一种通过低磷处理有效提高半夏生物碱含量的方法

摘要

本发明公开一种通过低磷处理有效提高半夏生物碱含量的方法。在半夏种植过程中，通过低磷培养液处理半夏组培苗，建立快速有效提高半夏生物碱含量的方法。半夏组培苗在短期低磷处理不影响生长发育前提下，诱导半夏生物碱合成途径相关基因(PtCNL，PtCHD，PtKAT，PtPDC，PtAO4和PtAHAS)的表达，提高半夏块茎生物碱含量。本发明实施简单、效果显著，为提高半夏生物碱含量、改善半夏质量提供强有力的参考。

权利要求

1.一种通过低磷营养液提高半夏组培苗生物碱含量的方法，其特征在于所述方法诱导半夏生物碱合成途径相关基因PtCNL，PtCHD，PtKAT，PtPDC，PtAO4 和 PtAHAS的表达，具体是将半夏组培苗块茎浸渍低磷培养液进行常规培养3‑7天；

所述的低磷培养液的制备工艺具体是将4.16g不含磷酸盐的MS培养基、900ml ddH2O混合后利用KOH和HCL调节pH至5.8，ddH2O定容至1L；然后在121℃下灭菌20min 后加入100μL磷酸盐缓冲液和100ml的0.1M KCl溶液；其中磷酸盐缓冲液是1mol/L K2HPO4，1mol/L KH2PO4按照体积比8.5：91.5混合而成；

所述半夏组培苗生物碱含量包括嘌呤碱鸟苷G、尿苷U和腺苷A含量。

说明书

一种通过低磷处理有效提高半夏生物碱含量的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提高半夏生物碱含量的处理方法，尤其涉及一种通过低磷营养液提高半夏组培苗生物碱含量的方法。

背景技术

[0002] 天南星科植物半夏Pinellia ternate是一种药用植物，除具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等作用外，还具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗癫痫等药理活性。半夏以块茎入药，其次生代谢产物包括生物碱类、有机酸类、挥发油类、黄酮类等是最主要的活性成分，具有多种药理作用。半夏总生物碱成分包括麻黄碱、鸟苷(guanosine，G)、尿苷(uridine，U)、腺苷(adenosine，A)及葫芦巴碱等化合物。

[0003] 半夏生物碱的生物合成主要有两种途径：β‑氧化途径和非β‑氧化途径。其中，β氧化途径主要的合成酶有：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸辅酶A连接酶(CNL)、肉桂酰辅酶A水合脱氢酶(CHD)和3‑酮脂酰辅酶A硫解酶(KAT)。非β氧化途径则主要包括3‑羟异丁酰辅酶A(CHY)、苯甲醛脱氢酶(BALDH)和醛氧化酶4(AO4)。

[0004] 逆境胁迫因子能通过激活或抑制次生代谢途径中的相关酶从而产生大量次生代谢产物，抵御外界不良因子。磷是植物生长发育所必需的大量元素之一，参与光合、呼吸、能量储存和传递，以及次生代谢等众多生理过程。植物在缺磷情况下会通过磷信号转导通路调控一系列的生理变化来应对磷胁迫，包括次生代谢产物的积累。通过低磷处理提高半夏生物碱含量，一方面减少磷肥使用量，降低生产成本；另一方面可降低半夏生物碱类药物的市场价格，在医药产业中对于提高植物药的药材质量具有很好的指导意义。目前未有与本专利所提及的提高半夏生物碱含量相关专利和文献。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过低磷处理有效提高半夏生物碱含量的方法，具体是一种在半夏种植过程中，通过低磷培养液处理半夏组培苗，建立快速有效提高半夏生物碱含量的方法。

[0006] 一种通过低磷营养液提高半夏组培苗生物碱含量的方法，包括以下步骤：

[0007] 将半夏组培苗块茎浸渍低磷培养液(LP)进行常规培养3‑7天；

[0008] 所述的低磷(LP)培养液的制备工艺具体是4.16g不含磷酸盐的MS培养基、900ml ddH2O混合后利用KOH和HCL将pH调至5.8，ddH2O定容至1L；然后在121℃下灭菌20min后加入100μL磷酸盐缓冲液和100ml的0.1M KCl溶液。

