一种防治黄芪根腐病的复合菌群及其应用

摘要

本发明属于根腐病防治技术领域，具体公开一种防治黄芪根腐病的复合菌群及其应用。该复合菌群是由Stenotrophomonas maltophilia CCNWHYBXL‑13、Agrobacterium CCNWDCBXLAMB‑100、Ochrobactrum pecorisCCNWDCBXLAMB‑306、Advenella kashmirensis CCNWDCBXLAMB‑316四种菌混合得到。该复合菌群能稳定地在黄芪根部定殖，对黄芪根腐病的防治与促进黄芪生长具有协同增效的作用。

权利要求

1.一种防治黄芪根腐病的复合菌群，其特征在于，其是由嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）CCNWHYBXL‑13、土壤杆菌（Agrobacterium sp.）CCNWDCBXLAMB‑100、苍白杆菌（Ochrobactrum）CCNWDCBXLAMB‑306、克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）CCNWDCBXLAMB‑316 四种菌混合得到；

所述四种菌均保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏编号依次为CCTCC M 2021393、CCTCC M 2021394、CCTCC M 2021395、CCTCC M 2021396。

2.根据权利要求1所述的防治黄芪根腐病的复合菌群，其特征在于，其是由所述嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）CCNWHYBXL‑13、所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）CCNWDCBXLAMB‑100、所述苍白杆菌（Ochrobactrum）CCNWDCBXLAMB‑

306与所述克什米尔小陌生菌（Advenella kashmirensis）CCNWDCBXLAMB‑316 等量混合得到。

3.根据权利要求1所述的复合菌群在防治黄芪根腐病中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黄芪根腐病是由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum引起的。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述四种菌的菌液浓度均为5‑10×7

10cfu/ mL。

6.一种防治黄芪根腐病的微生物菌剂，其特征在于，其包括权利要求1‑2任一项所述的复合菌群及可接受的辅料。

7.一种防治黄芪根腐病的方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求1‑2任一项所述复合菌群的溶液或权利要求6所述微生物菌剂的溶液浸泡黄芪种子过夜，再用质量分数

75%酒精消毒1min后催芽种植；和/或，

将权利要求1‑2任一项所述复合菌群或权利要求6所述微生物菌剂直接施用到黄芪根区土壤中。

8.根据权利要求7所述的防治黄芪根腐病的方法，其特征在于，所述复合菌群的溶液或7

所述微生物菌剂的溶液浸泡黄芪种子时的浓度为5‑10×10 cfu/mL，用量为100mL/200粒种子。

9.根据权利要求7所述的防治黄芪根腐病的方法，其特征在于，所述复合菌群或所述微7

生物菌剂施用到黄芪根部土壤时的用量为5‑10×10cfu/株。

10.根据权利要求7所述的防治黄芪根腐病的方法，其特征在于，用所述复合菌群的溶液或所述微生物菌剂的溶液浸泡黄芪种子过夜，和所述复合菌群或所述微生物菌剂直接施7

用到黄芪根区土壤中时，总用量为5‑10×10cfu/株。

说明书

一种防治黄芪根腐病的复合菌群及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于根腐病防治技术领域，具体公开一种防治黄芪根腐病的复合菌群及其应用。

背景技术

[0002] 黄芪是一种传统的中药材，为豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，具有增强免疫力、补气、抗肿瘤等多种功效。但由于化学农药的不规范使用、不科学的耕作措施等问题，导致黄芪根腐病在甘肃、山西等黄芪主产区严重爆发。

[0003] 相较于化学农药，生物农药具有对环境友好、对人畜无害、不破坏土壤结构等优点。根据农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心所登记的微生物肥料产品可知，现有菌肥大多以单株菌或者单一类群的微生物为主要成分，有效组分为芽孢杆菌的居多，如以胶冻样芽孢杆菌为主要成分的“爱迪生物微生物菌剂”，此外还有一些以假单胞菌和木霉菌为主要成分的菌肥，而这些菌肥大多是用来促进黄瓜、大豆、玉米等蔬菜类作物和粮食作物健康生长的，专门针对黄芪的菌肥产品则很少。在微生物肥料检验中心所有登记的产品中仅找到两种黄芪适用菌肥，分别为郑州侬易施生物科技有限公司开发的以哈茨木霉、淡紫紫孢菌为有效菌种的“微生物菌剂”和甘肃银海生物肥料科技有限公司开发的以解淀粉芽孢杆菌为有效菌种的“新春牌生物有机肥料”，但这两种菌肥组分过于单一，且并非专门针对黄芪根腐病所研制，因此本发明拟开发一种能够防治黄芪根腐病的菌剂产品来填补这一市场空白。

