一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法

摘要

本发明提出一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，步骤有：1、准备植物蛋白饮料DNA样品及LAMP恒温扩增特异性引物；植物蛋白饮料DNA样品经超微量分光光度计测定后，其A260/A280在1.7‑2.0之间，DNA浓度＞10ng/μL；LAMP恒温扩增特异性引物是选取椰子特异性基因序列合成得到，椰子基因采用椰子3a(Hd3a)基因；特异性基因序列在椰子基因中的位置为451‑1300bp；LAMP恒温扩增特异性引物为：外引物F3/B3、内引物FIB/BIP、环引物LB；2、采用LAMP恒温扩增反应体系对植物蛋白饮料DNA样品进行LAMP恒温扩增，检测荧光信号，得到检测结果。本发明对椰子成分鉴别的灵敏度高、特异性高，可用于植物蛋白饮料中椰子成分的快速检测。

权利要求

1.一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，其特征在于包括有以下步骤：步骤1、准备植物蛋白饮料DNA样品，以及准备对植物蛋白饮料DNA样品进行LAMP恒温扩增的LAMP恒温扩增特异性引物；

所述植物蛋白饮料DNA样品经超微量分光光度计测定后，其A260/A280在1.7‑2.0之间，DNA浓度＞10ng/μL，于‑20℃保存备用；

所述LAMP恒温扩增特异性引物是选取椰子特异性基因序列进行设计合成得到，所述特异性基因序列在椰子Hd3a基因中的位置为451‑1300bp，所述椰子Hd3a基因的登录号为MH092984.1；

所述LAMP恒温扩增特异性引物为：

外引物F3：5’‑CTCCAAGTCCAAGTGACC‑3’

外引物B3：5’‑GTGGAGCTAGTTTTGTTCC‑3’

内引物FIB：

5’‑CATGGCTTCCCGATGGGTACCTCAGGGAGTATTTGCACTG‑3’内引物BIP：

5’‑GCTATATATTGGGCCGGACTTCGCAATCTCTTCTCTTCCTTGT‑3’环引物LB：5’‑ACTCTTCAGCGGGTGCTTAC‑3’

步骤2、采用LAMP恒温扩增反应体系，对植物蛋白饮料DNA样品进行LAMP恒温扩增，检测扩增产物的荧光信号，得到检测结果；其中，所述LAMP恒温扩增反应体系包括有所述LAMP恒温扩增特异性引物。

2.根据权利要求1所述的一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，其特征在于：步骤1中植物蛋白饮料为固体或含有固形物的液体时，固体植物蛋白饮料进行温水冲调，搅拌均匀，得到液态的植物蛋白饮料待提取样；含有固形物的液体植物蛋白饮料使用研磨机将固形物研磨充分，得到液态的植物蛋白饮料待提取样；对所述植物蛋白饮料待提取样进行DNA提取，得到步骤1的植物蛋白饮料DNA样品。

3.根据权利要求1或2所述的一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，其特征在于：所述LAMP恒温扩增反应体系为25μL，包括有内引物FIP100μmol/L和内引物BIP 100μmol/L各0.4μL，外引物F3 100μmol/L和外引物B3 100μmol/L各0.05μL，环引物LB 100μmol/L 0.2μL；其余试剂组分分别为：10×Thermo pol Buffer 2.5μL，MgSO4 100mmol/L 1μL，dNTPs 10mmol/L2.5μL，甜菜碱5mol/L 6μL，Bst酶8U/μL 1μL，250×染料0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 8.4μL。

4.根据权利要求3所述的一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，其特征在于：所述LAMP恒温扩增反应体系中，采用的恒温扩增仪的LAMP恒温扩增条件为：扩增温度是63℃，进行45个循环，每个循环的扩增时间是60s；采用的实时荧光PCR仪的荧光信号扩增条件为：第一步63℃条件下扩增30s，第二步63℃条件下扩增15s、进行45个循环，第三步63℃条件下扩增45s、进行45个循环。

说明书

一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物技术领域，具体是涉及一种用于检测植物蛋白饮料中椰子成分LAMP恒温扩增方法。