[0009] 所述的磷酸盐缓冲液是1mol/LK2HPO4，1mol/LKH2PO4按照体积比8.5：91.5混合而成。

[0010] 所述半夏组培苗生物碱含量为总生物碱含量，具体包括嘌呤碱鸟苷(G)、尿苷(U)和腺苷(A)含量。

[0011] 本发明的有益效果：半夏组培苗在短期低磷处理不影响生长发育前提下，诱导半夏生物碱合成途径相关基因(PtCNL，PtCHD，PtKAT，PtPDC，PtAO4和PtAHAS)的表达，提高半夏块茎生物碱含量。本发明实施简单、效果显著，为提高半夏生物碱含量、改善半夏质量提供强有力的参考。

附图说明

[0012] 图1 HP和LP处理7天后半夏表型图，其中a为半夏植株表型；b为半夏块茎表型；c为半夏块茎湿重；d为半夏块茎干重；e为半夏不同组织中有效磷含量。

[0013] 图2 HP和LP处理3天后半夏生物碱合成途径基因表达，其中a为块茎；b为叶；c为根组织。

[0014] 图3 HP和LP处理后半夏块茎总生物碱含量检测结果；

[0015] 图4 HP和LP处理后半夏块茎中三种嘌呤碱鸟苷(G)、尿苷(U)和腺苷(A)含量检测结果。

具体实施方式

[0016] 下面结合具体实施方案对本发明做进一步的说明，这些实施例应被理解为仅为本发明的最佳实例，而非以任何方式限制本发明，凡在分发明原则之内所做的任何改进、修饰和等同替换，均应包含在本发明的范围之内。

[0017] 实施例1：

[0018] 1、水培液的配置：

[0019] (1)分别配置1mol/LK2HPO4，1mol/L KH2PO4和0.1M的KCl溶液，121℃灭菌20min。

[0020] (2)8.5ml上述1mol/L的K2HPO4溶液和91.5ml上述1mol/L的KH2PO4溶液混合得到磷酸盐缓冲液(100mL)。

[0021] (3)低磷(LP)培养液(1L)：称取4.16g市售Mruashige and Skoog without Phosphat(CAISSON，02180014)培养基(即不含磷酸盐的MS培养基)，加入900ml ddH2O，用KOH和HCL将PH调至5.8，ddH2O定容至1L。121℃20min灭菌后加入100μL磷酸盐缓冲液和100ml氯化钾溶液。

[0022] (4)高磷(HP)培养液(1L)：在900ml不含磷酸盐培养液基础上加入100mL磷酸盐缓冲液。

[0023] 2、半夏组培苗进行低磷、高磷培养液处理

[0024] 半夏组培苗为天南星科植物半夏(30d)，购买自陕西起源农业科技有限责任公司；

[0025] 在超净工作台更换培养液，向2个培养瓶内分别倒入20毫升LP培养液、HP培养液，使其淹没半夏组培苗块茎。25℃条件下，光照2000‑3000lx135μE/m2s，16hd光照/8h黑暗培养箱内培养。培育3天或7天后取半夏块茎，60℃烘干后测定其总生物碱含量。每3d更换一次培养液。

[0026] 实施例2：半夏有效磷含量测定

[0027] 1)有效磷的提取

[0028] 取0.1g实施例1处理后的半夏鲜样至带玻璃珠的2mL离心管，用液氮研磨成粉末，加入500μL 5M的浓硫酸，随后将样品转移到15mL离心管中，加入5mL蒸馏水。另外使用500μL 5M的浓硫酸和5mL蒸馏水做2个空白对照。按照常规方法折叠9mm定性滤纸，将上述样品过滤到连续流动分析仪(荷兰SKALAR)自动进样器配套的进样管中。过滤后，按照顺序放到自动进样器相应的位置上，2个空白首先放置，上机检测，参考(徐玘明等，运用SAN～(++)型连续流动分析仪测定水稻无机磷含量)。