发明内容

[0004] 为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

[0005] 本发明提供一种防治黄芪根腐病的复合菌群，其是由Stenotrophomonas maltophilia CCNWHYBXL‑13、Agrobacterium CCNWDCBXLAMB‑100、Ochrobactrum pecoris CCNWDCBXLAMB‑306、Advenella kashmirensis CCNWDCBXLAMB‑316四种菌混合得到；

[0006] 所述四种菌均保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏编号依次为CCTCC M 2021393、CCTCC M 2021394、CCTCC M 2021395、CCTCC M 2021396。

[0007] 优选地，其是由所述Stenotrophomonas maltophilia CCNWHYBXL‑13、所述Agrobacterium CCNWDCBXLAMB‑100、所述Ochrobactrum pecoris CCNWDCBXLAMB‑306与所述Advenella kashmirensis CCNWDCBXLAMB‑316等量混合得到；

[0008] 本发明还提供了所述复合菌群在防治黄芪根腐病中的应用。

[0009] 优选地，所述黄芪根腐病是由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum引起的。

[0010] 优选地，所述四种菌的菌液浓度均为5‑10×107cfu/mL。

[0011] 本发明还提供一种防治黄芪根腐病的微生物菌剂，其包括上述任一项所述的复合菌群及可接受的辅料。

[0012] 本发明还提供一种防治黄芪根腐病的方法，包括以下步骤：用所述复合菌群的溶液或所述微生物菌剂的溶液浸泡黄芪种子过夜，再用质量分数75％酒精消毒1min后催芽种植；和/或，

[0013] 将所述复合菌群或所述微生物菌剂直接施用到黄芪根区土壤中。

[0014] 优选地，所述复合菌群浸泡黄芪种子时的浓度为5‑10×107cfu/mL，用量为100mL/200粒种子。

[0015] 优选地，所述复合菌群施用到黄芪根部土壤时的用量为5‑10×107cfu/株。

[0016] 优选地，用所述复合菌群的溶液或所述微生物菌剂的溶液浸泡黄芪种子过夜，和7
所述复合菌群或所述微生物菌剂直接施用到黄芪根区土壤中时，总用量为5‑10×10 cfu/株。

[0017] 对比现有技术，本发明具有以下有益效果：

[0018] 1、本发明中所用的CCNWHYBXL‑13、CCNWDCBXLAMB‑100与CCNWDCBXLAMB‑306是从黄芪根内分离得到，CCNWDCBXLAMB‑316是从黄芪根际分离得到，经过了黄芪的选择作用，均能稳定地在黄芪根部定殖，对于黄芪根腐病的防治与促进黄芪生长指标具有协同增效的作用。

[0019] 2、本发明中所用的复合菌群能有效抑制病原菌Fusarium oxysporum菌丝的生长。

[0020] 3、本发明提供的复合菌群可通过浸种使用或直接喷施于土壤或两种方法兼用，使用方便。

[0021] 4、本发明提供的复合菌群能有效防止F.oxysporum入侵黄芪根部。

[0022] 5、本发明提供的复合菌群能减少化学农药的使用。

[0023] 6、本发明提供的复合菌群使黄芪根长增长了30.95％，干重增加了9.1％，鲜重增加了64.09％，并使黄芪根腐病的发病率降低了42.43％。

[0024] 生物保藏说明

[0025] 生物材料：

[0026] CCNWHYBXL‑13；分类命名：嗜麦芽窄食单胞菌(拉丁文名称：Stenotrophomonas maltophilia)；

[0027] CCNWDCBXLAMB‑100；分类命名：土壤杆菌(拉丁文名称：Agrobacterium sp.)；

[0028] CCNWDCBXLAMB‑306；分类命名：苍白杆菌(拉丁文名称：Ochrobactrum)；

[0029] CCNWDCBXLAMB‑316；分类命名：克什米尔小陌生菌(拉丁文名称：Advenella kashmirensis)；

[0030] 以上四株菌均于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，CCNWHYBXL‑13、CCNWDCBXLAMB‑100、CCNWDCBXLAMB‑306与CCNWDCBXLAMB‑316的保藏编号分别为CCTCC M 2021393、CCTCC M 2021394、CCTCC M 2021395、CCTCC M 2021396，保藏地址为中国·武汉·武汉大学。

