生物标志物Jmjd1c的类风湿性关节炎相关应用

摘要

本发明涉及生物标志物Jmjd1c的类风湿性关节炎相关应用，具体包括：生物标志物Jmjd1c用于制备类风湿性关节炎的诊断工具或用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物的用途；含有Jmjd1c检测试剂的类风湿性关节炎诊断工具；含有JMJD1C激动剂的治疗或预防类风湿性关节炎的药物；JMJD1C激动剂用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物的用途。本发明首次发现并证实Jmjd1c基因表达与类风湿性关节炎的密切相关性，确定生物标志物Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白可通用于诊断类风湿性关节炎，并据此开发出针对类风湿性关节炎的诊断工具，以及治疗或预防类风湿性关节炎的药物。

权利要求

1.一种Jmjd1c基因mRNA表达量检测试剂在制备针对类风湿性关节炎的诊断工具的用途，所述Jmjd1c基因的GeneBank序列号为NC_000010.11:c63167221‑63521890 Homo sapiens chromosome 10,GRCh38.p13 Primary Assembly。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述诊断工具的类型包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述Jmjd1c基因mRNA表达量检测试剂包括Jmjd1c基因或转录本的特异性引物、和/或Jmjd1c基因或转录本的特异性识别探针；所述Jmjd1c基因或转录本的特异性引物包括特异扩增Jmjd1c基因的实时定量PCR引物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征是，所述实时定量PCR引物由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成，或由SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物组成。

说明书

生物标志物Jmjd1c的类风湿性关节炎相关应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物标志物Jmjd1c的类风湿性关节炎相关应用，具体为生物标志物Jmjd1c在诊断与治疗类风湿性关节炎中的应用，属于分子诊断与治疗技术领域。

背景技术

[0002] 类风湿性关节炎是一种病因不清、预后不明的慢性自身免疫性疾病，可累及全身各处关节，引起骨与软骨损伤，最终导致严重的关节损坏。据统计，大约35％的类风湿性关节炎患者在疾病发生的10年之后，均会由于各种原因失去工作能力。关节的损伤是类风湿性关节炎导致最为常见的结果，主要表现为骨质的流失和软骨的缺损，关节的破坏能在影像学上得到验证。另外，作为一种系统性的免疫性疾病，类风湿性关节炎还能导致眼部炎症，包括巩膜炎、虹膜炎、角膜炎；导致C1、C2颈椎病变，甚至引起神经病变；还能引起肺部发生类风湿性关节炎综合征，包括间质性肺纤维化、类风湿矽肺、肺结节以及胸腔积液。由于其病因的复杂性，类风湿性关节炎患者大多难以治愈，临床治疗只能以控制疾病的活动性、提高患者的生存质量为目标。早期诊断、早期治疗对于提高类风湿性关节炎患者的预后至关重要，有助于降低死亡率，减少并发症，从而提高患者的生存质量。

[0003] 据流行病学统计分析，类风湿性关节炎在全球人群中的患病率大约是0.5％到1％左右，对于北美和北欧的人群更为易感，而非洲和中国的南部则发病率相对较低。类风湿性关节炎在女性中更为常见，大约3/4(77.5％)的患者都是女性。英国的一项研究表明，在英国女性患病率大约是1.16％，而男性患病率则是0.44％。几乎所有的年龄段都有可能发生类风湿性关节炎，但是大多病人中位发病年龄为50岁左右。

[0004] 目前，类风湿性关节炎的病因还不甚明朗，但是一般认为环境、遗传因素等多种因素共同作用，促使关节炎的发生。研究表明，吸烟能够明显增加类风湿性关节炎的患病率，而且呈剂量依赖性的关系。另外，高出生体重、饮酒、紫外线照射、空气污染、糖尿病都是已知的类风湿性关节炎的致病因素。遗传因素被认为在关节炎的发病危险因素中能占到50％‑60％，据报道，具有类风湿性关节炎家族遗传史的家庭，其成员类风湿性关节炎发病的危险因素能增加3到9倍。广为认可的与类风湿性关节炎相关的基因包括人类白细胞抗原HLA‑DR45和‑DRB1；另外全基因组关联分析也发现了一些其他相关基因，包括STAT4、CD40、PADI4、PTPN22等。

[0005] 类风湿性关节炎患者关节损伤主要由各种免疫细胞共同介导，包括树突状细胞、T细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、成纤维细胞、破骨细胞等。患者自身的滑膜组织被这些免疫细胞识别为“异己”的成分进行了免疫攻击，诱发持续性、慢性迁延的炎症浸润，引起滑膜的损伤、骨质和软骨的缺损，最终导致关节的肿胀、变形。近几十年，研究者逐渐认识到B细胞以及类风湿性关节炎相关的自身抗体在疾病发生发展中的重要作用，其中广为人知的自身抗体便是类风湿因子(RF)和抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)。类风湿因子是一种以变性IgG的Fc片段为靶抗原的自身抗体，包括IgM、IgG、IgA三种亚类。抗瓜氨酸蛋白抗体一大特点在于其存在丰富的聚糖可变结构域，这一结构域能够被瓜氨酸蛋白特异性的B细胞识别，传递活化信息，导致B细胞过度反应。近年来也发现了一些其他自身免疫性抗体，和ACPA类似，能够识别其他的翻译后修饰，比如抗氨甲酰化抗体、抗乙酰化抗体。

[0006] 类风湿性关节炎的典型症状是呈对称的、多发性的手、足等关节炎症，其炎症一般具有慢性持续性等特点。但是实际诊断的过程中，大多数患者的症状却并不典型。虽然大多病人的关节炎症呈现慢性缓慢进展这一特点，但也有一部分病人是急性发病。类风湿性关节炎患者典型的症状是关节疼痛、僵直和肿胀，但是在早期类风湿性关节炎诊断的时候，这些症状尚不明显，易于与其他一些疾病混淆，为早期诊断和治疗带来困难。

