一种过冷状态下无冰晶低温保存方法和复苏方法

摘要

本发明公开了一种过冷状态下无冰晶低温保存方法和复苏方法，涉及低温医学技术领域。该过冷状态下无冰晶低温保存方法包括：向悬浮有细胞或组织的冷冻保护液中加入油类物质，使油类物质完全覆盖于冷冻保护液的表面形成样本，将样本进行低温保存。本申请可以在‑20℃~0℃下抑制冷冻保护液的结冰，具有明显的抑制冰晶形成与阻止冰晶生长的作用，使得组织细胞库等可以避免使用DMSO等具有细胞毒性的冷冻保护液，更有利于构建安全、无毒的生物样本库。本申请可以在更低的温度下进行更长时间的（>2天）组织细胞低温保存，减轻缺血‑再灌注损伤，而且在复苏后组织细胞的存活率更高，并能够保持原有的生物学特性。

权利要求

1.一种过冷状态下无冰晶低温保存方法，其特征在于，其包括：向悬浮有细胞或组织的冷冻保护液中加入油类物质，使所述油类物质完全覆盖于所述冷冻保护液的表面形成样本，将所述样本进行低温保存；所述油类物质包括轻链矿物油和橄榄油中的至少一种；所述冷冻保护液包括DMEM培养基或UW液；将所述样本进行低温保存包括：将所述样本置于预冷至3℃‑5℃的温度下进行温度平衡10‑20min，再将所述样本放置于预冷至‑20℃ 0℃的温度~

下进行过冷状态低温保存。

2.根据权利要求1所述的过冷状态下无冰晶低温保存方法，其特征在于，所述冷冻保护

6 6

液中的细胞密度为1×10 5×10/ml。

~

3.根据权利要求1所述的过冷状态下无冰晶低温保存方法，其特征在于，所述冷冻保护液还包括聚乙二醇和3‑O‑甲基‑d葡萄糖，其中，所述聚乙二醇在所述冷冻保护液中的体积百分比浓度为3‑7%，所述3‑O‑甲基‑d葡萄糖在所述冷冻保护液中的浓度为0.1‑0.5mol/L，所述冷冻保护液中不含DMSO。

4.根据权利要求1所述的过冷状态下无冰晶低温保存方法，其特征在于，所述细胞或组织选自人或非人哺乳动物。

5.一种过冷状态下无冰晶低温复苏方法，其特征在于，其包括将权利要求1‑4任一项所述的过冷状态下无冰晶低温保存方法保存的样本进行复苏。

6.根据权利要求5所述的过冷状态下无冰晶低温复苏方法，其特征在于，复苏所述样本包括：将所述样本置于3℃‑5℃的温度下复温8‑12min，利用吸管在油液面下方加入预热至室温的完全培养基，随后物理吸除所述冷冻保护液面上的所述油类物质，混匀后离心，弃去上清液，再加入室温高糖完全培养基，进行复苏培养20‑30h。

7.根据权利要求5所述的过冷状态下无冰晶低温复苏方法，其特征在于，采用巴氏吸管的毛细作用物理吸除所述油类物质。

说明书

一种过冷状态下无冰晶低温保存方法和复苏方法

技术领域

[0001] 本发明涉及低温医学技术领域，具体而言，涉及一种过冷状态下无冰晶低温保存方法和复苏方法。

背景技术

[0002] 我国每年新增重型肝炎患者百余万，其中通过肝移植手术得到救治的患者不足1%，临床上迫切需要满足这部分患者治疗需求。生物人工肝已被临床实践证实作为一种器
官替代的有效治疗方案。实际上，随着生物人工肝在临床的大量运用，需要建立由丰富经验
的团队在无菌条件下用特殊设备进行肝细胞的扩增、功能及安全性等标准化评价的“细胞
工厂”，并以此建立类似于血库的生物人工用肝细胞库来满足临床需要。

[0003] 细胞低温保存是通过低温限制细胞酶的活性，减缓生化反应进程，抑制生物体的新陈代谢，降低能量消耗，并逐渐达到低能耗的状态，延长细胞保存时间。

[0004] 0℃ 4℃左右是组织、器官和细胞短期存储的解决方案，但缺血再灌注损伤及保存~
时间短仍是客观存在的问题。深低温保存虽能长时间保存细胞，但细胞内冰晶形成、高浓度
细胞毒性保存剂、操作程序繁琐等限制了临床应用。细胞悬液在零度以下的过冷状态低于
均衡凝固点但尚未冻结的这种亚稳状态，无特殊条件干预的情况下，轻微温度改变就会引
发细胞内冰晶的形成和冻结危险造成细胞大量死亡。