附图说明

[0031] 为了更清楚地说明本发明的功效，下面对实施过程中所需要使用的附图作简单介绍。

[0032] 图1为合成菌群的促生与抗病功效；其中：a‑d，合成菌群分别对黄芪干重、鲜重、根长、发病率的影响。

[0033] 图2为合成菌群中4株细菌的系统发育树；

[0034] 图3是复合菌群SC与其4个菌株成员的功效比较；其中：a‑f，复合菌群SC与其4个菌株成员分别对黄芪干重、鲜重、根长、株高、叶绿素含量以及根腐病发病率的影响。

具体实施方式

[0035] 下面通过实施例进一步描述本发明，但是本发明不受这些实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0036] 本发明提供一种防治黄芪根腐病的复合菌群，其是由CCNWHYBXL‑13、CCNWDCBXLAMB‑100、CCNWDCBXLAMB‑306、CCNWDCBXLAMB‑316四种菌混合得到；

[0037] 该四种菌均保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏编号依次为CCTCC  M 2021393、CCTCC M 2021394、CCTCC M 2021395、CCTCC M 2021396。

[0038] 上述复合菌群能够用于防治黄芪根腐病。

[0039] 下面通过实施例对本发明提供的复合菌群的筛选过程及防治效果进行说明。

[0040] 1、土壤样品采集

[0041] 2018年8月从甘肃省宕昌县黄芪种植基地中随机选择健康黄芪与患根腐病黄芪，放入自封袋，立即用冰袋冻存运回实验室，用于黄芪根内与根际细菌的分离。

[0042] 2、黄芪根系细菌的分离

[0043] 取黄芪样品，抖落掉根上的松散土壤，取黄芪根表2mm内的根际土5g，放入45mL无‑7 ‑3 ‑4 ‑5菌水中，摇床上摇30min，静置10min，取1mL上清液，梯度稀释至10 ，得到10 、10 、10 、10‑6 ‑7
、10 不同稀释度的黄芪根际土土壤悬液。取去除根际土的黄芪根，清洗干净根表泥土，并用质量分数75％的乙醇浸根2min，无菌水洗去残留乙醇，并在1％次氯酸钠中继续消毒
1min，用大量无菌水去除根表残留的消毒剂，并将黄芪根充分研磨，制得黄芪根匀浆液，将‑7 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7
其梯度稀释至10 ，得到10 、10 、10 、10 、10 不同稀释度的黄芪根悬液。在无菌环境下‑5 ‑6 ‑7
吸取稀释度为10 、10 、10 的根际土悬液与黄芪根悬液各100μL，涂布于分别稀释了0倍、‑3
10倍、20倍、50倍、100倍等5个稀释度的TSA、R2A和LB固体培养基上，吸取稀释度为10 、10‑4 ‑5
、10 的根际土悬液与黄芪根悬液各100μL涂布于分别稀释了0倍、10倍、20倍、50倍、100倍等5个稀释度的高氏一号固体培养基上，每个稀释梯度在同一种培养基上均做3个重复。将所有菌板置于28℃培养箱中培养3‑7天，选择形态、颜色、大小有差异的单菌落，在LB平板上划线纯化，分离出纯菌株。

[0044] 3、拮抗菌的筛选

[0045] 取上述分离的细菌，分别接种到TSB液体培养基中活化。同时取本实验室保藏的黄芪根腐病病原真菌F.oxysporum，在PDA平板上活化后，取直径5mm的菌饼接种在新的PDA平板中央，过菌饼的圆心在平板背面画一条直线，在该直线上取距圆心2.5cm的两个对称点，并在这两点处接黄芪分离菌，以接无菌水的F.oxysporum平板作为空白对照，置于28℃恒温培养箱培养。7天后观察黄芪分离菌与病原真菌间是否有抑菌圈的出现，若有抑菌圈，则记为F.oxysporum拮抗菌。

[0046] 实验结果表明，通过平板对峙实验得出34株F.oxysporum拮抗菌。

[0047] 4、促生菌筛选

[0048] 取上述分离的所有细菌，分别将其点接到PKO培养基中、蒙金娜培养基、解钾筛选培养基中，28℃恒温培养箱中培养7天，观察是否出现相应的溶磷解钾圈。将细菌接种到含有L‑色氨酸(100mg/L)的LB液体培养基，摇瓶培养24h后滴入白色陶瓷板上，并加50uL Salkowski比色液，室温下避光放置30min，若颜色变红则表示该菌能够分泌IAA。

