三肽-1铜的检测方法

摘要

本发明公开了一种三肽‑1铜的检测方法，属于多肽分离检测技术领域，具体涉及一种三肽‑1铜的检测方法，包括：将三肽‑1铜溶液经交联葡聚糖凝胶的层析柱洗脱分离后进行检测；三肽‑1铜溶液由待检测的三肽‑1铜样品溶于去离子水中制得，交联葡聚糖凝胶由环氧氯丙烷作为交联剂使燕麦β‑葡聚糖衍生物形成交联结构得到，燕麦β‑葡聚糖衍生物至少含有改性燕麦β‑葡聚糖，改性燕麦β‑葡聚糖由6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺与氧化处理后的燕麦β‑葡聚糖制备得到。本发明方法得到的三肽‑1铜的分离检测效果好，可用于三肽‑1铜的分离检测。

权利要求

1.一种三肽‑1铜的检测方法，包括：将三肽‑1铜溶液经交联葡聚糖凝胶的层析柱洗脱分离后进行检测；所述三肽‑1铜溶液由待检测的三肽‑1铜样品溶于去离子水中制得，所述交联葡聚糖凝胶由环氧氯丙烷作为交联剂使燕麦β‑葡聚糖衍生物形成交联结构得到，所述燕麦β‑葡聚糖衍生物至少含有改性燕麦β‑葡聚糖，所述改性燕麦β‑葡聚糖由6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺与氧化处理后的燕麦β‑葡聚糖制备得到。

2.根据权利要求1所述的一种三肽‑1铜的检测方法，其特征是：所述燕麦β‑葡聚糖衍生物中含有氧化燕麦β‑葡聚糖。

3.根据权利要求1所述的一种三肽‑1铜的检测方法，其特征是：所述燕麦β‑葡聚糖衍生物中含有经过水解或未水解的燕麦β‑葡聚糖。

4.根据权利要求1所述的一种三肽‑1铜的检测方法，其特征是：所述燕麦β‑葡聚糖衍生物中含有葡聚糖接枝物。

5.根据权利要求1所述的一种三肽‑1铜的检测方法，其特征是：所述燕麦β‑葡聚糖从燕麦麸皮提取出来。

6.一种交联葡聚糖凝胶在检测三肽‑1铜方法中的用途，所述交联葡聚糖凝胶由环氧氯丙烷作为交联剂使燕麦β‑葡聚糖衍生物形成交联结构得到，所述燕麦β‑葡聚糖衍生物至少含有改性燕麦β‑葡聚糖；所述改性燕麦β‑葡聚糖的特征在于燕麦β‑葡聚糖上由氧化形成的羰基与6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺形成Schiff碱结构。

说明书

三肽‑1铜的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于多肽分离检测技术领域，具体涉及一种三肽‑1铜的检测方法。

背景技术

[0002] 三肽‑1铜可以作为组织重塑的激活剂和抗氧化剂，也是一个信号肽，促进伤疤外部大量胶原蛋白集聚物的降解，皮肤正常胶原蛋白的合成、弹力蛋白、蛋白聚糖和葡萄胺聚
糖的生成、不同细胞类型的生长速度和迁移、抗炎、抗氧化反应。三肽‑1铜可以在不伤肌肤、
不刺激肌肤的情况下，增加细胞的活力，逐渐修复体内流失的胶原蛋白，可拿伤口迅速愈
合，进而达到除皱抗老化的目的。

[0003] 在对三肽‑1铜进行制备和使用过程中，准确测量三肽‑1铜的含量是很有必要的，在含量检测过程中，三肽‑1铜的分离效果及纯度对其具有重大意义，因此，本申请旨在提供
一种包含三肽‑1铜分离处理的新的检测方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种使用了耐压性好、硬度佳的交联葡聚糖凝胶的三肽‑1铜的检测方法。

[0005] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

[0006] 一种三肽‑1铜的检测方法，包括：将三肽‑1铜溶液经交联葡聚糖凝胶的层析柱洗脱分离后进行检测；三肽‑1铜溶液由待检测的三肽‑1铜样品溶于去离子水中制得，交联葡
聚糖凝胶由环氧氯丙烷作为交联剂使燕麦β‑葡聚糖衍生物形成交联结构得到，燕麦β‑葡聚
糖衍生物至少含有改性燕麦β‑葡聚糖，改性燕麦β‑葡聚糖由6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺与氧化处
理后的燕麦β‑葡聚糖制备得到。交联葡聚糖中有很多孔隙，小分子可以进入孔隙之中；大分
子不能进入孔内，只能随流动相在凝胶颗粒间隙中流动，最先被淋洗出来，因此能作为分子
筛使用，分离大小不同的分子。本发明通过将6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺引入改性燕麦β‑葡聚糖
中，然后再通过环氧氯丙烷作为交联剂进行交联后得到交联葡聚糖凝胶，提高交联葡聚糖
凝胶的耐压性能，并具有较好的硬度，并且交联葡聚糖凝胶的回复性和粘聚性均有所提高。