[0005] 常温和0℃ 4℃的组织、细胞低温保存虽然不会形成冰晶造成损伤，但是依然存在~
缺血再灌注损伤，保存时间短，最长不超过3 5天，且复苏后组织、细胞活力较差，不符合生
~
物人工用肝细胞库的要求。

[0006] 传统慢速梯度冻存需要缓慢降温避免细胞内外渗透压骤变引起细胞膜破裂以及冰晶的形成，因而需要程序化降温系统，增加了设备成本和时间人力成本。

[0007] 玻璃化冻存技术要求快速降温，若保存的细胞量过多、密度过高或组织体积较大，在降温过程中热量不均一扩散由此产生热应力可以损伤细胞，因此玻璃化冻存仅适用于少
量、低密度细胞及小体积组织。另外，玻璃化冻存需要高浓度的冻存保护剂，最常用的为二
甲亚砜（DMSO），本身就具有细胞毒性，可以影响细胞的分化。

[0008] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供过冷状态下无冰晶低温保存方法和过冷状态下无冰晶低温复苏方法。

[0010] 本发明是这样实现的：

[0011] 第一方面，本发明提供一种过冷状态下无冰晶低温保存方法，向悬浮有细胞或组织的冷冻保护液中加入油类物质，使所述油类物质完全覆盖于所述冷冻保护液的表面形成
样本，将所述样本进行低温保存；所述油类物质包括轻链矿物油和橄榄油中的至少一种；所
述冷冻保护液包括DMEM培养基或UW液。

[0012] 在可选的实施方式中，所述冷冻保护液中的细胞密度大于1×106 5×106/ml。~

[0013] 在可选的实施方式中，所述冷冻保护液还包括聚乙二醇和3‑O‑甲基‑d葡萄糖，其中，所述聚乙二醇在所述冷冻保护液中的体积百分比浓度为3‑7%，所述3‑O‑甲基‑d葡萄糖
在所述冷冻保护液中的浓度为0.1‑0.5mol/L；

[0014] 优选地，所述聚乙二醇在所述冷冻保护液中的体积百分比浓度为4‑6%，所述3‑O‑甲基‑d葡萄糖在所述冷冻保护液中的浓度为0.1‑0.3mol/L；

[0015] 优选地，所述冷冻保护液中不含DMSO。

[0016] 在可选的实施方式中，将所述样本进行低温保存包括：将所述样本放置于预冷至‑20℃ 0℃的温度下进行过冷状态低温保存；
~

[0017] 优选地，再将所述样本进行过冷状态低温保存之前，还包括将所述样本置于预冷至3℃‑5℃的温度下进行温度平衡10‑20min。

[0018] 在可选的实施方式中，所述细胞或组织选自人或非人哺乳动物。

[0019] 第二方面，本发明提供一种过冷状态下无冰晶低温复苏方法，其包括将前述实施方式任一项所述的过冷状态下无冰晶低温保存方法保存的样本进行复苏。

[0020] 在可选的实施方式中，复苏所述样本包括：将所述样本置于3℃‑5℃的温度下复温8‑12min，利用吸管在油液面下方加入预热至室温的完全培养基，随后物理吸除所述冷冻保
护液面上的所述油类物质，混匀后离心，弃去上清液，再加入室温高糖完全培养基，进行复
苏培养20‑30h。

[0021] 在可选的实施方式中，采用巴氏吸管的毛细作用物理吸除所述油类物质；

[0022] 优选地，离心速度为800‑1200 rpm，离心时间为2‑5min；

[0023] 优选地，所述完全培养基为DMEM完全培养基。

[0024] 本发明具有以下有益效果：

[0025] 本申请提供的过冷状态下无冰晶低温保存方法与目前临床常用组织、细胞库低温保存方式相比，本申请可以在‑20℃ 0℃下抑制冷冻保护液的结冰，具有明显的抑制冰晶形
~
成与阻止冰晶生长的作用，使得组织细胞库等可以避免使用DMSO等具有细胞毒性的冷冻保
护液，更有利于构建安全、无毒的生物样本库。本申请提供的过冷状态下无冰晶低温保存方
法与目前常温保存及4℃短期保存时间相比，本申请可以在更低的温度下进行更长时间的
（>2天）组织细胞低温保存，减轻缺血‑再灌注损伤，而且在复苏后组织细胞的存活率更高，
并能够保持原有的生物学特性。本申请提供的过冷状态下无冰晶低温保存方法与目前应用
于辅助生殖领域的玻璃化冻存技术相比，本申请对于保存组织的体积限制小，保存细胞的
密度与细胞量更大，无需复杂的设备与装置即可进行。

