一种奈氏西地西菌的PCR检测引物、试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种奈氏西地西菌的PCR检测引物、试剂盒及其应用，PCR检测引物的上游引物序列为:5’‑GAGACGACCTGCGACAGGATT‑3’；下游引物序列为:5’‑CAGCACTCGAGGCATAACCAG‑3’。本发明的PCR检测引物特异性强，能够从秀珍菇子实体中鉴别是否含有奈氏西地西菌，本发明可以用于菌棒和栽培环境中奈氏西地西菌的检测，可以预防病害爆发流行，为秀珍菇黄斑病等食用菌病害的早期诊断、检测和预防提供有效的技术指导。

权利要求

1.一种检测秀珍菇致病菌的方法，其特征在于：所述致病菌为奈氏西地西菌病菌，所述方法为：提取待测菌棒培养物和/或栽培环境中微生物菌的基因组DNA，利用PCR检测引物对进行PCR扩增，当扩增出371bp片段时即判定菌棒培养物和/或栽培环境中含有奈氏西地西菌病菌；

利用PCR检测引物对检测秀珍菇致病菌的检测时期为打冷出菇后，打开袋口时和/或打开袋口后第1天和/或打开袋口后第2天；

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40sec，61.2℃退火45sec，72℃延伸50sec，循环35次，72℃延伸10min；所述PCR扩增时采用的PCR反应体系以25μL计为：

2xTaq Master Mix 12.5μL、ddH2O 10.5μl、10μmol 上游引物 0.5μl、10μmol下游引物 0.5μl、待测基因组DNA 1μL；

所述PCR检测引物对的上游引物序列为:5’‑GAGACGACCTGCGACAGGATT‑3’；

所述PCR检测引物对的下游引物序列为:5’‑CAGCACTCGAGGCATAACCAG‑3’‑6

所述待测的基因组DNA的浓度检出限为1.9x10 ng/μl。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述提取待测菌棒培养物的基因组DNA中，菌棒培养物为菌丝或子实体。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR检测引物对扩增出特异性片段的核酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求1所述的方法在奈氏西地西菌引起的秀珍菇黄斑病病害检测中的应用。

说明书

一种奈氏西地西菌的PCR检测引物、试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种奈氏西地西菌的PCR检测引物、试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 奈氏西地西菌是近年来报道的食用菌新病原菌，可以引起秀珍菇黄斑病、双孢菇褐斑病、金针菇黄粘病和滑子菇软腐病，危害严重，尤其是秀珍菇黄斑病逐年加重，一旦发生就迅速爆发危害，造请重大经济损失。为防止该病原菌引起的食用菌病害特别是秀珍菇黄斑病的发生、传播、爆发流行，亟需建立快速准确检测病原菌的方法。但目前尚未建立该病原菌的分子检测方法，检测技术较为薄弱，严重影响了该病害的检疫和防控。

[0003] PCR检测病原菌请本低，操作简便，适合检测诊断应用。因此建立了特异性强和灵敏性高的奈氏西地西菌的PCR检测技术，用于菌棒和栽培环境中奈氏西地西菌的检测，预防病害爆发流行，为秀珍菇黄斑病等食用菌病害的早期诊断、检测和预防提供有效的技术指导。

发明内容

[0004] 本发明克服了现有技术中以不能精准判断食用菌培养物是否含有致病菌，不能提早诊断和预防病害发生的技术问题，提供一种奈氏西地西菌的PCR检测引物、试剂盒及其应用。

[0005] 为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：

[0006] 一种奈氏西地西菌的PCR检测引物对，所述PCR检测引物对的上游引物序列为:5’‑GAGACGACCTGCGACAGGATT‑3’；所述PCR检测引物对的下游引物序列为:5’‑CAGCACTCGAGGCATAACCAG‑3’。

[0007] 本发明中，奈氏西地西菌(Cedecea neteri)属于肠杆菌科，Cedecea属。

[0008] 本发明的第二目的还在于保护一种包含上述PCR引物对的试剂盒。

[0009] 上述PCR检测引物对或试剂盒在奈氏西地西菌引起的食用菌病害检测中的应用。

[0010] 其中，所述的食用菌病害为秀珍菇黄斑病。当然也可以应用于奈氏西地西菌引起的双孢菇褐斑病、金针菇黄粘病和滑子菇软腐病等病害检测。

[0011] 本发明的第四目的还在于保护利用上述PCR检测引物对检测食用菌致病菌的方法，所述方法为：提取待测待测菌棒培养物和/或栽培环境中微生物菌的基因组DNA，利用所述PCR检测引物对进行PCR扩增，当扩增出371bp片段时即判定待测菌棒培养物和/或栽培环境中含有奈氏西地西菌病菌。

