疗手段，具有较高的临床应用价值。

附图说明

[0026] 图1为本发明中RT‑qPCR验证LINC00958在各组表达情况图。

[0027] 图2为本发明中LINC00958在各组间的诊断价值。

[0028] 图3为本发明的过表达LINC00958抑制CML细胞系增殖并促进凋亡。

具体实施方式

[0029] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。

[0030] 发明人采用RT‑qPCR技术检测LINC00958表达情况，比较CML急变患者、CML慢性期患者、CML完全是缓解患者和正常对照组外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA差异，发现LINC00958在健康人和CML不同疾病阶段表达量存在显著差异。采用疾病细胞模型初步验证LINC00958在CML中的作用，结果证实高表达LINC00958可以抑制CML细胞系恶性生物学行为。

[0031] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0032] 实施例1

[0033] 一、CML病患组标本采集

[0034] 据2016年CML的NCCN诊断标准，收集初次诊断并未进行治疗CML慢性期组(CML‑CP)39例、CML急变组(CML‑BP)12例和CML完全缓解组(CML‑CHR)23例，收集30例同期健康体检样本作为对照组。

[0035] 二、外周血单个核细胞提取

[0036] Ficoll密度梯度离心法：①将2.5ml全血置入15ml离心管中，2.5ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；②取15ml离心管先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液用移液管轻轻加到Ficoll上层(避免两种溶液混合)；③离心2000rpm，20min；④用吸管吸取白色细胞层(即PBMC)放入干净的15ml离心管中；⑤加入PBS至10‑15ml，1500rpm，10min离心后去掉上清，加入Trizol混匀。‑80℃保存备用。

[0037] 三、总RNA提取

[0038] TRIzol法：①加入0.5ml TRIzol/5×106个PBMC，放置无核酶EP管中反复吹打后，室温静置5min；②加入0.1ml氯仿/1mlTRIzol，剧烈震荡15s，室温静置2‑3min；③4℃，12000rpm，离心15min，最上层的无色水相层(约50％)为RNA层(可见三层，轻拿轻放，避免三层液体混合)；④轻轻吸取上层水相至新的EP管中(避免吸到中间层)，加入0.25ml异丙醇/
1mlTRIzol，颠倒混匀，4℃放置20min；⑤4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，胶状沉淀可见于EP管侧壁及管底；⑥RNA沉淀用0.5ml的75％乙醇溶液(用无水乙醇和无核酶水现配)吹打混匀洗涤，后4℃、8000rpm，离心5min；⑦弃上清后获RNA沉淀于室温干燥5‑10min，加入无核酶水(适量)溶解RNA，‑80℃保存备用。

[0039] 四、RT‑qPCR分析

[0040] 1.通过时实荧光定量PCR方法，对各组间LINC00958表达量进行定量检测。来自各组样本的总RNA用RQ1 DNase酶除去除DNA。总RNA纯度和浓度测定，备用。

[0041] 2.模板DNA即cDNA的合成：按Takara逆转录反应试剂盒说明对制备的总RNA进行反转录，配制反应体系如下：

[0042]

[0043] 其中，100ng的总RNA，据RNA浓度可换算所需加入的体积。配制体系需在冰上操作完成，精准加样，避免操作误差。配制好的体系需点动混匀并离心，随后置于PCR扩增仪上逆转录，反应条件为37℃15min、85℃5s和4℃30min，逆转录结束后及时取出扩增产物(即为模板cDNA)，‑20℃保存备用。

[0044] 3.SYBR Green法RT‑qPCR检测：①LINC00958引物及内参基因GAPDH引物由华大基因公司合成，分别用无核酶水溶解为20nmol/ml，备用；②按Takara荧光定量试剂盒配制RT‑qPCR反应体系如下表：

[0045]

[0046] ③反应条件：首先95℃30s，然后按95℃5s、60℃34s的顺序循环40次，最后95℃15s、60℃60s、95℃15s；④为减少试验误差，每例样本进行3次重复试验。⑤分析结果：结合‑ΔΔCt
扩增曲线及溶解曲线判断扩增效果，利用2 法计算目的基因表达量。

[0047] 五、实验实施

[0048] 1.分组设计：病例样本CML‑CP组39例、CML‑BP组12例、CML‑CHR组23例和HC组30例。

[0049] 2.主要试验耗材

[0050]

[0051] 六、实验结果

[0052] 1.RT‑qPCR结果分析

[0053] 通过RT‑qPCR检测LINC00958表达水平，分析健康对照组(30例)，CML慢性期组(39例)、CML急变组(12例)和CML完全缓解组(23例)外周血单个核细胞中LINC00958的表达情况，结果显示和健康对照者相比，LINC00958在CML患者中低表达，且CML‑BP患者表达水平显著低于CML‑CP患者，CML‑CRH患者LINC00958表达水平显著高于CML‑CP和CML‑BC。差异具有统计学意义(P<0.05)，CML‑CHR表达水平同健康对照相比无差异，差异无统计学意义(图1A‑B)。即LINC00958在CML患者中表达水平同病情进展相关，LINC00958表达水平随疾病进展降低，随疾病缓解升高，可用于CML病情监测。