[0007] 随着医疗技术的发展，一系列实验室指标也作为类风湿性关节炎的诊断或早筛依据，比如上文中类风湿因子和抗瓜氨酸蛋白抗体都是经典的实验室类风湿性关节炎的诊断指标。但据统计，有大约30％患者体内血清呈现类风湿因子阴性，大约33％患者体内血清呈现抗瓜氨酸蛋白抗体阴性。一般来说，可以根据患者体内是否存在这两种自身免疫性抗体将类风湿性关节炎患者分为两类：血清反应阴性或者阳性。一般认为，血清自身抗体与患者的临床疾病评分相关，能影响患者的预后。但是据统计，在早期类风湿性关节炎患者中仅有50％是血清反应阳性的，即便是确诊为类风湿性关节炎的患者中，也仅有80％为阳性的。这说明，实验室检测血清自身抗体这一指标存在一定程度的假阴性存在。另外，类风湿因子也会在其他一些患者体内存在，比如30％的系统性红斑狼疮患者体内类风湿因子阳性，丙型肝炎患者也存在类风湿因子阳性的可能，老年人也会随着年龄的增加呈现类风湿因子增加的变化。这也说明实验室血清指标也存在一定的假阳性现象。患者症状的多样性、实验室检测结果存在的假阴性、假阳性现象，给类风湿性关节炎患者的诊断与治疗带来了一定的困难，目前临床上急需一项准确而又可靠的指标，用于诊断类风湿性关节炎。此外，据统计，与健康人相比，类风湿性关节炎患者的寿命将明显缩短3‑12年。如果从症状发生开始尽早确诊，在发病的窗口期内开始治疗，可以明显延缓疾病进展，提高患者的预后。因而寻找一种能在类风湿性关节炎发病早期有效诊断疾病、并对疾病的治疗有一定帮助的指标或者方法至关重要。

发明内容

[0008] 本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提出一种生物标志物Jmjd1c的类风湿性关节炎相关应用，能够通过生物标志物Jmjd1c实现对类风湿性关节炎的诊断或治疗。

[0009] 本发明解决其技术问题的技术方案如下：

[0010] 一种生物标志物的用途，其特征是，所述生物标志物为Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白；所述Jmjd1c基因的GeneBank序列号为NC_000010.11:c63167221‑63521890Homo sapiens chromosome 10,GRCh38.p13 Primary Assembly；所述JMJD1C蛋白由Jmjd1c基因编码获得；所述用途为用于制备类风湿性关节炎的诊断工具，或用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物。

[0011] 本发明还提出：

[0012] 一种针对类风湿性关节炎的诊断工具，其特征是，包括Jmjd1c检测试剂，所述Jmjd1c检测试剂针对的目标生物标志物为Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白；所述Jmjd1c基因的GeneBank序列号为NC_000010.11:c63167221‑63521890Homo sapiens chromosome 10,GRCh38.p13 Primary Assembly；所述JMJD1C蛋白由Jmjd1c基因编码获得。

[0013] 优选地，所述诊断工具的类型包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。

[0014] 优选地，所述Jmjd1c检测试剂包括Jmjd1c基因表达量检测试剂；

[0015] 当针对Jmjd1c基因时，所述Jmjd1c基因表达量检测试剂包括Jmjd1c基因mRNA定量检测试剂；

[0016] 当针对JMJD1C蛋白时，所述Jmjd1c基因表达量检测试剂包括JMJD1C蛋白定量检测试剂。

[0017] 更优选地，所述Jmjd1c基因mRNA定量检测试剂至少包括Jmjd1c基因或转录本的特异性引物、Jmjd1c基因或转录本的特异性识别探针之一；或者，所述JMJD1C蛋白定量检测试剂包括特异性结合JMJD1C蛋白的抗体或抗体片段。

[0018] 更优选地，所述Jmjd1c基因或转录本的特异性引物包括特异扩增Jmjd1c基因的实时定量PCR引物；或者，所述特异性结合JMJD1C蛋白的抗体或抗体片段为单克隆或多克隆，所述抗体或抗体片段的具体形式包括F(ab′)2、Fab′、Fab、scFv、dsFv或其聚合物、二聚化V区、或含有CDR的肽；或者，所述JMJD1C蛋白定量检测试剂还包括编码特异性结合JMJD1C蛋白的抗体或抗体片段核酸，或含有该核酸的载体，或含有该载体的细胞。

[0019] 更优选地，所述实时定量PCR引物由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成，或由SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物组成；或者，所述抗体或抗体片段连接有标记物。

[0020] 本发明还提出：

[0021] 一种治疗或预防类风湿性关节炎的药物，其特征是，包括JMJD1C激动剂；所述JMJD1C激动剂为Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白的激动剂；所述Jmjd1c基因的GeneBank序列号为NC_000010.11:c63167221‑63521890Homo sapiens chromosome 10,GRCh38.p13 Primary Assembly；所述JMJD1C蛋白由Jmjd1c基因编码获得。

[0022] 优选地，所述JMJD1C激动剂的功能至少包括增加Jmjd1c基因表达量、增加JMJD1C蛋白活性、增加Jmjd1c基因上游基因或下游基因的表达之一；或者，所述JMJD1C激动剂包括针对Jmjd1c基因表达的外源过表达载体、正向激活的CRISPR SAM技术工具、基因激活的saRNA、正调控型的转录调控因子、或激活型靶向分子化合物。

[0023] 本发明还提出：

[0024] JMJD1C激动剂用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物的用途，所述JMJD1C激动剂为Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白的激动剂；所述Jmjd1c基因的GeneBank序列号为NC_000010.11:c63167221‑63521890Homo sapiens chromosome 10,GRCh38.p13 Primary Assembly；所述JMJD1C蛋白由Jmjd1c基因编码获得。