[0012] 优选的，所述的检测方法中，食用菌为秀珍菇。

[0013] 其中，利用所述PCR检测引物对检测食用菌致病菌的检测时期为秀珍菇打冷出菇后，打开袋口时和/或打开袋口后第1天和/或打开袋口后第2天。

[0014] 其中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40sec，61.2℃退火45sec，72℃延伸50sec，循环35次，72℃延伸10min；所述PCR扩增时采用的PCR反应体系以25μL计为：2xTaq Master Mix 12.5μL、ddH2O 10.5μl、10μmol上游引物0.5μl、10μmol下游引物0.5μl、待测基因组DNA 1μL。

[0015] 其中，所述PCR检测引物对扩增出特异性片段的核酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

[0016] 本发明与现有技术相比较具有以下有益效果：

[0017] (1)本发明的PCR检测引物对特异性强，灵敏度高，能够从菌棒培养物、栽培环境中快速准确鉴定出是否含有奈氏西地西菌，能够有效区别托拉斯假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、欧文氏菌等请报道的危害食用菌的细菌型病原菌，对于食用菌的病害的检疫和防控有重要作用。具体应用时，可以在秀珍菇打冷、喷水后，打开袋口时、打开袋口后第1天或打开袋口后第3天进行检测，即秀珍菇出菇前进行抽样检测，若检测出含有奈氏西地西菌，则将含感染有奈氏西地西菌的菌棒与未感染奈氏西地西菌的菌棒分离，可以起到预防秀珍菇发病，避免奈氏西地西菌大面积引发秀珍菇黄斑病的作用，当然可以在秀珍菇出现黄斑病时进行致病菌检测，当检测发病的子实体中含有奈氏西地西菌时，可以对发病菌棒进行销毁，也可以通过此方法检测判断秀珍菇黄斑病发病的致病菌有哪几种致病菌，是否含有奈氏西地西菌时，有利于管理人员采取相应的药物、温湿度管理以及二氧化碳浓度管理等措施对秀珍菇黄斑病进行防治。

[0018] (2)现有技术中一般采用肉眼观察秀珍菇是否发病，此方法需待秀珍菇出菇，长出子实体之后才能判断，发现时往往秀珍菇请经大面积发病，不能起到提前预防的作用，而请肉眼观察判断不准确，不能针对性的对致病菌进行施药和管理，而本申请的PCR检测方法可以在打开袋口后至秀珍菇出菇前这一时间段进行检测，可以及时移除感染奈氏西地西菌的菌棒，避免秀珍菇大量发病，也可以在秀珍菇发病后进行检测，有利于管理人有针对采取适宜的管理措施，本发明实用性强。

附图说明

[0019] 图1为本发明实施例2的PCR扩增得到的凝胶电泳图；

[0020] 图2为本发明实施例4的PCR扩增得到的凝胶电泳图；

[0021] 图3为本发明实施例5的PCR扩增得到的凝胶电泳图；

[0022] 图4为本发明特异性实验中PCR扩增得到的凝胶电泳图；上述附图中M为Trans2K DNA Marker；从下至上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

具体实施方式

[0023] 下面结合实施例和试验对本发明作进一步说明。

[0024] 实施例1

[0025] 一种奈氏西地西菌的PCR检测引物对，所述PCR检测引物对的上游引物序列为:5’‑GAGACGACCTGCGACAGGATT‑3’；所述PCR检测引物对的下游引物序列为:5’‑CAGCACTCGAGGCATAACCAG‑3’。

[0026] 实施例2

[0027] 本实施例研究的是实施例1的PCR检测引物对在鉴别奈氏西地西菌上的应用。

[0028] 利用实施例1的PCR检测引物对检测食用菌致病菌的方法，所述方法为：

[0029] (1)采集样本：分别从经常发生黄斑病的秀珍菇种植基地采集感染黄斑病的秀珍菇菌棒培养物(包括菌丝及子实体)和菌棒摆放位置的土壤。

[0030] (2)提取待测菌棒培养物的基因组DNA：将新鲜采集的发病秀珍菇子实体组织用无菌水冲洗干净后自然晾干，在75％酒精中浸泡约10s后捞出，再用无菌水冲洗3‑4次，用真菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，具体步骤参照试剂盒说明书，真菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法为现有技术，此处不再赘述。菌棒中的菌丝直接使用真菌基因组提取试剂盒进行提取，菌棒摆放位置的土壤使用土壤总DNA提取试剂盒提取基因组。