背景技术

[0002] 椰子是棕榈科植物椰子树的果实，椰汁及椰肉中含有蛋白质、糖类、油脂类、维生素类、钙、磷、铁等微量元素及矿物质，深受广大消费者的喜爱。近年来，以椰子为原料的植物蛋白饮料(如椰子汁)凭借其“天然、绿色、营养、健康”等优势得到迅猛发展，在当前市场上占比较重。随着市场需求激增和原料价格的上涨，部分生产企业为了减少生产成本，使用低价的大豆或其他廉价为原材料伪造椰子饮料，并以低价抢占市场。目前植物蛋白饮料针对椰子成分检测的方法没有相关的检验标准，相关文献仅见普通PCR检测方法，由于植物蛋白饮料在市场上流通大，普通PCR检验技术流程较繁琐，需通过电泳结果判断阴阳性，不能实时监控整个检测过程，此外对操作人员要求较高，难以在广大基层中开展大量推广应用。

[0003] LAMP检测技术，全称为环介导等温扩增技术(Loop‑mediated isothermal amplification，LAMP)，最早是日本学者在《Nucleic Acids Res》公开一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，该技术主要原理是利用具有链置换特异性的Bst DNA聚合酶和4～6条能够特异性识别靶标序列上多个特异性区域的引物，开启循环链置换反应，从而实现等温条件下的连续快速反应。该技术具有特异性强、灵敏度高、检测成本低、所需设备及人员要求不高，操作简单，反应时间短等优点，适合现场大批量样本快速检测。

[0004] 因此，非常有必要建立一套特异性好、灵敏度高、适合在基层及保障现场应用的植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，为抵制椰子蛋白饮料掺杂掺假问题提供高效的检测方法，为保障饮料行业食品质量与安全提供新的技术支撑。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提出一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，其对椰子成分鉴别的灵敏度高、特异性高，可用于植物蛋白饮料中椰子成分的快速检测。

[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0007] 一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，其包括有以下步骤：

[0008] 步骤1、准备植物蛋白饮料DNA样品，以及准备对植物蛋白饮料DNA样品进行LAMP恒温扩增的LAMP恒温扩增特异性引物；

[0009] 所述植物蛋白饮料DNA样品经超微量分光光度计测定后，其A260/A280在1.7‑2.0之间，DNA浓度＞10ng/μL，于‑20℃保存备用；

[0010] 所述LAMP恒温扩增特异性引物是选取椰子特异性基因序列进行合成得到，所述椰子基因采用：椰子3a(Hd3a)基因，其登录号为MH092984.1；所述特异性基因序列在所述椰子基因中的位置为451‑1300bp；

[0011] 所述LAMP恒温扩增特异性引物为：

[0012] 外引物F3：5’‑CTCCAAGTCCAAGTGACC‑3’

[0013] 外引物B3：5’‑GTGGAGCTAGTTTTGTTCC‑3’

[0014] 内引物FIB：5’‑CATGGCTTCCCGATGGGTACCTCAGGGAGTATTTGCACTG‑3’[0015] 内引物BIP：5’‑GCTATATATTGGGCCGGACTTCGCAATCTCTTCTCTTCCTTGT‑3’[0016] 环引物LB：5’‑ACTCTTCAGCGGGTGCTTAC‑3’

[0017] 步骤2、采用LAMP恒温扩增反应体系，对植物蛋白饮料DNA样品进行LAMP恒温扩增，检测扩增产物的荧光信号，得到检测结果；其中，所述LAMP恒温扩增反应体系包括有所述LAMP恒温扩增特异性引物。

[0018] 优化方案，步骤1中植物蛋白饮料为固体或含有固形物的液体时，固体植物蛋白饮料按该固体植物蛋白饮料说明书进行温水冲调，搅拌均匀，得到液态的植物蛋白饮料待提取样；含有固形物的液体植物蛋白饮料使用研磨机将固形物研磨充分，得到液态的植物蛋白饮料待提取样；对所述植物蛋白饮料待提取样进行DNA提取，得到步骤1的植物蛋白饮料DNA样品。

[0019] 优化方案，所述LAMP恒温扩增反应体系为25μL，包括有内引物FIP(100μmol/L)和内引物BIP(100μmol/L)各0.4μL，外引物F3(100μmol/L)和外引物B3(100μmol/L)各0.05μL，环引物LB(100μmol/L)0.2μL；其余试剂组分分别为：10×Thermo pol Buffer2.5μL，MgSO4(100mmol/L)1μL，dNTPs(10mmol/L)2.5μL，甜菜碱(5mol/L)6μL，Bst酶(8U/μL)1μL，染料(250×)0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 8.4μL。