[0025] 本发明的有益效果如下：

[0026] 本发明首次发现并证实Jmjd1c基因表达与类风湿性关节炎的密切相关性，通过临床患者数据验证，加以敲除基因小鼠进行疾病模型佐证，结果具有可靠性、可重复性。根据上述发现，本发明确定生物标志物Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白可通用于诊断类风湿性关节炎，不仅以区分正常人和类风湿性关节炎患者，还可以对类风湿性关节炎患者的疾病活动性进行区分，鉴定患者的疾病预后，本发明据此开发出针对类风湿性关节炎的诊断工具，并开发出治疗或预防类风湿性关节炎的药物。

附图说明

[0027] 图1为本发明实施例1比较类风湿关节炎患者与健康对照外周血单个核细胞的Jmjd1c基因表达量差异的统计图。

[0028] 图2为本发明实施例1的比较类风湿性关节炎患者与健康对照外周血B细胞中Jmjd1c基因表达量差异的统计图。

[0029] 图3为本发明实施例2的结果图。其中a图为分析类风湿性关节炎患者外周血B细胞Jmjd1c基因的mRNA水平与外周血浆细胞数量的相关性统计图，b图为分析类风湿性关节炎患者外周血B细胞Jmjd1c基因的mRNA水平与临床疾病评分的相关性统计图。

[0030] 图4为本发明实施例3中，与对照小鼠相比，B细胞特异性缺失Jmjd1c基因的小鼠其B细胞中Jmjd1c基因的mRNA水平(a图)和蛋白水平(b图)的变化及统计图。

[0031] 图5为本发明实施例4中，通过构建胶原诱导的关节炎模型，比较对照小鼠和B细胞特异性敲除Jmjd1c的小鼠的关节炎发病情况(a图)、小鼠四肢关节的疾病评分的统计图(b图)及发病小鼠关节照片(c图)。

[0032] 图6为本发明实施例5分析胶原诱导的关节炎模型小鼠血清中抗原特异性的抗体IgG2b、IgG2c、IgG1水平的统计图。

[0033] 图7为本发明实施例6通过Crispr技术改造B1‑8hiCas9小鼠B细胞进行过继转移实验后浆细胞生成的流式图及浆细胞比例统计图。

具体实施方式

[0034] 本发明具体实施的技术方案详述如下。

[0035] (1)本发明提出了一种生物标志物的用途，该生物标志物为Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白；Jmjd1c基因的GeneBank序列号为NC_000010.11:c63167221‑63521890Homo sapiens chromosome 10,GRCh38.p13 Primary Assembly；JMJD1C蛋白由Jmjd1c基因编码获得；该用途为用于制备类风湿性关节炎的诊断工具，或用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物。注：Jmjd1c基因的序列长度为354670bp，其具体序列可按上述GeneBank序列号在NCBI的基因数据库中查询获得。

[0036] 其中，用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物的用途中含有对类风湿性关节炎药物的筛选，筛选过程包括：通过在对骨细胞添加测试药物后或在对模型动物施用测试药物后的某个时期通过测量外周血B细胞中Jmjd1c基因或者JMJD1C蛋白的表达水平来测定药物效果。更具体地说，当Jmjd1c基因或者JMJD1C蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后有所升高、甚至能恢复到正常水平时，可选择该药物作为治疗类风湿性关节炎的药物。

[0037] (2)本发明提出了一种针对类风湿性关节炎的诊断工具，包括Jmjd1c检测试剂，该Jmjd1c检测试剂针对的目标生物标志物为Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白。

[0038] 具体地，上述Jmjd1c检测试剂包括Jmjd1c基因表达量检测试剂。当针对Jmjd1c基因时，该Jmjd1c基因表达量检测试剂包括Jmjd1c基因mRNA定量检测试剂；当针对JMJD1C蛋白时，该Jmjd1c基因表达量检测试剂包括JMJD1C蛋白定量检测试剂。

[0039] 更具体地，Jmjd1c基因mRNA定量检测试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。其中PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT‑PCR(逆转录酶‑PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR‑RFLP法、原位RT‑PCR法、PCR‑SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR‑SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR‑PCR法、和PCR‑SSCP(单链构象多态性)法来检测。

[0040] Jmjd1c基因mRNA定量检测试剂至少包括Jmjd1c基因或转录本的特异性引物、Jmjd1c基因或转录本的特异性识别探针之一(即：既可以择一，也可以两者同时包括)。其中，Jmjd1c基因或转录本的特异性引物包括特异扩增Jmjd1c基因的实时定量PCR引物。引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。具体序列示例：实时定量PCR引物由SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物组成，或由SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物组成；或者，所述抗体或抗体片段连接有标记物。

[0041] 更具体地，JMJD1C蛋白定量检测试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

[0042] JMJD1C蛋白定量检测试剂包括特异性结合JMJD1C蛋白的抗体或抗体片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或抗体片段，只要它结合靶蛋白质即可。该抗体或抗体片段可以是单克隆或多克隆。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体或抗体片段的具体形式可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤；然后从杂交瘤培养物收集抗体；最后可以通过使用被用作抗原的JMJD1C蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对JMJD1C蛋白的单克隆抗体。再如，可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

[0043] 抗体或抗体片段可以连接有标记物，标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒‑NH2、生物素标记试剂盒‑SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒‑NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒‑SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒‑NH2、过氧化物酶标记试剂盒‑NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒‑NH2、藻胆蛋白标记试剂盒‑SH、B‑藻红蛋白标记试剂盒‑NH2，B‑藻红蛋白标记试剂盒‑SH、R‑藻红蛋白标记试剂盒‑NH2、R‑藻红蛋白标记试剂盒S(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒‑NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒‑NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒‑NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ‑标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

[0044] 此外，JMJD1C蛋白定量检测试剂还可以包括编码特异性结合JMJD1C蛋白的抗体或抗体片段核酸，或含有该核酸的载体，或含有该载体的细胞。

[0045] 具体地，在本发明中，用于Jmjd1c基因表达量检测的样品经由本领域常规技术获得，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。该样品可以是(但不限于)：外周血、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、胃壁细胞或胃液。在本发明的具体实施方案中，样品来自受试者的组织。

