OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用

摘要

本发明公开了OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，属于分子生物学及基因工程技术领域。本发明通过设计水稻OsFWL7基因编码区基因敲除靶标位点，利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除突变体，敲除水稻中的OsFWL7基因。通过后代分离和检测，获得了无转基因插入的纯合突变体。不同突变体单株产量与野生型相比无显著差异，但糙米中金属微量元素锰和铜的含量与对照相比显著增加，具有更好的营养品质。因此，本发明提供的敲除水稻OsFWL7基因以强化籽粒金属微量元素的方法，具有重要的应用价值，能产生良好的经济效益。

权利要求

1.OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，其特征在于：敲除水稻中OsFWL7基因以增加水稻籽粒金属微量元素含量，所述OsFWL7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述金属微量元素为Mn和Cu。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲除水稻中OsFWL7基因的具体方法为：利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻中的OsFWL7基因。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体步骤为：

1)在水稻OsFWL7基因的编码区选取靶标序列；

2)根据靶标序列合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL7基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；

3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规水稻品种，获得转基因水稻植株；

4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定，从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定，获得纯合或双等位突变体；

5)对纯合突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测，即可获得无转基因插入、籽粒Mn和Cu含量显著增加的水稻。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中，所述靶标序列有两个，其序列如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中，所述具有所述靶标序列的sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤5)中，用于HPT、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：

HPTF：5’‑GGGTGTCACGTTGCAAGACC‑3’，HPTR：5’‑ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC‑3’，sgRNAF：5’‑TCCCAGTCACGACGTTGTAA‑3’，sgRNAR：5’‑GGCCATTTGTCTGCAGAAT‑3’，Cas9F：5’‑CACCATCTACCACCTGAGAA‑3’，Cas9R：5’‑CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG‑3’。

说明书

OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，涉及OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用。

背景技术

[0002] 金属元素锰(Mn)和铜(Cu)是人体所必须的微量元素，对于人体发育和生命健康至关重要。Mn是细胞水解酶、激酶、脱羧酶、转移酶等多种酶的激活因子，广泛参与骨骼形成、
能量生成、蛋白质和脂肪代谢等过程。Mn缺乏影响人类生殖和智力发育，引起神经衰弱等症
状。Cu除了可以促进铁的吸收利用，还有助于血压控制和预防氧化损伤，并参与生殖和激素
合成等。Cu缺乏引起免疫缺陷、贫血和骨质疏松等疾病。当前，世界上有超过20亿人口Mn、Cu
等微量元素摄入不足。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球近一半的人口以稻米为
主食。因此，培育高积累金属微量元素的水稻品种是保障金属微量元素摄入的有效手段。然
而，传统育种方法周期长、效率低、速度慢。利用生物技术手段改良水稻品种是加快培育微
量元素强化水稻品种的可行策略。

[0003] FW2.2‑like(FWL)蛋白是一类新发现的金属转运体，参与多种金属离子的运输。拟南芥FWL基因AtPCR2编码Zn输出转运体，参与Zn长距离运输。在水稻中过表达普通小麦FWL
基因TaCNR2和TaCNR5以及二倍体小麦FWL基因TuCNR10显著提高糙米中Zn和Mn含量。水稻
OsFWL5基因敲减植株糙米中Zn和Mg含量显著增加，但Mn含量下降。此外，OsFWL4敲减植株糙
米中Mn含量下降。

[0004] CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR‑associated protein 9)系统是一种由导向RNA介导的基因组定向编辑系
统，广泛应用于各种生物的基因组编辑中。利用该系统在很多植物中都实现了在一代内获
得稳定的纯合突变体。由于T‑DNA插入位点和突变位点位于不同位置，在基因编辑后代中可
以将T‑DNA分离除去，获得无转基因插入的突变体，从而规避转基因可能带来的安全风险。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，即敲除水稻中OsFWL7基因以增加水稻籽粒金
属微量元素含量的方法。

[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

[0007] OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用：敲除水稻中OsFWL7基因以增加籽粒金属微量元素含量，所述OsFWL7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述金
属微量元素为Mn和Cu。

[0008] 优选地，所述敲除水稻中OsFWL7基因的具体方法为：利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻中OsFWL7基因。

[0009] 优选地，所述的应用具体步骤为：

[0010] 1)在水稻OsFWL7基因的编码区选取靶标序列；

[0011] 2)根据靶标序列信息，合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL7基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的
sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；

[0012] 3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规水稻品种，获得转基因水稻植株；

[0013] 4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定，从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定，获得纯合或双等位突变体；

[0014] 5)对上述T0代纯合或双等位突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测，即可获得无转基因插入、籽粒Mn和Cu含量显著增加
的水稻。

[0015] 优选地，步骤1)中，所述靶标序列有两个，如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。

[0016] 优选地，步骤2)中，所述sgRNA表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如Seq ID No.5所示。