附图说明

[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。

[0027] 图1为实施例1和对比例1的样品分别在恒定‑20℃冰箱中进行冷冻7天后容器竖直状态下的示意图；

[0028] 图2为实施例1和对比例1的样品分别在恒定‑20℃冰箱中进行冷冻7天后容器倾斜状态下的示意图；

[0029] 图3为本申请提供的实验例二中不同处理组冻保持复苏后HepG2存活细胞的增殖趋势与活力示意图，其中，从左至右依次为Control组、UW+油封组和UW+PEG+3‑OMG+油封组。

具体实施方式

[0030] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。

[0031] 本发明实施例提供了一种过冷状态下无冰晶低温保存方法，其包括：向悬浮有细胞或组织的冷冻保护液中加入油类物质，使油类物质完全覆盖于冷冻保护液的表面形成样
本，将样本进行低温保存。

[0032] 具体来说，包括如下步骤：

[0033] S1、选择或制备合适的冷冻保护液。

[0034] 冷冻保护液可以是常规细胞培养基如DMEM培养基（优选为含10%胎牛血清的DMEM培养基），可以是UW液（the University of Wisconsin solution），其中，冷冻保护液中
DMSO为非必要成分。

[0035] 进一步地，冷冻保护液还包括聚乙二醇和3‑O‑甲基‑d葡萄糖，其中，聚乙二醇在冷冻保护液中的体积百分比浓度为3‑7%，3‑O‑甲基‑d葡萄糖在冷冻保护液中的浓度为0.1‑
0.5mol/L；其中，聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）是一种非渗透性低温保护剂，不能
透过细胞膜，维持细胞外的渗透压，防止细胞水肿，它还有一个特殊的作用机制：破坏水溶
液的氢键从而降低水的冰点，促进水的过冷状态形成。3‑O‑甲基‑d葡萄糖（3‑OMG）是一种葡
萄糖的衍生物，可以被细胞主动吸收，但是其不可代谢，因此会聚积在细胞内，起到维持细
胞形态与体积的作用，已经研究表明3‑OMG是大鼠原代肝细胞的有效低温保护因子。本申请
中，通过在DMEM培养基或UW液中加入聚乙二醇和3‑O‑甲基‑d葡萄糖可以进一步提升低温保
存条件下细胞活力，同时可以提升回收细胞贴壁率。优选地，聚乙二醇在冷冻保护液中的体
积百分比浓度为4‑6%，3‑O‑甲基‑d葡萄糖在冷冻保护液中的浓度为0.1‑0.3mol/L。

[0036] S2、获取细胞或组织。

[0037] 所获得的细胞应每日换液，冷冻保存时处于对数增长期，状态良好且形态、功能正常，获得的组织应为新鲜组织，未出现污染现象，热缺血时间符合冷冻保存要求，这样处理
可以大幅度提高复苏后组织和细胞的活性和稳定性，可有效解决复苏后直接规模化扩增问
题。本申请中的细胞或组织选自人或非人哺乳动物，其中，非人哺乳动物包括但不限于：猿、
猴、牛、马、兔、鼠等等。

[0038] S3、将细胞或组织用冷冻保护液悬浮，注入到合适的容器中，如15ml离心管，并使6 6
细胞密度达到1×10 5×10/ml。
~

[0039] S4、注入油类物质。

[0040] 向悬浮有细胞或组织的冷冻保护液中注入适量的油类物质，可见油类物质漂浮在冷冻保护液液面上并逐渐完全覆盖液面形成样本，操作过程中应避免气泡混入。油类物质
包括但不限于轻链矿物油和橄榄油中的至少一种。所用合适的油类物质的量应完全覆盖冷
冻保护液表面，考虑到操作及运输过程中的颠簸，用量需适当增加，并且在加入油类物质
后，冷冻保护液与油类物质之间应该无气泡残留。