[0007] 优选地，燕麦β‑葡聚糖衍生物中含有氧化燕麦β‑葡聚糖。

[0008] 优选地，燕麦β‑葡聚糖衍生物中含有经过水解或未水解的燕麦β‑葡聚糖。

[0009] 优选地，燕麦β‑葡聚糖衍生物中含有葡聚糖接枝物。

[0010] 优选地，燕麦β‑葡聚糖从燕麦麸皮提取出来。

[0011] 优选地，交联葡聚糖凝胶的制备中，将改性燕麦β‑葡聚糖加入碱性溶液中，加入PVAc溶液和ECH溶液，升温在40‑80℃的温度下搅拌反应2‑8h，反应完成后，甲苯洗涤，乙醇
洗涤，蒸馏水洗涤，抽滤，干燥，得到交联葡聚糖凝胶。

[0012] 更优选地，交联葡聚糖凝胶的制备中，碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中氢氧化钠的质量分数为0.4‑1.2wt%。

[0013] 更优选地，交联葡聚糖凝胶的制备中，氧化燕麦β‑葡聚糖的使用量为碱性溶液的1.5‑5wt%。

[0014] 更优选地，交联葡聚糖凝胶的制备中，PVAc溶液为PVAc的二氯乙烷溶液，PVAc溶液中PVAc的质量分数为6‑14wt%。

[0015] 更优选地，交联葡聚糖凝胶的制备中，PVAc溶液的使用量为碱性溶液的30‑60wt%。

[0016] 更优选地，交联葡聚糖凝胶的制备中，ECH溶液为ECH的二氯乙烷溶液，ECH溶液中ECH的质量分数为3‑12wt%。

[0017] 更优选地，交联葡聚糖凝胶的制备中，ECH溶液的使用量为碱性溶液的50‑100wt%。

[0018] 优选地，三肽‑1铜的检测中，将交联葡聚糖凝胶浸泡于乙醇溶液中，搅拌下溶胀12‑48h，去离子水洗涤，装入层析柱中，三肽‑1铜溶液上样，洗脱，收集组分，紫外分光光度
计检测。

[0019] 更优选地，三肽‑1铜溶液由待检测的三肽‑1铜样品溶于去离子水中制得，三肽‑1铜溶液上样量5‑20μL，三肽‑1铜溶液中三肽‑1铜的含量为1‑5wt%。

[0020] 更优选地，乙醇溶液中乙醇的质量分数为60‑80wt%。

[0021] 优选地，三肽‑1铜的检测方法中包含改性燕麦β‑葡聚糖的制备。

[0022] 更优选地，改性燕麦β‑葡聚糖的制备中，将氧化燕麦β‑葡聚糖加入乙醇溶液中，在60‑80℃的温度下搅拌溶解，加入6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液，搅拌反应6‑24h，反应完成后冷
却至室温，抽滤，无水乙醇洗涤，干燥，得到改性燕麦β‑葡聚糖。

[0023] 更进一步优选地，改性燕麦β‑葡聚糖的制备中，乙醇溶液中乙醇的质量分数为30‑60wt%。

[0024] 更进一步优选地，改性燕麦β‑葡聚糖的制备中，氧化燕麦β‑葡聚糖的添加量为乙醇溶液的1‑4wt%。

[0025] 更进一步优选地，改性燕麦β‑葡聚糖的制备中，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液的溶剂为乙醇，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液中6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺的含量为6‑24wt%。

[0026] 更进一步优选地，改性燕麦β‑葡聚糖的制备中，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液的使用量为乙醇溶液的7‑21wt%。

[0027] 优选地，三肽‑1铜的检测方法中包含氧化燕麦β‑葡聚糖的制备。

[0028] 更优选地，氧化燕麦β‑葡聚糖的制备中，将水解燕麦β‑葡聚糖加入乙醇溶液中，在60‑80℃的温度下搅拌溶解，加入高碘酸钠溶液，避光氧化4‑12h，加入乙二醇终止反应，冷
却至室温，抽滤，干燥，得到氧化燕麦β‑葡聚糖。