[0017] 优选地，步骤5)中，用于HPT(Hygromycin phosphotransferase)、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：

[0018] HPTF：5’‑GGGTGTCACGTTGCAAGACC‑3’，

[0019] HPTR：5‑ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC‑3’，

[0020] sgRNAF：5’‑TCCCAGTCACGACGTTGTAA‑3’，

[0021] sgRNAR：5’‑GGCCATTTGTCTGCAGAAT‑3’，

[0022] Cas9F：5’‑CACCATCTACCACCTGAGAA‑3’，

[0023] Cas9R：5’‑CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG‑3’。

[0024] 有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

[0025] 本发明提供的OsFWL7基因在增加水稻籽粒金属微量元素含量中的应用，是一种利用CRISPR/Cas9技术靶向突变OsFWL7基因获得无转基因插入突变体的方法，通过在T1代利
用三对引物进行检测，可确保获得无转基因插入的突变体，与自然发生的突变体等同，从而
规避转基因可能带来的安全风险。所获得的水稻材料籽粒Mn和Cu含量显著增加，具有更好
的营养品质，能产生更高的商业价值。利用该方法可快速定向改良现有水稻品种，从而大大
缩短育种周期，节约时间和成本。由于是对靶基因进行的定向突变，不改变受编辑材料的遗
传背景，因而不改变受体品种原有的有利性状。

附图说明

[0026] 图1为实施例1中不同突变体的测序鉴定结果；

[0027] 图2为实施例1中T1代无转基因插入突变体的检测结果；其中1‑10分别表示随机选择的T1代植株，VC表示载体对照，WT表示野生型，M表示DNA分子量标记；

[0028] 图3为实施例1中突变体和野生型(WT)的单株产量，数值为10个单株的平均值；

[0029] 图4为实施例1中突变体和野生型(WT)植株籽粒的金属微量元素含量，数值为三个* ***
生物学重复的平均值，P＜0.05， P＜0.001；

[0030] 图5为实施例1中突变体和野生型(WT)植株籽粒的Cd元素含量，数值为三个生物学重复的平均值；

[0031] 图6为实施例2中OsFWL7蛋白的亚细胞定位，比例尺＝10μm。

具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，所用实验方法均为常规方法。

[0033] 实施例1：基于CRISPR/Cas9技术敲除基因OsFWL7增加水稻籽粒金属微量元素含量的方法

[0034] 基因OsFWL7的序列如SEQ ID No.1所示。序列分析显示，该基因共包括2个外显子，分别为SEQ ID No.1序列的第1‑67位(第1外显子)和第302‑660位(第2外显子)。

[0035] (1)用于OsFWL7基因敲除重组表达载体的构建

[0036] 在OsFWL7基因编码区设计两个CRISPR/Cas9基因敲除靶标位点Osfwl7a和Osfwl7b，分别靶向第2外显子的反义链和正义链。其中Osfwl7a靶标序列如SEQ ID No.6所
示，Osfwl7b靶标序列如SEQ D No.7所示。分别合成基于CRISPR/Cas9系统的靶序列引物，序
列如下：

[0037] Osfwl7a‑P1：5’‑TGTGCCCGTGCATCACGTTCGGGC‑3’，

[0038] Osfwl7a‑P2：5’‑AAACGCCCGAACGTGATGCACGGG‑3’，

[0039] Osfwl7b‑P1：5’‑TGTGCATCTTGCCCCGGTAGACGC‑3’，

[0040] Osfwl7b‑P2：5’‑AAACGCGTCTACCGGGGCAAGATG‑3’，

[0041] 其中下划线部分为用于载体连接的粘性末端，未被下划线标注部分为靶点序列或其互补序列。

[0042] 将玉米ZmUBI启动子与hSpCas9基因(Cong L，Ran FA，Cox D，Lin S，Barretto R，Habib N，Hsu PD，Wu X，Jiang W，Marraffini LA，Zhang F.Multiplexgenome engineering 
using CRISPR/Cas systems.Science，2013，339(6121)：819‑823)相连，插入pCAMBIA1300
双元载体，得到中间载体。利用点突变试剂盒(TransGen Biotech)去除pCAMBIA1300载体原
有的BsaI酶切位点。然后，将含有OsU6启动子、两侧带有BsaI酶切位点的ccdB负选择标记基
因以及sgRNA骨架的片段插入所述中间载体，构建CRISPR/Cas9双元载体。将该双元载体保
存在大肠杆菌菌株DB3.1中。