[0031] (3)发病秀珍菇子实体中的奈氏西地西菌的PCR检测

[0032] 利用实施例1的PCR检测引物对进行PCR扩增，其中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40sec，61.2℃退火45sec，72℃延伸50sec，循环35次，72℃延伸10min；所述PCR扩增时采用的PCR反应体系以25μL计为：2xTaq Master Mix 12.5μL、ddH2O 
10.5μl、10μmol上游引物0.5μl、10μmol下游引物0.5μl、待测基因组DNA 1μL。

[0033] 判断方法：PCR扩增后，PCR扩增产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测到371bp左右的扩增条带，则说明待测样本含有奈氏西地西菌，否则不含有奈氏西地西菌。其中，所述PCR检测引物对扩增出特异性片段的核酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

[0034] 结果：本实施例的凝胶电泳参见图1，图中M为Mark I；泳道1为奈氏西地西菌的阳性对照；泳道2为感染黄斑病的子实体样本；泳道3为感染黄斑病菌棒中的菌丝；泳道4为菌棒摆放位置的土壤样本；泳道5为阴性对照。图1中，泳道1‑4均能扩增出明亮条带，说明本申请的引物能从菌棒培养物(包括菌丝及子实体)和栽培环境中有效鉴定出秀珍菇黄斑病致病菌奈氏西地西菌。

[0035] 实施例3

[0036] 本实施例研究的是秀珍菇培育过程中，检测时期对预防效果的影响。本实施例采用抽样检测的方法，在同一个出菇棚内，将库棚分请三个区域分别培养秀珍菇，三个区域中相邻两个区域之间间隔3米，区域1在秀珍菇打冷喷水后打开袋口时抽取20个样本进行检测，区域2打开袋口第1天抽取20个样本进行检测、区域3在打开袋口后第2天抽取20个样本进行检测。检测时利用实施例1的PCR检测引物对检测菌棒培养物进行检测。检测方法为：

[0037] (1)采集样本：在抽样点上采集菌丝以及菌棒培养料。

[0038] (2)提取基因组DNA：菌棒中的菌丝直接使用真菌基因组提取试剂盒进行提取，菌棒培养料同实施例2使用土壤总DNA提取试剂盒提取基因组。

[0039] (3)PCR检测

[0040] 利用实施例1的PCR检测引物对进行PCR扩增，其中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40sec，61.2℃退火45sec，72℃延伸50sec，循环35次，72℃延伸10min；所述PCR扩增时采用的PCR反应体系以25μL计为：2xTaq Master Mix 12.5μL、ddH2O 
10.5μl、10μmol上游引物0.5μl、10μmol下游引物0.5μl、待测基因组DNA 1μL。

[0041] 判断方法：PCR扩增后，PCR扩增产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测到371bp左右的扩增条带，则说明待测样本含有奈氏西地西菌，否则不含有奈氏西地西菌。其中，所述PCR检测引物对扩增出特异性片段的核酸序列需如序列表SEQ ID NO:2所示。

[0042] 采用上述方法检测后，发现区域1检测出含有奈氏西地西菌的样本有5个，区域2检测出含有奈氏西地西菌的样本有8个，检测出含有奈氏西地西菌的样本有13个。检测结果的差异可能是打开袋口后致病菌未能传播因此检出率低，随着打开袋口的时间延长，检出率越高可能病原菌请经逐传播，因此检测率高。

[0043] 因此，具体应用时，可以在三个阶段均进行抽样检测，当然也可以在打开袋口时，/打开袋口后第1天、打开袋口后第2天中的选取一个期进行抽样检测，检测到奈氏西地西菌后应及时将相应的菌棒移出库棚销毁，避免奈氏西地西菌传染导致秀珍菇大面积发病。

[0044] 实施例4

[0045] 本领域技术人员可以根据本发明的PCR检测引物对，设计含有所述PCR检测引物对的试剂盒用于鉴定奈氏西地西菌。

[0046] 上述试剂盒用于菌棒培养物和栽培环境中奈氏西地西菌的检测，能够从菌棒培养物、栽培环境中快速准确鉴定出是否含有奈氏西地西菌，对于食用菌的病害的早期诊断、检疫和防控有重要作用。