[0029] 更进一步优选地，氧化燕麦β‑葡聚糖的制备中，乙醇溶液中乙醇的质量分数为30‑60wt%。

[0030] 更进一步优选地，氧化燕麦β‑葡聚糖的制备中，水解燕麦β‑葡聚糖的使用量为乙醇溶液的1‑3wt%。

[0031] 更进一步优选地，氧化燕麦β‑葡聚糖的制备中，高碘酸钠溶液中高碘酸钠的质量分数为20‑60wt%。

[0032] 更进一步优选地，氧化燕麦β‑葡聚糖的制备中，高碘酸钠溶液的使用量为乙醇溶液的2‑6wt%。

[0033] 更进一步优选地，氧化燕麦β‑葡聚糖的制备中，乙二醇的使用量为乙醇溶液的4‑12wt%。

[0034] 更进一步优选地，氧化燕麦β‑葡聚糖的制备中，乙醇沉淀中乙醇的使用量为待沉淀溶液的200wt%以上。

[0035] 优选地，三肽‑1铜的检测方法中包含燕麦β‑葡聚糖的提取和水解燕麦β‑葡聚糖的制备。

[0036] 更优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，将燕麦麸皮研磨，得到的燕麦麸皮粉末加入乙醇溶液中，在80‑90℃的温度下回流1‑5h，离心去除醇提上清液，乙醇洗涤，烘干得到燕麦麸
皮醇处理物；加入蒸馏水中，在50‑60℃的温度下搅拌提取0.5‑3h，离心取水提上清液得到
燕麦麸皮水提取液；加入氯化钙，在65‑85℃的温度下加入耐高温α‑淀粉酶酶解20‑60min，
调节pH至7‑9，在30‑40℃的温度下加入胰蛋白酶酶解2‑6h，离心，取上清液，调节pH至中性，
加入乙醇沉淀，离心，取沉淀加入蒸馏水，冷冻干燥，得到燕麦β‑葡聚糖。

[0037] 更进一步优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，乙醇溶液中乙醇的质量分数为80‑90wt%。

[0038] 更进一步优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，燕麦麸皮粉末的使用量为乙醇溶液的15‑25wt%。

[0039] 更进一步优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，燕麦麸皮醇处理物的使用量为蒸馏水的5‑15wt%。

[0040] 更进一步优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，氯化钙的使用量为燕麦麸皮水提取液的0.4‑3.6wt%。

[0041] 更进一步优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，耐高温α‑淀粉酶的使用量为燕麦麸皮水提取液的0.3‑2.1wt%。

[0042] 更进一步优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，胰蛋白酶的使用量为燕麦麸皮水提取液的0.2‑1.2wt%。

[0043] 更进一步优选地，燕麦β‑葡聚糖的提取中，乙醇沉淀中乙醇的使用量为待沉淀溶液的200wt%以上。

[0044] 更优选地，水解燕麦β‑葡聚糖的制备中，将燕麦β‑葡聚糖加入蒸馏水中，在60‑80℃的温度下搅拌溶解得到燕麦β‑葡聚糖溶液，加入浓盐酸，在60‑80℃的温度下水解30‑
120min，然后冷却至室温，调节pH至中性，加入乙醇沉淀，离心，取沉淀加入蒸馏水，冷冻干
燥，得到水解燕麦β‑葡聚糖。

[0045] 更进一步优选地，水解燕麦β‑葡聚糖的制备中，燕麦β‑葡聚糖的使用量为蒸馏水的0.6‑1.5wt%。

[0046] 更进一步优选地，水解燕麦β‑葡聚糖的制备中，浓盐酸的使用量为蒸馏水的0.8‑2.4wt%。

[0047] 更进一步优选地，水解燕麦β‑葡聚糖的制备中，乙醇沉淀中乙醇的使用量为待沉淀溶液的200wt%以上。

[0048] 优选地，交联葡聚糖凝胶制备中还可使用葡聚糖接枝物，葡聚糖接枝物的使用量为碱性溶液的1‑3.5wt%。在制备交联葡聚糖凝胶的过程中，通过引入一定葡聚糖接枝物，与
改性燕麦β‑葡聚糖共同形成交联结构，最终得到的交联葡聚糖凝胶具有更优异的性能，耐
压性能、回复性及粘聚性均有提高。

[0049] 优选地，三肽‑1铜的检测方法中包含葡聚糖接枝物的制备。

[0050] 更优选地，葡聚糖接枝物的制备中，将乳清蛋白与燕麦β‑葡聚糖分别加入蒸馏水中，混合均匀后，冷冻干燥，然后于湿度为75‑85%及50‑60℃的温度下反应96h以上，得到葡
聚糖接枝物。

[0051] 更进一步优选地，葡聚糖接枝物的制备中，乳清蛋白的使用量为燕麦β‑葡聚糖的40‑100wt%。

[0052] 本发明公开了一种改性燕麦β‑葡聚糖的制备方法，包括：

[0053] 通过提取工序由燕麦麸皮中提取出燕麦β‑葡聚糖；

[0054] 燕麦β‑葡聚糖经水解、氧化得到氧化燕麦β‑葡聚糖；

[0055] 氧化燕麦β‑葡聚糖与6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺于乙醇溶液中反应得到改性燕麦β‑葡聚糖。