[0020] 优化方案，所述LAMP恒温扩增反应体系中，采用的恒温扩增仪的LAMP恒温扩增条件为：扩增温度是63℃，进行45个循环，每个循环的扩增时间是60s；采用的实时荧光PCR仪的扩增条件为：第一步63℃条件下扩增30s，第二步63℃条件下扩增15s、进行45个循环，第三步63℃条件下扩增45s、进行45个循环。

[0021] 本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步：

[0022] 1、本发明提供了一种用于椰子成分鉴定的特异性基因序列，该序列具有很高的特异性，可以用于椰子成分的定性检测，具有商业化开发价值。申请人用该特异性基因序列设计的LAMP恒温扩增特异性引物及LAMP恒温扩增反应体系对45种植物、动物材料DNA样品进行特异性检测，结果显示本发明对椰子DNA样品扩增阳性，而对其他多个物种DNA样品均扩增阴性，说明该特异性基因序列具有很高的特异性，可以作为椰子成分定性检测的特异性标志物。另外，申请人还对本发明进行了灵敏度检测及稳定性检测，结果说明本发明的方法具有灵敏度高和稳定性的特点。

[0023] 2、本发明的检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法中提供了一种可特异性鉴定椰子成分的LAMP恒温扩增特异性引物，其特异性好，对椰子源性成分可实现特异性检测，而对椰子以外的其他成分则不能特异性扩增；此外，本发明还提供了一种LAMP恒温扩增反应体系，该体系能在1小时内即可实现样品中是否含有椰子成分，具有检测高效快速简便的特点。

[0024] 3、本发明利用所述的LAMP恒温扩增特异性引物可快速、高通量地检测植物蛋白饮料中是否存在椰子成分，且所需仪器设备低廉，操作简单，效率高，对检验人员要求不高，适用于广大基层及现场保障的快速检测。

[0025] 4、本发明的检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，适用各类植物蛋白饮料椰子成分的检测，包括固体饮料、液体饮料、半固体饮料等，可以大量推广应用，对保障产品的质量，保护消费者权益，维护正常的饮料行业秩序提供技术支持，为食品的市场监督管理部门提供技术支持。

附图说明

[0026] 图1为验证采用本发明的方法进行20种植物蛋白饮料椰子成分LAMP扩增图谱。

[0027] 图2为验证采用本发明的方法进行椰子成分检测的LAMP特异性扩增图谱。

[0028] 图3为验证采用本发明的方法进行椰子成分检测的LAMP灵敏度扩增图谱。

[0029] 图4为验证采用本发明的方法进行椰子成分检测的LAMP稳定性扩增图谱。

具体实施方式

[0030] 下面结合附图对本发明作进一步说明。

[0031] 实施例1

[0032] 一种检测植物蛋白饮料椰子成分LAMP恒温扩增方法，其包括有以下步骤：

[0033] 步骤1、准备植物蛋白饮料DNA样品，以及准备对植物蛋白饮料DNA样品进行LAMP恒温扩增的LAMP恒温扩增特异性引物；

[0034] 本步骤中，待检测的植物蛋白饮料为固体或含有固形物的液体时，固体植物蛋白饮料按该固体植物蛋白饮料说明书进行温水冲调，搅拌均匀，得到液态的植物蛋白饮料待提取样；含有固形物的液体植物蛋白饮料使用研磨机将固形物研磨充分，得到液态的植物蛋白饮料待提取样；

[0035] 使用“磁珠法提取植物蛋白饮料DNA”(梁美丹，肖剑，陈楷，黄志深，劳嘉倩.食品安全质量检测学报，2021，12(13):5363‑5368.)对所述植物蛋白饮料待提取样进行DNA提取，提取方法详见文献资料，得到所述植物蛋白饮料DNA样品；所述植物蛋白饮料DNA样品经超微量分光光度计测定后，其A260/A280在1.7‑2.0之间，DNA浓度＞10ng/μL，于‑20℃保存备用；

[0036] 所述LAMP恒温扩增特异性引物是选取椰子特异性基因序列进行设计合成得到。具体是：从NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载椰子(Cocos nucifera)3a(Hd3a)基因(登录号：MH092984.1)，选取特异性基因序列、位置为451‑1300bp，利用Primer Explorer Version 4(http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.html)设计一组LAMP恒温扩增引物：

[0037] 外引物F3：5’‑CTCCAAGTCCAAGTGACC‑3’

[0038] 外引物B3：5’‑GTGGAGCTAGTTTTGTTCC‑3’