[0046] 具体地，在本发明的诊断工具中，试剂通常存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种试剂如引物或探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。

[0047] 具体地，在本发明的诊断工具中，试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。此外，试剂盒中还可包括描述检测类风湿性关节炎的方法的说明书等。试剂盒还可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于Jmjd1c基因或转录本的检测来判断类风湿性关节炎的试剂均包含在本发明范围内。

[0048] 具体地，本发明的诊断工具可实施于诊断类风湿性关节炎的方法，该方法包括以下步骤：

[0049] S1.获取受试者的血液样品；

[0050] S2.分离得到受试者的B淋巴细胞；

[0051] S3.检测受试者B淋巴细胞中Jmjd1c基因表达水平；

[0052] S4.将测得的Jmjd1c基因表达水平与受试者的疾病相关性关联起来；

[0053] S5.与正常对照相比，Jmjd1c基因表达水平在统计学上明显下降，表明受试者被判断患有类风湿性关节炎、或患有类风湿性关节炎的风险高。

[0054] (3)本发明提出了一种治疗或预防类风湿性关节炎的药物，包括JMJD1C激动剂；该JMJD1C激动剂为Jmjd1c基因和/或JMJD1C蛋白的激动剂。本发明还提出该JMJD1C激动剂用于制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物的用途。

[0055] 具体地，JMJD1C激动剂的功能至少包括增加Jmjd1c基因表达量、增加JMJD1C蛋白活性、增加Jmjd1c基因上游基因或下游基因的表达之一。

[0056] JMJD1C激动剂包括针对Jmjd1c基因表达的外源过表达载体、正向激活的CRISPR SAM技术工具、基因激活的saRNA、正调控型的转录调控因子、或激活型靶向分子化合物。

[0057] 具体地，本发明的药物可实施于类风湿性关节炎的治疗方法，该方法包括增加Jmjd1c基因或JMJD1C蛋白表达，具体包括增加Jmjd1c基因表达量、增加JMJD1C蛋白活性、增加Jmjd1c基因上游基因或下游基因的表达。

[0058] 上述药物可以是药物组合物，即采用上述激动剂通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂、保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式。上述激动剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的上述激动剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

[0059] 上述药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。上述药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。上述药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

[0060] 在本发明的上下文中，“类风湿性关节炎诊断”包括判断受试者是否已经发生类风湿性关节炎、判断受试者是否存在患有类风湿性关节炎的风险、判断类风湿性关节炎患者是否已经复发。

[0061] 在本发明的上下文中，“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

[0062] 下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0063] 实施例1

[0064] 本实施例的主要内容为：根据现有数据库数据分析健康对照与类风湿性关节炎患者Jmjd1c基因表达量差异。

[0065] 在NCBI GEO数据库里以B淋巴细胞与类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)为关键词进行检索，筛选后得到以下GSE号的数据，并进行进一步生物信息学分析：

[0066] (1)GSE93272：将从NCBI GEO数据库获取的探针表达量矩阵比对至[HG‑U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0Array探针基因名称矩阵，获取基因名称与表达量矩阵，一个基因对应多个探针的情形在根据统计学假设检验原则除去明显异常值后进行取中位数处理。使用Microarray Suite version 5.0(MAS 5.0)软件进行初始的标化和分析。之后根据两组数据分布对数据差异进行t检验或者秩和检验。

[0067] (2)GSE93777：将从NCBI GEO数据库获取的探针表达量矩阵比对至[HG‑U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0Array探针基因名称矩阵，获取基因名称与表达量矩阵，一个基因对应多个探针的情形在根据统计学假设检验原则除去明显异常值后进行取中位数处理。使用GCOS软件进行初始的标化和分析。之后根据两组数据分布对数据差异进行t检验或者秩和检验。

[0068] (3)GSE23561:将从NCBI GEO数据库获取的探针表达量矩阵比对至Human 50K Exonic Evidence‑Based Oligonucleotide array探针基因名称矩阵，获取基因名称与表达量矩阵，一个基因对应多个探针的情形在根据统计学假设检验原则除去明显异常值后进行取中位数处理。使用GCOS软件进行初始的标化和分析。之后根据两组数据分布对数据差异进行t检验或者秩和检验。

[0069] (4)GSE4588：将从NCBI GEO数据库获取的探针表达量矩阵比对至[HG‑U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0Array探针基因名称矩阵，获取基因名称与表达量矩阵，一个基因对应多个探针的情形在根据统计学假设检验原则除去明显异常值后进行取中位数处理。使用GCOS软件进行初始的标化和分析。之后根据两组数据分布对数据差异进行t检验或者秩和检验。

[0070] 结果：如图1所示，相较于健康对照，类风湿性关节炎患者其Jmjd1c基因表达量明显降低；如图2所示，进一步分析B细胞数据后发现，相较于健康对照，类风湿性关节炎患者其B细胞中Jmjd1c基因表达量明显降低，这提示Jmjd1c未来可能作为一种确诊或筛选类风湿性关节炎的指标。

[0071] 实施例2

[0072] 本实施例的主要内容为：检测类风湿性关节炎患者外周血B细胞Jmjd1c基因表达量差异与临床疾病评分之间的相关性。

[0073] 37例类风湿关节炎患者的外周血样品来自于医院风湿科患者，所有病例的诊断符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎分类标准，其中女性29例，男性8例，平均年龄56岁。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。

[0074] 一、患者外周血淋巴细胞的分离(GE Ficoll‑Paque淋巴细胞分离液)

[0075] (1)患者采血均由临床执业护士进行，采用肝素抗凝管，采血后3h内进行处理。

[0076] (2)将抗凝的静脉外周血置于室温平衡5min左右，等体积加入室温放置的无菌生理盐水缓冲液进行稀释，来回颠倒混匀大约5次。

[0077] (3)取一洁净的15ml离心管，底部加入4ml GE Healthcare公司的Ficoll‑Paque淋巴细胞分离液，将上述稀释过的血液样品沿着管壁轻柔加入，使得血液浮在Ficoll分离液上方。