[0056] 本发明公开了一种改性燕麦β‑葡聚糖，包括：燕麦β‑葡聚糖上由氧化形成的羰基与6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺形成Schiff碱结构。

[0057] 本发明公开了一种交联葡聚糖凝胶，包括：交联结构中包含上述的改性燕麦β‑葡聚糖的交联葡聚糖凝胶。

[0058] 本发明公开了上述的改性燕麦β‑葡聚糖在检测三肽‑1铜方法中的用途。

[0059] 本发明由于采用了6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺与氧化燕麦β‑葡聚糖反应生成改性燕麦β‑葡聚糖，然后由上述改性燕麦β‑葡聚糖与环氧氯丙烷反应生成交联葡聚糖凝胶，因而具有
如下有益效果：交联葡聚糖凝胶的耐压性能提高，耐压性能由流通压力表征，流通压力为
0.09‑0.13MPa；交联葡聚糖凝胶的硬度好；交联葡聚糖凝胶的回复性优，回复性为0.5‑0.8；
粘聚性好，粘聚性为0.55‑0.90。所得交联葡聚糖凝胶可应用于对三肽‑1铜的检测方法中，
得到优异的分离检测效果，因此，本发明是一种使用了耐压性好、硬度佳的交联葡聚糖凝胶
的三肽‑1铜的检测方法。

附图说明

[0060] 图1为改性燕麦β‑葡聚糖的红外光谱图；

[0061] 图2为交联葡聚糖凝胶的流通压力图；

[0062] 图3为交联葡聚糖凝胶的硬度图；

[0063] 图4为交联葡聚糖凝胶的回复性图；

[0064] 图5为交联葡聚糖凝胶的粘聚性图；

[0065] 图6为三肽‑1铜HPLC检测图。

具体实施方式

[0066] 以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

[0067] 本发明仅提供可以对三肽‑1铜样品处理并可进行检测，若要定量，可依需要进行标准曲线绘制，并进行定量计算。

[0068] 实施例1：

[0069] 一种三肽‑1铜的检测方法，

[0070] 燕麦β‑葡聚糖的提取：将燕麦麸皮研磨，得到的燕麦麸皮粉末加入乙醇溶液中，在90℃的温度下回流3h，离心去除醇提上清液，乙醇洗涤，烘干得到燕麦麸皮醇处理物；加入
蒸馏水中，在60℃的温度下搅拌提取2h，离心取水提上清液得到燕麦麸皮水提取液；加入氯
化钙，在80℃的温度下加入耐高温α‑淀粉酶酶解40min，调节pH至8，在35℃的温度下加入胰
蛋白酶酶解4h，离心，取上清液，调节pH至中性，加入乙醇沉淀，离心，取沉淀加入蒸馏水，冷
冻干燥，得到燕麦β‑葡聚糖。乙醇溶液中乙醇的质量分数为85wt%，燕麦麸皮粉末的使用量
为乙醇溶液的20wt%，燕麦麸皮醇处理物的使用量为蒸馏水的10wt%，氯化钙的使用量为燕
麦麸皮水提取液的2.5wt%，耐高温α‑淀粉酶的使用量为燕麦麸皮水提取液的0.9wt%，胰蛋
白酶的使用量为燕麦麸皮水提取液的1.0wt%。乙醇沉淀中乙醇的使用量为待沉淀溶液的
300wt%。

[0071] 水解燕麦β‑葡聚糖的制备：将燕麦β‑葡聚糖加入蒸馏水中，在70℃的温度下搅拌溶解得到燕麦β‑葡聚糖溶液，加入浓盐酸，在70℃的温度下水解90min，然后冷却至室温，调
节pH至中性，加入乙醇沉淀，离心，取沉淀加入蒸馏水，冷冻干燥，得到水解燕麦β‑葡聚糖。
燕麦β‑葡聚糖的使用量为蒸馏水的1.2wt%，浓盐酸的使用量为蒸馏水的2.0wt%。乙醇沉淀
中乙醇的使用量为待沉淀溶液的300wt%。