[0054] 2.LINC00958在CML中的诊断价值。

[0055] 利用ROC曲线分析评估LINC00958在CML中的意义。

[0056] (1)LINC00958能够显著的区分健康对照组和CML组(即CML慢性期组和CML急变组)。ROC曲线如图2A‑C所示，健康对照组和CML的综合诊断AUC值为0.877，95％confidence interval‑1.455to‑0.7694，P＜0.0001；健康对照组和CML‑CP的诊断AUC值为0.840，95％confidence interval‑1.41to‑0.634，P＜0.0001,健康对照组和CML‑BP的诊断AUC值为1.000，95％confidence interval‑2.062to‑0.7492，P＜0.0001,表明检测LINC00958表达量对于CML患者的诊断以及早期诊断具有较高价值。

[0057] (2)LINC00958能够显著地区分CML‑CP组和CML‑BP组。ROC曲线如图2D所示，AUC值为0.966，95％confidence interval‑0.6296to‑0.1379，P＝0.0029,表明检测LINC00958表达量对于CML患者的急变的早期预警具有较高价值。

[0058] (3)LINC00958能够显著地区CML组和CML‑CHR组(即CML慢性期组和CML急变组)。ROC曲线如图2E所示，AUC值为0.862，95％confidence interval 1.183‑2.269，P＜0.0001,表明检测LINC00958表达量对于CML患者病情缓解的判断提供依据。

[0059] 因此本发明认为，外周血PBMCs中的LINC00958表达量可以用作为CML诊断及病情监测的生物标志物。

[0060] 实施例2

[0061] 一、LINC00958对CML细胞系K562细胞的生物学行为影响。

[0062] 1.EDU染色：用于检测细胞增殖。根据试剂说明书操作，取1×106对数生长期细胞，完全培养基1:1000稀释的EdU溶液共同孵育2小时，PBS洗涤两遍，4％多聚甲醛室温固定30分钟，2mg/mL甘氨酸脱色；0.5％Triton X渗透剂孵育后，加入Apollo染色反应液，室温避光孵育30分钟、0.5％Triton X渗透剂脱色摇床孵育10min，加入Hoechst33342室温避光孵育30分钟，PBS洗涤，染色完成，然后荧光显微镜拍照。

[0063] 2.CCK8实验：用于检测细胞增殖情况。取各组转染细胞，调整细胞密度为1×105/mL，取0.1ml/孔接种96孔细胞培养板，在37℃、5％CO2培养箱中分别培养0h、12h、24h和48h后，每孔加10微升CCK8试剂，培养箱继续培养3h后，酶标仪测定450nm/630nm处的各孔吸光度OD值，每组实验复孔3孔，计算绘制细胞增殖曲线。

[0064] 流式细胞术：用于检测细胞凋亡情况。依据试剂盒说明书,分别离心收集各组1×106细胞,预冷的PBS漂洗2次,加0.1ml 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5微升Annexin V‑PE和5微升7‑AAD避光孵育10分钟，加入0.4ml 1×Binding Buffer。1小时内流式细胞仪检测激发波长488nm下，FL2和FL3通道的荧光强度。

[0065] 二、实验实施

[0066] 1.分组设计：CML细胞系K562和KCL22，按照要求进行转染，分别分为转染空载质粒的NC组，和过表达LINC00958的LINC00958组。

[0067] 2.主要试验耗材

[0068]

[0069] 三、实验结果

[0070] 过表达LINC00958可以抑制CML细胞系增殖并促进凋亡。

[0071] 在CML细胞系K562和KCL22中过表达LINC00958后，RT‑qPCR验证转染成功(图3A)。CCK8实验显示，LINC00958过表达组增殖曲线明显低于对照组(图3C)，P<0.001，差异具有统计学意义。在EdU染色中，细胞和EdU共培养的2H中，LINC00958过表达组细胞增殖明显少于NC对照组(图3B)，即过表达LINC00958后CML细胞系的增殖能力显著下降。流式细胞术检测各组细胞凋亡比例，结果显示，过表达LINC00958后的CML细胞系凋亡率显著增加(图3D)。说明LINC00958过表达能够促进CML细胞凋亡。以上结果说明高表达LINC00958能够抑制CML细胞系的恶性生物学行为，这和LINC00958在CML病例中病情进展时LINC00958低表达，病情缓解时LINC00958高表达的情况一致。

[0072] 上述步骤为本专利的较佳实施方式，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的技术或研究人员，可在各所处知识领域内，且不脱离本专利宗旨的前提下作出相应的变化。