[0078] (4)18℃‑20℃，400g，以最低的升降速离心大约30min，此时可发现样品分为四层：第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。

[0079] (5)将第二层乳白色淋巴细胞层轻轻吸出，加入10ml的缓冲液PBS来回颠倒混匀，1500rpm室温离心5min进行洗涤细胞。

[0080] (6)此时可见淋巴细胞沉淀为白色，将上清弃去，加入1ml缓冲液重悬细胞沉淀。

[0081] 二、患者外周血B淋巴细胞的分选(BD Aria II流式细胞分选仪)

[0082] (1)取上述淋巴细胞悬液500ul于流式管中，1500rpm离心5min沉淀细胞。

[0083] (2)稀释流式抗体：按照抗体的稀释比吸取以下抗体于200ul PBS缓冲液中，vortex混匀数秒，12000rpm 4℃离心5min。抗体为anti‑human CD19pecy7。

[0084] (3)将(1)中上清尽量弃去，加入离心弃杂质的抗体混匀液，轻轻吹打混匀，4℃避光染色15min。

[0085] (4)加入3ml PBS缓冲液稀释洗涤细胞，1500rpm离心5min。

[0086] (5)将上清弃去，加入1ml PBS缓冲液重悬细胞，1：3000加入DAPI，将细胞悬液经由100微米的滤膜过滤，即可通过流式细胞仪分选。

[0087] (6)流式细胞仪分选时，目的细胞为DAPI染色阴性，CD19 pecy染色阳性的B细胞。

[0088] (7)收集管中加入750ul Trizol LS裂解液，分选大约3万个B细胞，总收集体积大约1ml时停止分选。

[0089] (8)将收集管来回轻轻混匀5次，充分裂解细胞，此时可直接进行下一步RNA提取，或者暂时冻存于‑80℃保存。

[0090] 三、患者外周血浆细胞检测(Beckman Cytoflex流式细胞分析仪)

[0091] (1)稀释流式抗体：按照抗体的稀释比吸取以下抗体于200ul PBS缓冲液中，vortex混匀数秒，12000rpm 4℃离心5min；抗体为anti‑human CD3APC；anti‑human CD16 APC；anti‑human CD14 APC；anti‑human CD56 APC；anti‑human CD19 pecy7；anti‑human IgD FITC；anti‑human CD27 Apcy7；anti‑human CD38 PE；anti‑human CD138 bv605。

[0092] (2)吸取一、(6)中细胞悬液500ul于1.5ml EP管中，5000rpm，4℃离心2min，弃上清。

[0093] (3)将离心后的抗体上清加入细胞沉淀中，轻轻垂悬细胞，4℃避光染色15min。

[0094] (4)加入1ml PBS缓冲液稀释洗涤细胞，5000rpm离心2min，沉淀细胞；

[0095] (5)加入200ul PBS缓冲液轻轻重悬细胞，即可上机进行流式分析，目的浆细胞表‑ ‑ + hi hi +面marker为：CD3CD14CD16‑CD56‑B220CD27 CD38 CD138。

[0096] 四、患者外周血B淋巴细胞mRNA提取及反转录

[0097] (1)由于RNA极易降解，提取过程必须严格佩戴口罩、手套，避免RNA酶污染。

[0098] (2)按照每1ml体积中加入200ul氯仿的比例，在Trizol LS裂解过的样品中加入氯仿，震荡混匀15s,切记不要使用螺旋混匀仪，以免剧烈震荡使得基因组断裂，室温静置5‑10min。

[0099] (3)4℃，12000g离心15min，可见样品分为3层，其中上层的透明水相为RNA层，中间的白膜层为蛋白，下层的粉色为DNA层；将上层的RNA透明水相小心吸出，切记不要触动到下层，转移至一个新的1.5ml EP管内。

[0100] (4)加入500ul异丙醇，来回颠倒混匀10次，室温静置10‑15min，沉淀RNA。

[0101] (5)4℃，10000g离心10min，此时RNA沉淀于管底部。

[0102] (6)将上清弃去，加入1ml 75％乙醇，轻轻垂悬洗涤沉淀。

[0103] (7)4℃，8000g离心5min，尽量弃去上清，室温晾干5‑10min，不要过度晾干，以免后续RNA难以溶解。

[0104] (8)加入20‑30ul无DNA/RNA酶的水，轻轻垂悬溶解沉淀，于55℃‑60℃加热溶解5‑10min，即可得到RNA样品。

[0105] (9)反转录：使用南京诺唯赞生物有限公司的HiScript II Q RT SuperMix(R222‑01)试剂盒进行反转录，具体反应体系如下：

[0106] 在RNase‑free离心管中配制如下混合液

[0107]

[0108] 反应程序如下：

[0109]

[0110] 反转录得到的cDNA可暂时存放于‑20℃进行保存。

[0111] 五、实时荧光定量PCR检测患者外周血B细胞Jmjd1c基因的表达量差异(ABI stepone plus)

[0112] 采用南京诺唯赞生物有限公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Q311‑02)试剂盒，共20μl反应体系，每个样本设置3个平行反应管，反应体系如下：

[0113]

[0114] 反应程序如下：

[0115]

[0116]

[0117] 其中扩增检测Jmjd1c基因的引物序列如下：

[0118] 5F：5’‑GCATTACATCACGACGCAGGT‑3’(此即上游引物SEQ ID No.1)

[0119] 3R：5’‑GAGTTCATTGCTGGTCTGGGAC‑3’(此即下游引物SEQ ID No.2)

[0120] 管家基因GAPDH基因的引物序列如下：

[0121] 5F：5’‑ATGTTCCAATATGATTCCA‑3’