[0041] 经发明人研究发现，均质冰晶形成通常发生在更低的温度中（≤‑40℃），形成冰核机制是纯水内部水分子的随机运动。但是在此温度以上，杂质中的固相液相交界就为冰核
的形成提供了优先级，导致了非均质冰晶的形成。限制水分子随机运动是难以实现的，因此
创造过冷环境时，本申请着重于减少在杂质固相边界的存在下形成的非均质冰晶。在纯水
的条件下，避免液体内杂质的干扰，气/液平面成为了理论上冰晶核形成的主要位置。本申
请在细胞冷冻保护液基础上，加入不溶于水的合适的油类物质（包括但不限于轻链矿物油、
橄榄油），并使油类物质完全覆盖液体表面，隔绝了空气与冷冻保护液液面，消除了气体/保
护液平面的非均质冰晶成核位点，此时在‑20℃ 0℃环境下，细胞冷冻保护液的冰晶形成机
~
制趋向于均质结晶，非均质结晶机制受到抑制，极大地降低了细胞冷冻保护液的冻结频率，
避免了细胞受到冰晶形成带来的损伤，同时也可以降低冻存保护液中毒性物质的使用浓度
（如DMSO），此外在细胞复苏过程中，油类物质可以通过简单的物理吸附清除。本申请抑制了
冷冻保护液的冻结，令组织、细胞在‑20℃ 0℃进行低温保存成为可能，并且可以显著提升
~
组织、细胞的存活率，保障它们复苏后的质量，适用于组建短中期的组织细胞即用库，如生
物人工用肝细胞库等。

[0042] S5、低温保存。

[0043] 将样本置于预冷至3℃‑5℃的温度下进行温度平衡10‑20min，接着迅速放置于预冷至‑20℃ 0℃的温度下进行过冷状态低温保存。温度平衡可以使样品不至于在短时间内
~
产生巨大的温度差，有利于保护样本内的细胞或组织。

[0044] 此外，本发明还提供了一种过冷状态下无冰晶低温复苏方法，其包括将上述过冷状态下无冰晶低温保存方法保存的样本进行复苏。

[0045] 具体来说，将样本置于3℃‑5℃的温度下复温8‑12min，利用吸管在油液面下方加入预热至室温的DMEM完全培养基，随后采用巴氏吸管的毛细作用物理吸除冷冻保护液面上
的油类物质，混匀后离心（离心速度为800‑1200 rpm，离心时间为2‑5min），弃去上清液，再
加入室温高糖DMEM完全培养基，进行复苏培养20‑30h。

[0046] 本申请中的复苏方法操作简单，复苏后细胞或组织的质量得到了保证，其存活率得到显著提升，适用于组建短中期的组织细胞库，如生物人工用肝细胞库等。

[0047] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0048] 实施例1

[0049] 本实施例提供了一种过冷状态下无冰晶低温保存方法，其包括如下步骤：

[0050] S1、选择UW液作为冷冻保护液。

[0051] S2、获取人类细胞、组织。

[0052] S3、将人类细胞、组织用预冷至4℃的冷冻保护液悬浮，注入到15ml离心管，并使细6
胞密度达到1×10/ml。

[0053] S4、注入适量的轻链矿物油，可见轻链矿物油漂浮在冷冻保护液液面上并逐渐完全覆盖液面形成样本，操作过程中应避免气泡混入。

[0054] S5、将样本置于预冷至4℃的温度下进行温度平衡15min，接着迅速放置于预冷至‑16℃的温度下进行过冷状态低温保存24h。

[0055] 实施例2

[0056] 本实施例提供了一种过冷状态下无冰晶低温保存方法，其包括如下步骤：

[0057] S1、选择含10%胎牛血清的DMEM培养基作为冷冻保护液。

[0058] S2、获取人类细胞、组织。

[0059] S3、将人类细胞、组织用冷冻保护液悬浮，注入到15ml离心管，并使细胞密度达到56
×10/ml。

[0060] S4、注入适量的橄榄油，可见橄榄油漂浮在冷冻保护液液面上并逐渐完全覆盖液面形成样本，操作过程中应避免气泡混入。

[0061] S5、将样本置于预冷至4℃的温度下进行温度平衡20min，接着迅速放置于预冷至‑16℃的温度下进行过冷状态低温保存。

[0062] S6、将样本置于4℃的温度下复温10min，并采用巴氏吸管的毛细作用物理吸除冷冻保护液面上的油类物质，加入细胞完全培养基，混匀后离心，离心速度为300g/5min，再用
细胞完全培养基重悬，进行细胞培养。