[0029] 2)标准曲线的配置

[0030] 800mL蒸馏水中加入4.875g NaH2PO4·2H2O(分析纯)，并不断搅拌，定容到1000mL配置无机磷母液；

[0031] 800mL蒸馏水中缓慢加入25mL浓硫酸(分析纯)，并不断搅拌，定容到1000mL，获得反应液I；

[0032] 使用100mL容量瓶，加入80mL反应液I后，分别加入125μL、250μL、500μL、1000μL、2000μL、3000μL无机磷母液，用反应液稀释至刻度，得到1.25mg/L，2.5mg/L，5mg/L，10mg/L，
20mg/L，30mg/L梯度的标准溶液。

[0033] 利用实施例1HP和LP处理7天后，LP胁迫下半夏块茎、叶和根组织中有效磷含量均显著降低(图1e)，而半夏植株(图1a)、块茎(图1b)、湿重(图1c)和干重(图1d)均没有明显变化，说明短期低磷处理不影响半夏的生长发育。

[0034] 实施例3：荧光定量PCR检测低磷胁迫下半夏生物碱合成相关基因的表达量[0035] HP和LP处理3天后，Trizol法分提取半夏不同组织的RNA，按照HiScript1st Strand cDNA Synthesis Kit的方法将上述RNA进行逆转录(10μl逆转录体系加入500ng的Total RNA)得到cDNA。按照下列组分配制反应液：HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix 5μl，PCR Forward Primer(10μM)0.2μl，Reverse Primer(10μM)0.2μl，cDNA0.5μl，ddH2O 4.1μl。扩增程序如下：94℃5min，94℃10s，58℃20s，72℃20s，40Cycles，72℃收集荧光，以Pt18S为内参。

[0036] 由图2可知，低磷处理诱导半夏块茎、叶和根组织中磷转运基因PtAT1的表达，说明各组织均响应磷信号的转导。半夏各组织中生物碱合成相关基因PtCNL、PtCHD、PtKAT、PtPDC、PtAO4和PtAHAS受到低磷的强烈诱导，说明这些基因在低磷胁迫下半夏生物碱合成过程中发挥重要作用。

[0037] 用于上述定量检测不同组织中生物碱合成相关基因表达量的引物序列为如下：

[0038] Pt18S‑q‑F：CGCATATAAATAAACGGAGGAA，如SEQ ID No.1所示；

[0039] Pt18S‑q‑R：GACGCTTCTACAGACTACA，如SEQ ID No.2所示；

[0040] PtPAL‑q‑F：GTCCTGCTTCGGCTTCGTCA，如SEQ ID No.3所示；

[0041] PtPAL‑q‑R：CCAACATCCTGGCTCTGCTCTC，如SEQ ID No.4所示；

[0042] PtCNL‑q‑F：GTGGTGCCAACTTTGTGCCC，如SEQ ID No.5所示；

[0043] PtCNL‑q‑R：GATGGAGGTGCGTTGGGAGT，如SEQ ID No.6所示；

[0044] PtCHD‑q‑F：GTCTCGGTGTAGGCGCTCT，如SEQ ID No.7所示；

[0045] PtCHD‑q‑R：GAGTTCACGGGAGGGTTCA，如SEQ ID No.8所示；

[0046] PtKAT‑q‑F：TGATCCTGTTCTTGGCGTGTA，如SEQ ID No.9所示；

[0047] PtKAT‑q‑R：CTTGGGAGGGGTCAATAAATC，如SEQ ID No.10所示；

[0048] PtPDC‑q‑F：AGGGCGGTGTAGTTCCAGTTC，如SEQ ID No.11所示；

[0049] PtPDC‑q‑R：CGGCGAGTTGCGGATATGAGT，如SEQ ID No.12所示；

[0050] PtCHY‑q‑F：CCATCCTATCCTTTCGCTGAC，如SEQ ID No.13所示；

[0051] PtCHY‑q‑R：TGCTGGGGCTTCCTTCTATCT，如SEQ ID No.14所示；

[0052] PtBALDH‑q‑F：ACCTGATGGGACTTTTGCTT，如SEQ ID No.15所示；

[0053] PtBALDH‑q‑R：TTCCATGAGGACAACTGCTT，如SEQ ID No.16所示；

[0054] PtAO4‑q‑F：GGTGCAGCCATAAGTGAAGT，如SEQ ID No.17所示；

[0055] PtAO4‑q‑R：CCATCTGAGTTTGCGAGGTA，如SEQ ID No.18所示；

[0056] PtAHAS‑q‑F：TGTCCTCTTCTCCGACTCCA，如SEQ ID No.19所示；

[0057] PtAHAS‑q‑R：GCTCGTTGGGACCGTATCT，如SEQ ID No.20所示；

[0058] 实施例4：生物碱含量的检测

[0059] 1、总生物碱含量的测定

[0060] (1)溶液配置

[0061] 柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液：32mL 0.1M柠檬酸和68mL 0.1M柠檬酸钠，用少许HCl或NaOH调节pH至5.4。