[0122] 3R：5’‑GATTTCCATTGATGACAAG‑3’。

[0123] 通过溶解曲线分析扩增基因是否为目的基因，ΔΔCT法进行相对定量。

[0124] 六、统计学相关性分析：使用软件GraphPad Prism 6.01进行线性回归分析，分别分析患者外周血B细胞Jmjd1c基因相较于Gapdh基因的相对表达量与外周血浆细胞比例、临床疾病活动指数(CDAI)、简化的疾病活动指数(SDAI)与疾病活动指数28(DAS28)之间的相关性，使用Linear regression分析线性回归曲线，使用Correlation分析相关性。

[0125] 结果：如图3的a图所示，类风湿关节炎患者外周血B细胞中Jmjd1c基因的表达量与其外周血浆细胞的比例呈负相关；如图3的b图所示，类风湿关节炎患者外周血B细胞中Jmjd1c基因的表达量与患者的临床疾病评分、疾病活动指数呈负相关。

[0126] 结论：根据以上结果可知类风湿关节炎患者其B细胞中Jmjd1c基因的表达量与关节炎疾病的进程呈负相关，这暗示我们未来可以将B细胞Jmjd1c基因的表达量作为疾病诊断的标准；根据Jmjd1c基因表达量与疾病活动性的相关性，也暗示未来可以通过检测患者外周血B细胞中Jmjd1c的表达量用于评估患者的疾病活动性及预后。

[0127] 实施例3

[0128] 本实施例的主要内容为：构建B细胞特异性缺失Jmjd1c基因的小鼠。

[0129] 一、B细胞特异性缺失Jmjd1c基因小鼠的构建

[0130] 根据Jmjd1c基因序列由剑桥‑苏大基因组资源中心设计构建Jmjd1cfl/fl小鼠，将fl/loxp序列定位插在小鼠第9、10外显子两端，当与Mb1‑cre配繁在一起之后，得到Jmjd1cfl
Mb1‑cre+小鼠，该小鼠能在B细胞中特异性敲除Jmjd1c基因，所有用于实验的小鼠均为8‑
10周龄。

[0131] 二、从mRNA水平验证B细胞特异缺失Jmjd1c基因小鼠的敲除效率

[0132] (1)实验对象：选取8周龄大、发育正常、性别相同的对照(Jmjd1c+/+Mb1‑cre+)小鼠fl/fl及实验组(Jmjd1c Mb1‑cre+)小鼠。

[0133] (2)磁珠富集小鼠脾脏B细胞(Biolegend公司)：

[0134] 1)安乐死小鼠，使其呈右躺位，剪开腹膜，可看见脾脏组织，将其取下，剥离干净附着的筋膜组织，浸泡于Biolegend公司的1×MojoSort buffer(#480017)，使用100μm的细胞筛进行研磨过滤，得到脾脏单个核细胞悬液。

[0135] 2)1500rpm，4℃离心5min沉淀细胞，弃去上清，加入500μl 1×MojoSort buffer重悬细胞，加入30μl PanB Cell Isolation Kit(#480051)中的Biotin‑Antibody Cocktail轻轻吹打混匀，4℃避光染色15min。

[0136] 3)加入3ml 1×MojoSort buffer稀释多余抗体，1500rpm，4℃离心5min沉淀细胞，弃去上清，加入500μl 1×MojoSort buffer重悬细胞，加入30μl Streptavidin Nanobeads轻轻吹打混匀，4℃避光染色15min。

[0137] 4)加入3ml 1×MojoSort buffer稀释多余抗体，1500rpm，4℃离心5min沉淀细胞，弃去上清，加入3ml 1×MojoSort buffer重悬细胞，将细胞悬液通过100μm的细胞筛过滤至流式管内。

[0138] 5)将流式管插入磁铁Magnet(#480019)内，冰上静置5min，保持流式管插入磁铁内状态将细胞悬液倒出至一个新的收集管中，得到的便是脾脏B细胞悬液。

[0139] 6)验证富集效率：从上述细胞悬液中取出50μl细胞，加入1μl anti‑mouse B220 FITC流式抗体，室温避光染色10min，通过流式细胞仪检测B细胞纯度，一般此时可得到95％以上的B细胞纯度。

[0140] 7)从mRNA水平验证Jmjd1c基因敲除效率：

[0141] ①在上述细胞悬液中加入5ml PBS缓冲液洗涤细胞，1500rpm，4℃离心5min沉淀细胞，弃去上清，加入1ml Trizol裂解液，室温裂解5min，可暂时存放于‑80℃或者直接进行下一步RNA提取过程。

[0142] ②RNA提取及反转录：过程同实施例2的四。

[0143] ③实时荧光定量PCR分析：过程同实施例2的五，其中扩增检测Jmjd1c基因的引物序列如下：

[0144] 5F：5’‑GAAAGCAAGTCGGAGCAGAGG‑3’(此即上游引物SEQ ID No.3)

[0145] 3R：5’‑CTTCCGCCAGTCTTTCAGCA‑3’(此即下游引物SEQ ID No.4)

[0146] Hprt基因的引物序列如下：

[0147] 5F：5’‑CGTGATTAGCGATGAACCA‑3’

[0148] 3R：5’‑TGTAATCCAGCAGGTCAGCAAA‑3’。

[0149] ④结果：如图4的a图所示，通过检测B细胞中Jmjd1c基因的mRNA水平，可发现相较fl/fl于对照组小鼠，实验组Jmjd1c Mb1‑cre+小鼠B细胞的Jmjd1c基因的表达量明显降低，说明该小鼠构建成功，为后续实验提供可靠的小鼠基础。

[0150] 8)从蛋白水平验证Jmjd1c基因敲除效率：

[0151] ①裂解蛋白：在上述细胞悬液中加入5ml PBS缓冲液洗涤细胞，1500rpm，4℃离心5min沉淀细胞，弃去上清，加入200μl RIPA裂解液(碧云天，#P0013C)重悬细胞，转移至
1.5ml EP管内，冰上裂解20min，12000rpm，4℃离心15min，将上清收集于一个新的1.5ml EP管，加入等体积2×loading buffer，95℃加热5min。