[0072] 氧化燕麦β‑葡聚糖的制备：将水解燕麦β‑葡聚糖加入乙醇溶液中，在70℃的温度下搅拌溶解，加入高碘酸钠溶液，避光氧化9h，加入乙二醇终止反应，冷却至室温，抽滤，干
燥，得到氧化燕麦β‑葡聚糖。乙醇溶液中乙醇的质量分数为50wt%，水解燕麦β‑葡聚糖的使
用量为乙醇溶液的2wt%，高碘酸钠溶液中高碘酸钠的质量分数为40wt%，高碘酸钠溶液的使
用量为乙醇溶液的5wt%，乙二醇的使用量为乙醇溶液的8wt%。乙醇沉淀中乙醇的使用量为
待沉淀溶液的300wt%。

[0073] 改性燕麦β‑葡聚糖的制备：将氧化燕麦β‑葡聚糖加入乙醇溶液中，在70℃的温度下搅拌溶解，加入6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液，搅拌反应12h，反应完成后冷却至室温，抽滤，无
水乙醇洗涤，干燥，得到改性燕麦β‑葡聚糖。乙醇溶液中乙醇的质量分数为50wt%，氧化燕麦
β‑葡聚糖的添加量为乙醇溶液的3wt%，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液的溶剂为乙醇，6‑乙氧基吡
嗪‑3‑胺溶液中6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺的含量为18wt%，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液的使用量为乙
醇溶液的9wt%。

[0074] 交联葡聚糖凝胶的制备：将改性燕麦β‑葡聚糖加入碱性溶液中，加入PVAc溶液和ECH溶液，升温在80℃的温度下搅拌反应6h，反应完成后，甲苯洗涤，乙醇洗涤，蒸馏水洗涤，
抽滤，干燥，得到交联葡聚糖凝胶。碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中氢氧化钠的质量
分数为0.8wt%，氧化燕麦β‑葡聚糖的使用量为碱性溶液的2.5wt%，PVAc溶液为PVAc的二氯
乙烷溶液，PVAc溶液中PVAc的质量分数为10wt%，PVAc溶液的使用量为碱性溶液的40wt%，
ECH溶液为ECH的二氯乙烷溶液，ECH溶液中ECH的质量分数为10wt%，ECH溶液的使用量为碱
性溶液的50wt%。

[0075] 三肽‑1铜的检测：将交联葡聚糖凝胶浸泡于乙醇溶液中，搅拌下溶胀24h，去离子水洗涤，装入层析柱中，三肽‑1铜溶液上样，洗脱，收集组分，紫外分光光度计检测。乙醇溶
液中乙醇的质量分数为70wt%。紫外检测波长为220nm。三肽‑1铜溶液由待检测的三肽‑1铜
样品溶于去离子水中制得，三肽‑1铜溶液上样量10μL，三肽‑1铜溶液中三肽‑1铜的含量为
3wt%。

[0076] 洗脱中，流动相A为乙腈；流动相B为0.10wt％的三氟乙酸‑水溶液；流动相使用前均经0.45μm滤膜过滤。流速1.0mL/min。

[0077] 洗脱程序：0‑4min，20％A；4‑5min，10％A；5‑10min，20％A。

[0078] 实施例2：

[0079] 一种三肽‑1铜的检测方法，

[0080] 本实施例与实施例1相比，不同之处仅在于，改性燕麦β‑葡聚糖的制备中，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液的使用量为乙醇溶液的16wt%。

[0081] 实施例3：

[0082] 一种三肽‑1铜的检测方法，

[0083] 燕麦β‑葡聚糖的提取：将燕麦麸皮研磨，得到的燕麦麸皮粉末加入乙醇溶液中，在90℃的温度下回流3h，离心去除醇提上清液，乙醇洗涤，烘干得到燕麦麸皮醇处理物；加入
蒸馏水中，在60℃的温度下搅拌提取2h，离心取水提上清液得到燕麦麸皮水提取液；加入氯
化钙，在80℃的温度下加入耐高温α‑淀粉酶酶解40min，调节pH至8，在35℃的温度下加入胰
蛋白酶酶解4h，离心，取上清液，调节pH至中性，加入乙醇沉淀，离心，取沉淀加入蒸馏水，冷
冻干燥，得到燕麦β‑葡聚糖。乙醇溶液中乙醇的质量分数为85wt%，燕麦麸皮粉末的使用量
为乙醇溶液的20wt%，燕麦麸皮醇处理物的使用量为蒸馏水的10wt%，氯化钙的使用量为燕
麦麸皮水提取液的2.5wt%，耐高温α‑淀粉酶的使用量为燕麦麸皮水提取液的0.9wt%，胰蛋
白酶的使用量为燕麦麸皮水提取液的1.0wt%。乙醇沉淀中乙醇的使用量为待沉淀溶液的
300wt%。