[0063] 实施例3

[0064] 本实施例提供了一种过冷状态下无冰晶低温保存方法，其与实施例1基本相同，区别在于，本申请中冷冻保护液为包括UW液、5% PEG和 0.2mol/L 3‑OMG。

[0065] 实施例4

[0066] 本实施例提供了一种过冷状态下无冰晶低温保存方法，其与实施例1基本相同，区别在于，本申请中冷冻保护液为包括UW液、3% PEG和 0.5mol/L 3‑OMG。

[0067] 实施例5

[0068] 本实施例提供了一种过冷状态下无冰晶低温保存，其与实施例1基本相同，区别在于，本申请中冷冻保护液为包括UW液、7% PEG和 0.1mol/L 3‑OMG。

[0069] 对比例1

[0070] 本对比例提供一种常规低温保存方法，其包括如下步骤：

[0071] S1、选择UW液作为冷冻保护液。

[0072] S2、获取人类细胞、组织。

[0073] S3、将人类细胞、组织用预冷至4℃的冷冻保护液悬浮，注入到15ml离心管，并使细6
胞密度达到1×10/ml。

[0074] S4、将悬浮有人类细胞、组织的冷冻保护液在恒定‑20℃冰箱中保存。

[0075] 实验例一

[0076] 将实施例1和对比例1获得的样本恒定‑20℃冰箱中进行冷冻7天。7天后，先竖直观察实施例1和对比例1的颜色（请参阅图1），接着倾斜容器观察实施例1和对比例1的状态（请
参阅图2）。

[0077] 如图1所示，左侧为实施例1提供的实验组，其含1mlUW溶液，上方加入了1ml的轻链矿物油使其完全覆盖UW液表面，可见UW液呈略透明状，与常温UW液色泽一致；右侧为对比例
1提供的对照组，其含1mlUW溶液，未加入其他物质，可见其呈白色，与常温UW液色泽不一致。

[0078] 如图2所示，下方为实施例1提供的实验组，倾斜容器可见其UW液呈流动状态，与常温UW液色泽一致，明显未有冻结；上方为对比例1提供的对照组，倾斜容器未见其流动，与常
温UW液色泽不一致，已明显冻结。

[0079] 实验例二

[0080] 一、实验分组

[0081] 将实施例1、实施例3和对比例1分别进行分组：

[0082] Control组： ‑16℃+ UW液（即对比例1）；

[0083] UW+油封组： ‑16℃+ UW液+ 油封处理（即实施例1）；

[0084] UW+PEG+3‑OMG+油封组：‑16℃+ UW液+ 5% PEG+ 0.2mol/L 3‑OMG+ 油封处理（即实施例3）。

[0085] 二、实验步骤

[0086] 1）取已长满瓶底80%且完全贴壁的182cm2细胞培养瓶，弃去培养液，加入适量的PBS溶液，缓慢震荡，随后弃去，如此洗涤3‑4次。

[0087] 2）弃去PBS溶液后，加入25%胰蛋白酶溶液3mL，轻微震荡使其铺满整个培养瓶瓶底，置于37摄氏度、5%CO2培养箱中消化3分钟，期间在倒置显微镜下判断细胞消化程度，若
出现细胞边缘变钝变圆、细胞胞质回缩、细胞间隙增宽，应立即停止消化。

[0088] 3）加入含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基稀释终止消化，稀释比例至少为1：5。用巴氏吸管反复吹打瓶底的HepG2细胞，使贴壁细胞脱落培养瓶瓶底，形成均匀的单细胞
悬浮液。

[0089] 4）进行细胞计数，确定细胞数量后进行离心1000rpm，3分钟离心，弃去上清液。用PBS溶液洗涤HepG2细胞2次，最后离心弃上清。

[0090] 5）在各组中加入预冷至4摄氏度的UW液或UW+PEG+3‑OMG低温保护液，调整细胞数6
量至1× 10/mL。

[0091] 6）根据使用适当量程的微量移液枪于细胞悬液上小心地加注 1mL的矿物油，此过程需精细操作，避免在油类液体与水溶液之间出现气泡，并使油类液体完全均匀覆盖于培
养液表面，其后统一置于4℃冰箱待用，在移动过程中避免颠簸以防破坏油封液面连续性。