[0152] ②蛋白质免疫印迹：将提取的蛋白进行SDS‑PAGE电泳，由于JMJD1C蛋白分子量较大(280KD左右)，建议使用8‑10％的胶电泳，采用300mA恒流200min进行转膜，之后进行封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。

[0153] ③结果：如图4的b图所示，通过检测B细胞中JMJD1C蛋白的表达水平，可发现相较fl/fl于对照组小鼠，实验组Jmjd1c Mb1‑cre+小鼠B细胞的JMJD1C蛋白表达量明显降低，几乎检测不到，说明该小鼠构建成功，为后续实验提供可靠的小鼠基础。

[0154] 实施例4

[0155] 本实施例的主要内容为：验证小鼠B细胞缺失Jmjd1c基因能加速关节炎的发病。

[0156] 胶原诱导的关节炎模型构建(Chondrex)：

[0157] (1)实验对象：用于关节炎模型构建的对照组小鼠均为9‑10周龄成年C57/BL6背景，实验组小鼠采用实施例3的B细胞特异性缺失Jmjd1c基因小鼠，使用Chondrex公司的完全福氏佐剂(浓度5mg/ml，#7023)，以及Chondrex公司的免疫级别的鸡二型胶原(浓度2mg/ml，#20012)。

[0158] (2)第1天：按照每只小鼠注射100μg鸡二型胶原的剂量混匀乳化抗原：50μl CII+50μl CFA/只鼠，在螺旋混匀仪上震荡混匀约3‑4h，注意由于胶原极易降解，全程需要在冰上操作，保证胶原的活性；完全乳化成功的标志：取一滴滴于清水中，液体呈油包水状态漂浮在水面上，完全不散。

[0159] (3)免疫小鼠：用1ml注射器吸取上述乳化抗原，排去气泡，置于冰上备用；麻醉小鼠，待小鼠麻醉完全后，在小鼠尾部皮下、背部分多处皮内注射共100μl抗原混合物，将小鼠安放于温度适宜处，等待苏醒。

[0160] (4)第21天：进行二次免疫，抗原制备同第一次，免疫小鼠的部位：在小鼠尾部皮下、后足脚后跟处共皮下免疫100μl。

[0161] (5)测量指标：

[0162] 1)发病时间记录：自D15天开始，每天观察小鼠脚踝脚掌是否肿胀，发病即为1，不发病为0；

[0163] 2)测量踝关节肿胀情况：D21天免疫前为初始值，每两天测量小鼠后肢两个踝关节的厚度，单位：mm,精确到小数点后三位；

[0164] 3)疾病评分：单只脚进行评分0‑4分，总共0‑16分：

[0165] 评分含义如下：

[0166] 0：正常，无炎症或发红。

[0167] 1：轻度但明确的脚踝或手腕红肿，或仅限于个别手指/脚趾的明显红肿，无论受累手指/脚趾的数量如何。

[0168] 2：脚踝或手腕中度红肿。

[0169] 3：包括手指/脚趾在内的整个爪子严重红肿。

[0170] 4：肢体最大程度发炎，累及多个关节。

[0171] 4)CT 3维重构：于造模第42天安乐死小鼠，取其关节浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定，后期可用于关节CT拍摄，并进行3D立体重建；

[0172] 5)关节切片：于造模第42天安乐死小鼠，取其关节浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定，送于塞维尔生物科技有限公司进行关节脱钙包埋以及石蜡切片HE组织染色。

[0173] 结果：

[0174] (1)如图5的a图所示，相较于对照组小鼠，实验组小鼠在关节炎模型构建中，发病速度明显加快，且发病率明显增加。

[0175] (2)如图5的b图所示，相较于对照组小鼠，实验组小鼠关节炎造模之后，其四肢关节炎发病的情况明显严重。

[0176] (3)如图5的c图所示为造模第42天拍摄(左)未经抗原造模、(中)对照组造模小鼠、(右)实验组造模小鼠照片。

[0177] 结论：根据以上数据可知，当小鼠的B细胞缺失Jmjd1c基因之后，会导致其关节炎发病情况明显增加，与之前分析类风湿性关节炎患者其B细胞中Jmjd1c基因表达量明显低于正常健康人相符。

[0178] 实施例5

[0179] 本实施例的主要内容为：验证小鼠B细胞缺失Jmjd1c基因加速关节炎发病是由于抗体分泌增加。

[0180] 小鼠血清抗原特异性抗体检测(Elisa)：

[0181] (1)血清样品：在实施例4的基础上，在关节炎模型构建的第21、42天对小鼠进行内眦静脉取血，血样于室温静置约2h，12000rpm离心5min，此时血块沉淀于管底，上清即为血清样品；将血清吸入一个洁净的1.5ml EP管，血清可暂时存放于‑20℃或‑80℃进行保存。

[0182] (2)包被抗原：在实验的前一天晚上进行抗原包被Elisa板，使用高透光高粘附性的96孔平底板，用PBS缓冲液稀释二型胶原至终浓度为2.5μg/ml，使用排枪将抗原稀释液平铺至96孔板中，4℃包被过夜。

[0183] (3)封闭：将板子取出，甩去液体，用0.05％Tween20的PBST洗三遍，加入2％BSA的PBS室温封闭2h。

[0184] (4)血清孵育：按照一定比例用1％BSA的PBS稀释血清，将封闭液甩去，加入血清样品，室温孵育约2h。

[0185] (5)洗板10次：用0.05％Tween20的PBST洗10遍。

[0186] (6)二抗孵育：按照1：5000稀释二抗(IgG1、IgG2b、IgG2c HRP)，室温孵育1h。

[0187] (7)洗板10次：用0.05％Tween20的PBST洗10遍。

[0188] (8)显色：TMB显色，并用酶标仪测定OD值。

[0189] 结果：如图6所示，相比于对照组小鼠，B细胞缺失Jmjd1c的小鼠其血清抗二型胶原抗体(IgG1、IgG2b、IgG2c亚型)明显增加，这可能是导致实验组小鼠在关节炎模型造模过程中发病明显加速、病情严重的原因。