[0084] 水解燕麦β‑葡聚糖的制备：将燕麦β‑葡聚糖加入蒸馏水中，在70℃的温度下搅拌溶解得到燕麦β‑葡聚糖溶液，加入浓盐酸，在70℃的温度下水解90min，然后冷却至室温，调
节pH至中性，加入乙醇沉淀，离心，取沉淀加入蒸馏水，冷冻干燥，得到水解燕麦β‑葡聚糖。
燕麦β‑葡聚糖的使用量为蒸馏水的1.2wt%，浓盐酸的使用量为蒸馏水的2.0wt%。乙醇沉淀
中乙醇的使用量为待沉淀溶液的300wt%。

[0085] 葡聚糖接枝物的制备：将乳清蛋白与燕麦β‑葡聚糖分别加入蒸馏水中，混合均匀后，冷冻干燥，然后于湿度为80%及60℃的温度下反应168h，得到葡聚糖接枝物。乳清蛋白的
使用量为燕麦β‑葡聚糖的60wt%。

[0086] 氧化燕麦β‑葡聚糖的制备：将水解燕麦β‑葡聚糖加入乙醇溶液中，在70℃的温度下搅拌溶解，加入高碘酸钠溶液，避光氧化9h，加入乙二醇终止反应，冷却至室温，抽滤，干
燥，得到氧化燕麦β‑葡聚糖。乙醇溶液中乙醇的质量分数为50wt%，水解燕麦β‑葡聚糖的使
用量为乙醇溶液的2wt%，高碘酸钠溶液中高碘酸钠的质量分数为40wt%，高碘酸钠溶液的使
用量为乙醇溶液的5wt%，乙二醇的使用量为乙醇溶液的8wt%。乙醇沉淀中乙醇的使用量为
待沉淀溶液的300wt%。

[0087] 改性燕麦β‑葡聚糖的制备：将氧化燕麦β‑葡聚糖加入乙醇溶液中，在70℃的温度下搅拌溶解，加入6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液，搅拌反应12h，反应完成后冷却至室温，抽滤，无
水乙醇洗涤，干燥，得到改性燕麦β‑葡聚糖。乙醇溶液中乙醇的质量分数为50wt%，氧化燕麦
β‑葡聚糖的添加量为乙醇溶液的3wt%，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液的溶剂为乙醇，6‑乙氧基吡
嗪‑3‑胺溶液中6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺的含量为18wt%，6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺溶液的使用量为乙
醇溶液的16wt%。

[0088] 交联葡聚糖凝胶的制备：将改性燕麦β‑葡聚糖和葡聚糖接枝物加入碱性溶液中，加入PVAc溶液和ECH溶液，升温在80℃的温度下搅拌反应6h，反应完成后，甲苯洗涤，乙醇洗
涤，蒸馏水洗涤，抽滤，干燥，得到交联葡聚糖凝胶。碱性溶液为氢氧化钠溶液，碱性溶液中
氢氧化钠的质量分数为0.8wt%，氧化燕麦β‑葡聚糖的使用量为碱性溶液的2.5wt%，葡聚糖
接枝物的使用量为碱性溶液的1.3wt%，PVAc溶液为PVAc的二氯乙烷溶液，PVAc溶液中PVAc
的质量分数为10wt%，PVAc溶液的使用量为碱性溶液的40wt%，ECH溶液为ECH的二氯乙烷溶
液，ECH溶液中ECH的质量分数为10wt%，ECH溶液的使用量为碱性溶液的50wt%。

[0089] 三肽‑1铜的检测：将交联葡聚糖凝胶浸泡于乙醇溶液中，搅拌下溶胀24h，去离子水洗涤，装入层析柱中，三肽‑1铜溶液上样，洗脱，收集组分，紫外分光光度计检测。乙醇溶
液中乙醇的质量分数为70wt%。紫外检测波长为220nm。三肽‑1铜溶液由待检测的三肽‑1铜
样品溶于去离子水中制得，三肽‑1铜溶液上样量10μL，三肽‑1铜溶液中三肽‑1铜的含量为
3wt%。