[0039] 内引物FIB：5’‑CATGGCTTCCCGATGGGTACCTCAGGGAGTATTTGCACTG‑3’[0040] 内引物BIP：5’‑GCTATATATTGGGCCGGACTTCGCAATCTCTTCTCTTCCTTGT‑3’[0041] 环引物LB：5’‑ACTCTTCAGCGGGTGCTTAC‑3’

[0042] 步骤2、采用LAMP恒温扩增反应体系，对植物蛋白饮料DNA样品进行LAMP恒温扩增，检测扩增产物的荧光信号，得到检测结果；其中，所述LAMP恒温扩增反应体系包括有所述LAMP恒温扩增特异性引物，具体见表1。

[0043] LAMP恒温扩增反应体系的反应程序为：

[0044] 采用的恒温扩增仪的LAMP恒温扩增条件为：扩增温度是63℃，进行45个循环，每个循环的扩增时间是60s，共计扩增时间为45min；

[0045] 采用的实时荧光PCR仪的扩增条件为：第一步63℃条件下扩增30s，第二步63℃条件下扩增15s、进行45个循环，第三步63℃条件下扩增45s、进行45个循环，共计扩增时间约为50min。

[0046]

[0047] 本实施例对20种植物蛋白饮料DNA样品进行了椰子成分的检测，20种植物蛋白饮料DNA样品名称及其椰子成分的检测结果，见图1及表2。

[0048]

[0049] 从图1和表2可以看出，有6份植物蛋白饮料中含有椰子成分，本发明的检测结果与其产品说明书中标示含有的成分完全一致；其余12份样品标识含有核桃、芝麻、榛子、杏仁、花生、大豆成分，本发明的检测结果均为阴性结果。

[0050] 结论：6份样品声称含有椰子成分的植物蛋白饮料，本发明检测椰子成分为阳性，12份声称不含椰子成分的植物蛋白饮料，本发明检出椰子成分为阴性，检出结果100％符合。同时也说明采用本发明的检测方法可以大批量地检测植物蛋白饮料是否存在椰子成分。

[0051] 综上所述，本发明设计的椰子成分的LAMP恒温扩增特异性引物和LAMP恒温扩增反应体系，特异好，灵敏度高，能快速实现植物蛋白饮料中椰子成分的定性检测，该检测方法无需依赖高端昂贵的仪器设备、检测成本低、对专业技术人员要求较低，适用于基层及现场保障的快速检测，具有良好的应用前景。此外，所述LAMP恒温扩增特异性引物可进一步制成椰子成分LAMP检测试剂盒，应用于食品等类别样品中椰子成分的检测试剂盒，应用范围广，实用性强。

[0052] 实施例2

[0053] 本实施例是对本发明的LAMP恒温扩增反应体系及LAMP恒温扩增特异性引物的特异性进行检测，具体是：使用实施例1的LAMP恒温扩增反应体系对本实施例中供试的45种植物、动物材料DNA样品进行检测，检测扩增产物的荧光信号。检测结果见图2和表3。

[0054] 从图2和表3可看出，本发明对椰子DNA样品扩增阳性，有明显S型扩增曲线，而对其他多个物种DNA样品均扩增阴性，无明显S型扩增曲线。

[0055] 结论：本发明的检测方法具有良好的物种特异性。

[0056]

[0057] 实施例3

[0058] 本实施例是对本发明的LAMP恒温扩增反应体系及LAMP恒温扩增特异性引物的灵敏度进行检测，具体是：以绿豆为基质，按比例制备成不同质量分数的椰子混合样品，椰子混合样品中椰子DNA的质量分数包括有：50％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％，其中0.01％的椰子混合样品是由质量分数为0.1％的椰子混合样品DNA稀释10倍获得，按照实施例1的LAMP恒温扩增反应体系和条件进行LAMP恒温扩增，试验重复6次。

[0059] 结果：椰子LAMP荧光扩增样品质量分数在50％、10％、5％、1％、0.1％的椰子混合样品均有明显的S型扩增曲线，椰子混合样品的质量分数为0.01％则未见S型扩增曲线，表明该方法的灵敏度为0.1％，扩增图谱见图3。

[0060] 实施例4

[0061] 本实施例是对本发明的LAMP恒温扩增反应体系及LAMP恒温扩增特异性引物的稳定性进行检测，具体是：对实施例3中质量分数为0.1％的椰子混合样品DNA，按照实施例1的LAMP恒温扩增反应体系和条件进行LAMP恒温扩增，重复10次，结果椰子质量分数为0.1％的椰子混合样品均能扩增出明显的S型曲线，证明该方法具有良好的稳定性，扩增图谱见图4。