[0092] 7）HepG2细胞在4℃冰箱或‑16℃冰箱中进行低温保存12小时、24小时后，从冰箱中快速取出置于4℃冰箱中复温10分钟（此过程亦需避免颠簸或震荡），随后置于超净台中，利
用巴氏吸管在油液面下方加入2mL预热至室温的DMEM完全培养基，随后再利用巴氏吸管吸
取液面上方的矿物油（应尽量吸取干净），吹打混匀后进行1000rpm，3分钟离心，弃去上清。

[0093] 8）加入室温高糖DMEM完全培养基3mL，移至6孔板中进行复苏培养24小时。

[0094] 9）在复苏培养24小时后，在超净台中使用PBS轻柔洗涤各组HepG2细胞3次，在6孔板各孔中滴加25%胰蛋白酶溶液0.5mL，轻微震荡使其铺满整个培养瓶瓶底，置于37摄氏度、
5%CO2培养箱中消化3分钟，期间在倒置显微镜下判断细胞消化程度，若出现细胞边缘变钝
变圆、细胞胞质回缩、细胞间隙增宽，应立即停止消化。加入含10%胎牛血清的高糖DMEM完全
培养基稀释终止消化，稀释比例至少为1：5。用巴氏吸管反复吹打瓶底的HepG2细胞，使贴壁
细胞脱落6孔板，形成均匀的单细胞悬浮液，将悬浮液移至15mL离心管中做好标记，进行
1000rpm，3分钟离心，弃去上清液。加入含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基1mL进行细胞
6
重悬，随后对细胞悬液进行细胞计数。回收细胞贴壁率=（悬液细胞数/10×100%）

[0095] 10）将低温保存一段时间后的HepG2细胞离心重悬，在吹打均匀后用200μL微量移液器移取细胞悬浮液100μL至96孔板中并做好各组标记，置于37摄氏度、5%CO2培养箱中预
培养10min，随后在96孔板中加入10μL CCK8工作液，再置于37摄氏度、5%CO2培养箱中孵育1
小时后使用多功能酶标仪测定各组450nm吸光度。注意在滴加液体至96孔板时，不要产生气
泡，否则会影响读数。

[0096] 三、实验结果：

[0097] 1）CCK8检测结果基本能反映HepG2存活细胞的增殖趋势与活力。从图3观察到3组HepG2细胞活力随时间变化的趋势。CCK8检测结果发现各组在低温保存12小时、24小时后，
各组细胞活力已经开始出现明显差异，以UW+PEG+3‑OMG+油封组细胞活力最高，UW+油封组
次之，Control组细胞活力最低，且其余两组与Control对照组相比，具有统计学意义（P<
0.05）。

[0098] 2）在低温保存时间达12小时，复苏培养24小时后以UW+PEG+3‑OMG+油封组的回收细胞贴壁率最高，达90.8%，UW+油封组为83.2%，二者与Control组23.3%相比存在统计学意
义（P<0.05）。低温保存时间延长至24小时后，以UW+PEG+3‑OMG+油封组的回收贴壁率最高为
80.9%，与Control组的22.1%相比具有统计学意义（P<0.05）。详见表1。

[0099] 表1. HepG2回收细胞贴壁率

[0100]

[0101] 综上所述，本申请提供的过冷状态下无冰晶低温保存方法与目前临床常用组织、细胞库低温保存方式相比，本申请可以在‑20℃ 0℃下抑制冷冻保护液的结冰，具有明显的
~
抑制冰晶形成与阻止冰晶生长的作用，使得组织细胞库等可以避免使用DMSO等具有细胞毒
性的冷冻保护液，更有利于构建安全、无毒的生物样本库。本申请提供的过冷状态下无冰晶
低温保存方法与目前常温保存及4℃短期保存时间相比，本申请可以在更低的温度下进行
更长时间的（>2天）组织细胞低温保存，减轻缺血‑再灌注损伤，而且在复苏后组织细胞的存
活率更高，并能够保持原有的生物学特性。本申请提供的过冷状态下无冰晶低温保存方法
与目前应用于辅助生殖领域的玻璃化冻存技术相比，本申请对于保存组织的体积限制小，
保存细胞的密度与细胞量更大，无需复杂的设备与装置即可进行。

[0102] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。