[0190] 实施例6

[0191] 本实施例的主要内容为：验证小鼠B细胞缺失Jmjd1c基因会导致浆细胞生成明显增加。

[0192] 一、sgJmjd1c质粒的构建

[0193] (1)sgRNA序列的设计：根据小鼠Jmjd1c蛋白的结构域，将sgRNA的序列设计在其功能域之间，保证序列的特异性，该序列如下：GTGATGCCAGTAAATGCTGG。

[0194] (2)使用addgene官网质粒MSCV‑pU6‑(BbsI)‑CcdB‑(BbsI)‑Pgk‑Puro‑T2A‑BFP(#86457)，用限制性内切酶BbsI进行37℃水浴酶切2h，1％琼脂糖凝胶进行回收。

[0195] (3)sgRNA片段退火：由南京金斯瑞生物科技有限公司合成以下序列：

[0196] 5F：5’‑CACCGTGATGCCAGTAAATGCTGGGT‑3’

[0197] 3R：5’‑TAAAACCCAGCATTTACTGGCATCAC‑3’

[0198] 取5μl 5F引物(100μm)与5μl 3R引物(100μm)于PCR管中混匀进行退火，将产物稀释100倍。

[0199] (4)T4连接：使用T4连接酶(Takara)进行连接，16℃过夜连接，连接体系如下：1μl退火产物稀释物，1μl T4连接酶，1μl 10×T4连接酶buffer，载体50μg左右，H2O终体积10μl。

[0200] (5)转化涂板：将连接产物置于冰上2min，加入感受态细胞(南京擎科生物科技有限公司)中，冰浴30min，42℃放置90s，冰上冷却2min，加入1ml预热的无抗性LB液体，37℃复苏1h后，4000rpm离心2min，弃去上清只留100‑200μl液体，轻轻重悬菌体沉淀，加于含氨苄抗性的LB板子上，玻璃棒涂抹开，37℃培养约12h，此时可见单克隆菌落形成。

[0201] (6)挑菌测序：挑取单克隆菌落于5ml含氨苄抗性的LB液体中，37℃200rpm摇晃培养过夜，将菌液离心提取质粒(OMEGA)，可送于公司进行一代测序(擎科)。

[0202] (7)根据测序结果，筛选正确的连上了sgRNA的质粒。

[0203] 二、B1‑8hi Cas9小鼠：

[0204] Cas9小鼠由南模生物提供，B1‑8hi小鼠由清华大学祁海教授赠与；Cas9小鼠全身性hi表达Cas9蛋白，可识别sgRNA序列进行剪切；B1‑8 小鼠其B细胞的免疫球蛋白重链区进行了hi
改造，使其B细胞的BCR特异性识别NP蛋白；将Cas9小鼠同B1‑8 小鼠进行配繁，可得到B1‑hi
8  Cas9小鼠，该小鼠其B细胞能够特异性识别NP蛋白且B细胞能够表达Cas9蛋白。

[0205] 三、sgRNA转染B1‑8hi Cas9小鼠的B细胞

[0206] (1)platE细胞转染制备病毒：

[0207] 1)D0：准备一盘长势良好、密度大约90％‑100％的platE细胞(T25)，按照1：3的比例进行传代，准备两盘细胞(T25)。

[0208] 2)D1：在细胞传代20‑22h左右、密度达到80％左右的时候进行细胞转染，预热10％DMEM培养基，给细胞换液约5ml，换液后20min左右进行转染试剂准备，按照3：1的比例准备sgRNA(空载对照和目的质粒)和助包装质粒pge，与转染试剂混匀后静置15min，均匀滴加在细胞表面，37℃继续培养。

[0209] 3)D2：给细胞换上6ml左右10％DMEM。

[0210] (2)转染B细胞：

[0211] 1)D2：按照上文所述的磁珠富集方法富集B细胞，anti‑CD180(1：4000比例)刺激，使用24孔板刺激。

[0212] 2)D3：在B细胞刺激24h以内进行病毒侵染，将platE上清收集，1：100加入Hepes，1：1000加入polybrene，1500rpm离心5min弃去沉淀，收集上清。

[0213] 3)将刺激的B细胞1000g离心8min，将上清暂时收集存放于37℃，将病毒上清均匀分布加入B细胞，1000g室温spin侵染2h，弃去上清，将之前收集的刺激上清重新加入B细胞中，轻轻吹悬，将细胞重新放回37℃培养。

[0214] 4)D4：重复D3操作，二次侵染；

[0215] (3)过继转移：

[0216] 1)准备OT2细胞：OT2小鼠其CD4 T细胞特异性识别OVA蛋白，安乐死OT2小鼠，取其外周淋巴结及脾脏，于ACK中裂红，PBS洗涤2次，进行染色计数，每只受体鼠眼静脉注射OT2细胞约0.1million。

[0217] 2)准备B细胞：将上述侵染二次的B细胞收集于15ml离心管内，PBS洗涤细胞两次，加入1ml左右PBS缓冲液重悬细胞，眼静脉注射小鼠。

[0218] (4)免疫小鼠：

[0219] D5：在过继转移的第二天早上准备抗原免疫，每只小鼠腹腔注射NP‑OVA100μg+100μl AL佐剂。

[0220] (5)流式分析：于免疫后第6天安乐死小鼠取脾脏进行流式分析。

[0221] (6)结果：如图7所示为流式结果的圈门示意图，相较于对照组(control)小鼠，实验组小鼠(sgJmjd1c)在B细胞中敲除Jmjd1c之后导致其浆细胞生成明显增加，联系前文结果，说明B细胞缺失Jmjd1c基因会导致浆细胞明显增加，进而导致抗体生成增加，最终导致关节炎疾病的加重。

[0222] 除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。