[0062] 0.05％的溴麝香草酚蓝：溴麝香草酚蓝0.1g，加入0.05mol/L氢氧化钠溶液3.2mL使其溶解，加水稀释至200mL，即得，临用前配制。

[0063] (2)对照品溶液制备

[0064] 准确称量0.0052g盐酸麻黄碱标准品置于250mL容量瓶，加水定容至刻度，摇匀，即得浓度为20.8μg/mL的盐酸麻黄碱标准品溶液。分别精密量取标准品溶液0，0.05，0.2，0.8，1.6，3.2，4.8mL，各补充水至5mL，依次加入pH＝5.40柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液5mL，0.05％溴麝香草酚蓝标准液1mL，氯仿10mL，振摇1min，放置分层，静置1h，分别取氯仿层备用。在最大波长414nm处测定氯仿层。以盐酸麻黄碱浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线的回归方程。

[0065] (3)供试品溶液制备

[0066] 精密称取0.1000g干燥的实施例1处理7天后半夏块茎粉末，置于50mL离心管中，加入0.5mL浓氨水和10mL氯仿，冷浸过夜，超声提取1h(功率500W,频率40KHz)。12000rpm离心10min，取上清并依次精密加入pH＝5.40的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液5mL、0.05％的溴麝香草酚蓝溶液1mL，水5mL，充分摇振(1min)，静置1h后分取氯仿层，作为供试液。在波长414nm处进行测定。实验重复3次，取平均值。

[0067] (4)结果计算

[0068] 样品浓度用下列标准曲线计算：C＝(ABS‑0.0078)/0.0007，r2＝0.9938[0069] 其中：C指样品浓度，ABS指样品吸光度。

[0070] 总生物碱含量用下列公式计算：X＝(C×10‑6)/(W×F)×100％

[0071] 其中：X指总生物碱含量；W指样品重量(0.1000g)；F指稀释因子(0.1)。

[0072] 2、腺苷、鸟苷和尿苷的含量测定

[0073] (1)对照品溶液制备

[0074] 分别准确称量0.0012g鸟苷标准品，0.0020g腺苷标准品和0.0050g尿苷标准品置于10mL容量瓶，用50％甲醇溶液溶解，定容至刻度，摇匀，0.22μm滤膜过滤即可。

[0075] (2)混合对照品溶液制备

[0076] 分别精密吸取上述对照品溶液1mL置于10mL容量瓶中，用50％甲醇溶液溶解，定容至刻度，摇匀，0.22μm滤膜过滤即可。

[0077] (3)供试品溶液制备

[0078] 准确称量0.1000g已研磨成粉的半夏块茎样品，置于50mL离心管内，精密称取2mL 50％甲醇溶液，震荡混匀，超声提取30min(功率500W,频率40KHz)，冷却至室温，12000rpm离心10min，将上清用0.22μm滤膜过滤即可。

[0079] (4)色谱条件

[0080] 流动相A为甲醇，流动相B为水。梯度洗脱：0‑6min，1％A；6‑15min，1‑4％A；15‑45min，4‑30％A；10min，50％A冲洗柱子；5min，1％A平衡色谱柱。流速：0.5mL/min；柱温箱温度：30℃；进样体积：10μL；检测波长：254nm。

[0081] 如图3‑4所示，低磷处理7天后，半夏块茎中总生物碱含量提高了21％，三种嘌呤生物碱鸟苷(G)、尿苷(U)和腺苷(A)的含量分别为高磷条件下的15.99、5.73和10.33倍，受到显著诱导。这些结果表明，低磷激活生物碱的合成。

[0082] 上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。