[0090] 洗脱中，流动相A为乙腈；流动相B为0.10wt％的三氟乙酸‑水溶液；流动相使用前均经0.45μm滤膜过滤。流速1.0mL/min。

[0091] 洗脱程序：0‑4min，20％A；4‑5min，10％A；5‑10min，20％A。

[0092] 实施例4：

[0093] 一种三肽‑1铜的检测方法，

[0094] 本实施例与实施例1相比，不同之处仅在于，交联葡聚糖凝胶的制备中，葡聚糖接枝物的使用量为碱性溶液的2.4wt%。

[0095] 对比例1：

[0096] 本对比例与实施例2相比，不同之处仅在于，交联葡聚糖凝胶的制备中，将改性燕麦β‑葡聚糖替换为氧化燕麦β‑葡聚糖。

[0097] 对比例2：

[0098] 本对比例与实施例4相比，不同之处仅在于，交联葡聚糖凝胶的制备中，将改性燕麦β‑葡聚糖替换为氧化燕麦β‑葡聚糖。

[0099] 试验例

[0100] 1.改性燕麦β‑葡聚糖红外分析

[0101] 测试样品：实施例2的方法中制备得到的改性燕麦β‑葡聚糖。

[0102] 溴化钾压片，红外光谱分析。

[0103] 本发明实施例2方法中制备得到的改性燕麦β‑葡聚糖的红外光谱图如图1所示，其‑1 ‑1 ‑1
中，3413cm 处为羟基红外吸收峰，2926cm 处为甲基红外吸收峰，2862cm 处为亚甲基红外
‑1
吸收峰，1708cm 处为羰基红外吸收峰，表明改性燕麦β‑葡聚糖中有碳氧双键残留，1631cm
‑1 ‑1
处为碳碳双键的红外吸收峰，1579、1409cm 处为含氮杂环的红外吸收峰，表明成功得到
改性燕麦β‑葡聚糖。

[0104] 2.耐压性能测试

[0105] 测试样品：各实施例和对比例制备得到的交联葡聚糖凝胶。

[0106] 将上述样品在室温下在蒸馏水中溶胀72h后，装柱（直径1.0cm，长10cm），连接AKTA层析系统，蒸馏水作为流动相，柱稳定后，增加流速，记录流速对应柱压，当流速增大到一定
值时，压力不再稳定时，以此压力作为测试样品的耐压性能。

[0107] 本发明制备得到的交联葡聚糖凝胶的耐压性能测试结果如图2所示，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为对比例1，F为对比例2，其中，实施例1制备得到的
交联葡聚糖凝胶的流通压力为0.094MPa，实施例2制备得到的交联葡聚糖凝胶的流通压力
为0.102MPa，对比例1制备得到的交联葡聚糖凝胶的流通压力为0.079MPa，实施例2与对比
例1相比，实施例2制备得到的交联葡聚糖凝胶的流通压力提高了29.11%，表明采用改性燕
麦β‑葡聚糖制备成的交联葡聚糖凝胶的耐压性能更好，改性燕麦β‑葡聚糖的使用效果优于
氧化燕麦β‑葡聚糖，因此，可知6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺对氧化燕麦β‑葡聚糖的改性，是提高交
联葡聚糖凝胶的耐压性能的关键因素；实施例3制备得到的交联葡聚糖凝胶的流通压力为
0.120MPa，实施例4制备得到的交联葡聚糖凝胶的流通压力为0.126MPa，实施例4与实施例2
相比，实施例4制备得到的交联葡聚糖凝胶的流通压力提高了23.53%，表明将葡聚糖接枝物
与改性燕麦β‑葡聚糖共同用于制备交联葡聚糖凝胶后，交联葡聚糖凝胶的耐压性能大幅提
高；对比例2制备得到的交联葡聚糖凝胶的流通压力为0.085MPa，实施例2、实施例4及对比
例1‑2之间相比，表明未采用6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺对氧化燕麦β‑葡聚糖改性后，采用葡聚糖
接枝物与氧化燕麦β‑葡聚糖共同制备得到的交联葡聚糖凝胶的耐压性能提高并不明显，而
将改性燕麦β‑葡聚糖与葡聚糖接枝物共同使用得到的交联葡聚糖凝胶具有最优的耐压性
能。

[0108] 本发明得到的交联葡聚糖凝胶的耐压性能提高，耐压性能由流通压力表征，流通压力为0.09‑0.13MPa。

[0109] 3.质构参数测试

[0110] 测试样品：各实施例和对比例制备得到的交联葡聚糖凝胶。

[0111] 将0.03g上述样品加入3mL蒸馏水中，在75℃的温度下搅拌6h，零下20℃冷冻，25℃解冻，重复冷冻、解冻20次，最后一次解冻后，进行质构测试。

[0112] 质构测试条件：采用TPA模式，探头为SMS P/5，3g的触发力，测前速度为2mm/s，测试速度0.5 mm/s，测后速度为2mm/s，穿透距离4mm。

[0113] 本发明制备得到的交联葡聚糖凝胶的硬度测试结果如图3所示，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为对比例1，F为对比例2，所得交联葡聚糖凝胶的硬度
均在8.5g以上，并且硬度的提升并不明显。