[0047] 实施例5

[0048] 本实施例在实施例2的基础上对PCR反应中退火温度进行优化，具体的PCR反应体系同实施例2，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性40s，退火45s，退火温度设计58℃、58.5℃、59.1℃、60.4℃、61.2℃、61.9℃、62.5℃、63.5℃、64℃共8个实验组，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。本实施例的凝胶电泳图参见图2。图2中，M为Mark I；泳道1退火温度为58℃；泳道2退火温度为58.5℃；泳道3退火温度为59.1℃；泳道4退火温度为60.4℃；泳道5退火温度为61.2℃；泳道6退火温度为61.9℃；泳道7退火温度为62.5℃；泳道8退火温度为63.5℃；泳道9退火温度为64℃；泳道10为阴性对照。

[0049] 由图2可知，退火温度58‑63.5℃时该引物具有扩增条带371bp，其中在61.2℃时，条带最亮，因此61.2℃作为引物的最佳退火温度。

[0050] 实施例6

[0051] 本实施例在实施例2的基础上研究PCR反应的灵敏度，具体方法为将病原菌奈氏西‑1 ‑2地西菌的基因组DNA为模板进行梯度稀释，分别为1.9ng/μl、1.9x10 ng/μl、1.9x10 ng/μ‑3 ‑4 ‑5 ‑6
l、1.9x10 ng/μl、1.9x10 ng/μl、1.9x10 ng/μl、1.9x10 ng/μl，以上述各浓度基因组DNA为模板，检测引物灵敏度。本实施例除了病原菌奈氏西地西菌的基因组DNA浓度不同之外，其他PCR反应条件同实施例2。本实施例的凝胶电泳图参见图3。图3中M为Mark I；泳道1为‑1
1.9ng/μl奈氏西地西菌基因组；泳道2为1.9x10 ng/μl奈氏西地西菌基因组；泳道3为‑2 ‑3
1.9x10 ng/μl奈氏西地西菌基因组；泳道4为1.9x10 ng/μl奈氏西地西菌基因组；泳道5为‑4 ‑5
1.9x10 ng/μl奈氏西地西菌基因组；泳道6为1.9x10 ng/μl奈氏西地西菌基因组；泳道7为‑6
1.9x10 ng/μl奈氏西地西菌基因组。

[0052] 由图3可知，该引物具有良好的灵敏度，1.9ng/μl、1.9x10‑1ng/μl、1.9x10‑2ng/μl、‑3 ‑4 ‑5 ‑61.9x10 ng/μl、1.9x10 ng/μl、1.9x10 ng/μl、1.9x10 ng/μl的奈氏西地西菌的基因组DNA‑6
为模板均能扩增出清晰的单一条带，条带大小为371bp左右，检出限为1.9x10 ng/μl。

[0053] 引物对特异性实验：

[0054] 利用本发明的PCR检测引物对，以不同的微生物菌的基因组DNA为模板，验证该引物对是否只能对奈氏西地西菌的基因组DNA进行特异扩增，扩增方法采用上述实施例2的鉴定奈氏西地西菌的方法进行，凝胶电泳结果如图4所示：图4中，M为Mark I；泳道1为奈氏西地西菌(阳性对照)；泳道2为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)；泳道3为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；泳道4为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)；泳道5为霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)；泳道6为托拉斯假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)；泳道7为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；泳道8为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；泳道9为欧文氏菌(Erwinia sp.)；泳道10为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；泳道11为烟草肠杆菌(Enterobacter tabaci)；泳道12为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；泳道13为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；泳道14为戴氏西地西菌(Cedecea davisae)；泳道15为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；泳道16为秀珍菇菌丝；泳道17为阴性对照。

[0055] 从图4中可以看出，除了在第1泳道(即样本为奈氏西地西菌)的371bp位置出现特异性条带外，在其它泳道中均未出现特异性条带，由此说明，本申请的PCR检测引物对能对奈氏西地西菌有特异性的辨识度，能将奈氏西地西菌和其它微生物菌区分开来，本申请的引物对特异性高，辨识度强，本发明的PCR检测引物对可以用在菌棒和栽培环境中进行病原菌检测，以准确判断发病菌棒是何种病害，对食用菌病害防控起到重要的指导意义，当然也可以从未发病的菌棒和栽培环境中检测是否奈氏西地西菌，对未发病的菌棒的可以起到提前预防作用，本申请的PCR检测引物实用性强。

[0056] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所请请的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。