[0049] 通过上述实验得出，具有产IAA能力的细菌有80株，具有溶无机磷能力的细菌有65株，具有溶有机磷能力的细菌有44株，具有解钾能力的细菌有40株。

[0050] 5、复合菌群的制备

[0051] 选择在患病黄芪腐根内显著富集且能稳定定殖于黄芪根系的4株菌CCNWHYBXL‑13、CCNWDCBXLAMB‑100、CCNWDCBXLAMB‑306、CCNWDCBXLAMB‑316，其中CCNWHYBXL‑13同时具有抑制F.oxysporum、产IAA与溶无机磷等特性；CCNWDCBXLAMB‑100具有产IAA与溶无机磷特
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性。将所述4株菌菌液浓度调节为1×10 cfu/mL，并按CCNWHYBXL‑13：CCNWDCBXLAMB‑100:
CCNWDCBXLAMB‑306:CCNWDCBXLAMB‑316＝1:1:1:1进行等量混合，得到复合菌群(SC)。

[0052] 6、复合菌群功效验证

[0053] 6.1分别将复合菌群与无菌水接种到黄芪种植袋中，以探究合成菌群是否具有明显的抗病与促生能力。

[0054] 结果如图1所示，复合菌群(SC)对黄芪的促生效果与抗病效果均良好。其中复合菌群(SC)使黄芪干重增加了9.1％、使鲜重增加了64.09％、使根长增长了30.95％。复合菌群(SC)对黄芪株高与叶绿素含量无显著促进作用。复合菌群(SC)使黄芪根腐病发病率降低了42.43％。

[0055] 6.2分别将SC菌群与SC成员CCNWHYBXL‑13、CCNWDCBXLAMB‑100、CCNWDCBXLAMB‑306和CCNWDCBXLAMB‑316接种到黄芪种植袋中，以探究SC菌群抗黄芪根腐病能力是否优于单接菌。

[0056] 结果如图3所示，接种病原菌的第20天，SC与CCNWDCBXLAMB‑316处理组均显著降低了黄芪根腐病的发病率，其中SC对根腐病的防治效果(使发病率降低了41.24％)优于所有单接菌。此外，SC菌群显著促进了黄芪的生长，其中，使黄芪株高增长了23.63％，使黄芪根长增长了49.17％，使黄芪鲜重增加了36.19％，使黄芪干重增加了10.19％，使黄芪叶绿素含量增加了19.45％。

[0057] 7、菌株CCNWHYBXL‑13、CCNWDCBXLAMB‑100、CCNWDCBXLAMB‑306、CCNWDCBXLAMB‑316鉴定

[0058] 形态特征：菌株CCNWHYBXL‑13在LB培养基上的单菌落呈淡黄色，边缘规整且不黏稠，中间扁平。镜检发现为短杆状、有鞭毛，呈革兰氏阴性。

[0059] CCNWDCBXLAMB‑100在LB培养基上的单菌落呈白色，半透明，菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐不黏稠，中间凸起。镜检发现为短杆状、无芽孢，有鞭毛，呈革兰氏阴性。

[0060] CCNWDCBXLAMB‑306在LB培养基上菌落呈白色，半透明，有完整的边缘，不形成芽孢，呈革兰氏阴性。

[0061] CCNWDCBXLAMB‑316在LB培养基上菌落为圆形，白色，有完整的边缘且不黏稠，中间凸起，不透明，镜检发现有鞭毛，呈革兰氏阴性。

[0062] 16S  rDNA测序：采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株CCNWHYBXL‑13、CCNWDCBXLAMB‑100、CCNWDCBXLAMB‑306、CCNWDCBXLAMB‑316的基因组DNA，用细菌通用引物27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’‑TACCTTGTTACGACTT)扩增其16S rDNA，经电泳检测后送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，序列在NCBI数据库中进行比对。如图2所示，菌株CCNWHYBXL‑13在分类上归属于Stenotrophomonas，与Stenotrophomonas maltophilia相似度为99.78％，菌株CCNWDCBXLAMB‑100在分类上归属于Agrobacterium，与Agrobacterium相似度为100.00％，菌株CCNWDCBXLAMB‑306在分类上归属于Ochrobactrum，与Ochrobactrumpecoris相似度为98.73％，菌株CCNWDCBXLAMB‑316在分类上归属于Advenella，与Advenella kashmirensis相似度为99.86％。

[0063] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

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