[0114] 本发明得到的交联葡聚糖凝胶的硬度好。

[0115] 本发明制备得到的交联葡聚糖凝胶的回复性测试结果如图4所示，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为对比例1，F为对比例2，其中，实施例1制备得到的
交联葡聚糖凝胶的回复性为0.51，实施例2制备得到的交联葡聚糖凝胶的回复性为0.54，对
比例1制备得到的交联葡聚糖凝胶的回复性为0.32，实施例2与对比例1相比，实施例2制备
得到的交联葡聚糖凝胶的回复性提高了68.75%，表明采用改性燕麦β‑葡聚糖制备成的交联
葡聚糖凝胶的回复性更好，改性燕麦β‑葡聚糖的使用效果优于氧化燕麦β‑葡聚糖，因此，可
知6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺对氧化燕麦β‑葡聚糖的改性，是提高交联葡聚糖凝胶的回复性的关
键因素；实施例3制备得到的交联葡聚糖凝胶的回复性为0.66，实施例4制备得到的交联葡
聚糖凝胶的回复性为0.74，实施例4与实施例2相比，实施例4制备得到的交联葡聚糖凝胶的
回复性提高了37.04%，表明将葡聚糖接枝物与改性燕麦β‑葡聚糖共同用于制备交联葡聚糖
凝胶后，交联葡聚糖凝胶的回复性大幅提高；对比例2制备得到的交联葡聚糖凝胶的回复性
为0.37，实施例2、实施例4及对比例1‑2之间相比，表明未采用6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺对氧化燕
麦β‑葡聚糖改性后，采用葡聚糖接枝物与氧化燕麦β‑葡聚糖共同制备得到的交联葡聚糖凝
胶的回复性提高并不明显，而将改性燕麦β‑葡聚糖与葡聚糖接枝物共同使用得到的交联葡
聚糖凝胶具有最优的回复性。

[0116] 本发明得到的交联葡聚糖凝胶的回复性优，回复性为0.5‑0.8。

[0117] 本发明制备得到的交联葡聚糖凝胶的粘聚性测试结果如图5所示，A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4，E为对比例1，F为对比例2，其中，实施例1制备得到的
交联葡聚糖凝胶的粘聚性为0.61，实施例2制备得到的交联葡聚糖凝胶的粘聚性为0.67，对
比例1制备得到的交联葡聚糖凝胶的粘聚性为0.43，实施例2与对比例1相比，实施例2制备
得到的交联葡聚糖凝胶的粘聚性提高了55.81%，表明采用改性燕麦β‑葡聚糖制备成的交联
葡聚糖凝胶的粘聚性更好，改性燕麦β‑葡聚糖的使用效果优于氧化燕麦β‑葡聚糖，因此，可
知6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺对氧化燕麦β‑葡聚糖的改性，是提高交联葡聚糖凝胶的粘聚性的关
键因素；实施例3制备得到的交联葡聚糖凝胶的粘聚性为0.78，实施例4制备得到的交联葡
聚糖凝胶的粘聚性为0.83，实施例4与实施例2相比，实施例4制备得到的交联葡聚糖凝胶的
粘聚性提高了23.88%，表明将葡聚糖接枝物与改性燕麦β‑葡聚糖共同用于制备交联葡聚糖
凝胶后，交联葡聚糖凝胶的粘聚性大幅提高；对比例2制备得到的交联葡聚糖凝胶的粘聚性
为0.46，实施例2、实施例4及对比例1‑2之间相比，表明未采用6‑乙氧基吡嗪‑3‑胺对氧化燕
麦β‑葡聚糖改性后，采用葡聚糖接枝物与氧化燕麦β‑葡聚糖共同制备得到的交联葡聚糖凝
胶的粘聚性提高并不明显，而将改性燕麦β‑葡聚糖与葡聚糖接枝物共同使用得到的交联葡
聚糖凝胶具有最优的粘聚性。

[0118] 本发明得到的粘聚性好，粘聚性为0.55‑0.90。

[0119] 4.三肽‑1铜的HPLC检测结果

[0120] 浙江湃肽的产品名为蓝铜胜肽进行三肽‑1铜的检测，蓝铜胜肽按实施例2的检测方法中经层析柱洗脱后收集的组分。

[0121] 采用高效液相色谱检测所述供试样品溶液；色谱条件如下：

[0122] 色谱系统：Agilent 1200；色谱柱：C18色谱柱；柱温25℃。

[0123] 流动相A为乙腈；流动相B为0.10wt％的三氟乙酸‑水溶液；流动相使用前均经0.45μm滤膜过滤。流速1.0mL/min。

[0124] 洗脱程序：

[0125] 0‑4min，20％A；4‑5min，10％A；5‑10min，20％A。

[0126] 进样量：2.5μL。

[0127] 紫外检测器检测波长：220nm。

[0128] 蓝铜胜肽的HPLC图如图6所示，表明经本发明层析柱洗脱后得到的三肽‑1铜的纯度非常高。

[0129] 以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同
的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。