[0043] 分别对Osfwl7a‑P1和Osfwl7a‑P2以及Osfwl7b‑P1和Osfwl7b‑P2进行退火程序，形成具有粘性末端的双链DNA，作为构建CRISPR/Cas9基因敲除载体的插入片段。用BsaI限制
性内切酶(NEB)在37℃酶切上述CRISPR/Cas9双元载体，得到载体骨架片段。用T4连接酶
(NEB)连接插入片段和载体骨架，得到靶向靶标位点的重组表达载体。将重组表达载体转入
大肠杆菌中进行扩增，提取载体质粒经测序(上海生工生物工程股份有限公司)验证正确
后，转入根癌农杆菌菌株EHA105中，用于农杆菌介导的水稻遗传转化。

[0044] (2)OsFWL7基因敲除水稻的获得及鉴定

[0045] 参照Nishimura等(Nishimura A，Aichi I，Matsuoka M.A protocol for Agrobacterium‑mediated transformation in rice.Nature Protocols，2006，1(6)：
2796‑2802)的方法，将上述重组表达载体转化常规粳稻品种中花11，两个重组载体分别获
得了14和15株T0代转基因水稻植株。

[0046] 提取T0代转基因水稻植株DNA，利用KOD DNA聚合酶(TOYOBO)和基因组引物对含靶标位点的DNA片段进行扩增，扩增产物在上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。所
述引物序列为：

[0047] OsFWL7F：5’‑TCTTGGACTGCTTCGACGAC‑3’

[0048] OsFWL7R：5’‑TGTTGCACCAGAAGTGGACG‑3’

[0049] 该引物可以同时覆盖两个靶标位点。测序结果表明，Osfwl7a靶点有13株转基因植株带有目标突变，其中纯合突变体2株、双等位突变体10株、杂合突变体1株；Osfwl7b靶点有
12株转基因植株带有目标突变，其中纯合突变体5株、双等位突变体6株、杂合突变体1株。

[0050] (3)无转基因纯合突变体的获得及表型分析

[0051] 每个靶标位点选择1株纯合T0代突变体用于后续分析，分别命名为osfwl7a和osfwl7b。突变体基因型见图1。

[0052] 利用HPT、sgRNA和Cas9引物对上述突变体的T1代植株基因组DNA进行扩增，在两个突变体系随机选择的10个单株中均鉴定出了无转基因插入的突变体(图2)，说明利用本方
法获得的转基因植株T‑DNA插入位点数很少，很容易在T1代获得无转基因插入的突变体。

[0053] 将无转基因插入的纯合突变体种植于正常的大田条件下。突变体植株的单株产量与野生型无显著差异(图3)。参照Zhang等(Zhang H，Yu C，Hou D，LiuH，Tao R，Cai H，Gu J，
Liu L，Zhang Z，Wang Z，et al.Changes in mineral elements and starch quality of 
grains during the improvement of japonica rice cultivars.Journal ofthe 
Science of Food and Agriculture，2018，98(1)：122‑133)的方法对糙米中金属微量元素
的含量进行测定。突变体糙米中的Fe和Zn含量与野生型无显著差异(图4)，但Mn和Cu含量显
著高于野生型(图4)。其中，Mn含量分别增加了12.4％和9.5％，Cu含量分别增加了34.9％和
25.4％。此外，突变体糙米中有害重金属镉(Cd)含量与野生型无显著差异(图5)。因而突变
体籽粒具有更好的营养品质，能够用来增强饮食中的金属微量元素。本发明所获得的籽粒
Mn和Cu增加的水稻材料不带有转基因成分，规避了转基因可能带来的安全风险，且只改变
了一个基因，不会对水稻品种的其他农艺性状造成影响。

[0054] 实施例2：OsFWL7蛋白亚细胞定位分析

[0055] 为进一步研究该基因调控水稻籽粒金属离子含量的功能，我们对OsFWL7蛋白在细胞内的分布进行了分析。利用一对PCR引物扩增不含终止密码子的OsFWL7编码区序列，连接
入pAN580‑GFP载体，构建OsFWL7‑GFP融合蛋白表达载体。将Zhu等(Zhu J，Ren Y，Zhang Y，
Yang J，Duan E，Wang Y，Liu F，Wu M，Pan T，Hu T，et al.Subunit E isoform 1 of 
vacuolar H+‑ATPase OsVHA enables post‑Golgi trafficking of rice seed storage 
proteins.Plant Physiology，2021，doi：10.1093/plphys/kiab099)构建的OsSCAMP1‑
mCherry融合蛋白载体共同表达作为质膜蛋白的标记。将上述两个载体共同转化水稻原生
质体，在LSM700激光共聚焦显微镜下观察拍照(Carl Zeiss)。所述PCR引物序列如下：

[0056] OsFWL7SL‑F：

[0057] 5’‑CGGAGCTAGCTCTAGAATGGCCAAGCCAAGCGCCGC‑3’，

[0058] OsFWL7SL‑R：

[0059] 5’‑TGCTCACCATGGATCCACGGCCCATGTGCTGCACGG‑3’，

[0060] 结果表明，OsFWL7分布在细胞膜上(图6)，可能直接参与金属离子的运输。