一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用转让专利
申请号 : CN202111257415.3
文献号 : CN113913381B
文献日 : 2022-10-04
发明人 : 魏伟 , 嵐山芮 , 张宗明
申请人 : 广州市天河诺亚生物工程有限公司
摘要 :
本发明提供了一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用，所述方法包括：将血液与生理盐水混合，加入分离液，离心分离；吸取白膜层细胞悬液，洗涤后离心；收集沉淀，进行冻存；复苏冻存后的细胞，培养，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞。所述造血干细胞分离纯化的方法操作简单，生产效率高而成本较低；制备得到的造血干细胞活性好，纯度高，增殖能力强，具有实际应用的价值。
权利要求 :
1.一种造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述方法包括：将血液与生理盐水混合，加入分离液，离心分离；
吸取白膜层细胞悬液，洗涤后离心；
收集沉淀，进行冻存；
复苏冻存后的细胞，培养，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞；
所述培养使用的培养基为RPMI1640培养基，所述培养在含二氧化碳的条件下进行，所述培养的时间为18 24 h；
~
所述冻存的步骤包括：
向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制进行降温，再进行冻存；
所述冻存保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷的组合物，所述二甲基亚砜和低分子右旋糖苷的体积比为1:(0.8 2)；
~
所述方法还包括对所述造血干细胞进行扩增培养的步骤；
所述扩增培养的步骤包括：向扩增培养基中接种造血干细胞，每间隔2 4天补充扩增培~养基，培养8 12天，使用生理盐水洗涤2 3次，收集细胞；
~ ~
所述扩增培养基包括：体积分数为13% 18%的脐血浆、质量分数为0.02% 0.05%的低分~ ~子肝素钙、15 25 ng/mL IL‑6、15 25 ng/mL IL‑3、45 55 ng/mL SCF、45 55 ng/mL Flt‑3L~ ~ ~ ~和15 25 ng/mL TPO；
~
所述血液与生理盐水的体积比为1:(1 3)；
~
所述分离液包括Ficoll淋巴细胞分离液；
所述离心分离的时间为20 30 min，所述离心分离的离心力为450 550 g，所述离心分~ ~离的温度为18 25℃；
~
所述离心分离的离心加速度为5 10，离心减速度为1 3；
~ ~
所述洗涤包括一次洗涤和二次洗涤；
所述一次洗涤使用的洗涤液为生理盐水，所述白膜层细胞悬液与生理盐水的体积比为
1:(2 5)；
~
所述一次洗涤后所述离心的离心力为550 650 g，所述离心的时间为8 12 min；
~ ~
所述二次洗涤使用的洗涤液为含人血清白蛋白的PBS溶液，所述人血清白蛋白的浓度为0.8% 1.5%；
~
所述二次洗涤后所述离心的离心力为150 250 g，所述离心的时间为8 12 min。
~ ~
2.根据权利要求1所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述二甲基亚砜和低分子右旋糖苷的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述复苏的温度为
36.5 37.5℃。
~
4.根据权利要求1所述的造血干细胞分离纯化的方法，其特征在于，所述接种的密度为4
(3 8)×10个/mL。
~
5.权利要求1 4任一项所述的造血干细胞分离纯化的方法在制备造血干细胞中的应~用。
说明书 :
一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于干细胞制备技术领域，尤其涉及一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用。
背景技术
[0002] 脐血也叫脐带血，是指胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。近十几年的研究发现，脐血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。
[0003] 脐血已成为造血干细胞的重要来源。世界范围内，脐血目前已经用于治疗各种类型的白血病、再生障碍性贫血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、粘多糖病、地中海贫血、骨髓发育不良症候群、原发性免疫缺陷病、慢性肉芽肿等80多种疾病。
[0004] 脐带血造血干细胞具有以下优点：采集方法简单，来源充足；对母亲和新生儿无任何不良影响；比骨髓和外周血来源的造血干细胞更原始，细胞增殖速度更快；被病毒如巨细胞病毒、艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒等感染的风险较低；移植后引起抗宿主病(GVHD)的风险较低；脐血移植相对于骨髓移植而言，对HLA配型要求相对更低，缩短了供体寻找的时间；移植费用降低，移植成功率更高。
[0005] 目前，国内外已有一些关于脐带血中有核细胞的分离方法，常见的有：密度梯度离心法、甲基纤维素法、3％明胶法、6％羟乙基淀粉法、NH4Cl溶解法以及试剂盒提取法等。国内外学者的研究发现，3％明胶沉降法和6％羟乙基淀粉沉降法的分离效果比较好，CD34+细胞(造血干细胞表面标志分子)和有核细胞回收率高；其次是试剂盒提取法和NH4Cl溶解法。
[0006] 刘斌等人(刘斌等，三种不同方法分离脐血造血细胞的比较，中华血液学杂志，1999，20(5)，271.)的研究发现，使用羟乙基淀粉和明胶沉降分离后，CD34+细胞和CFCs(集落形成细胞)的损失率均很小，满足了建立脐血库的要求。脐血库主要保存的是脐血单个核细胞，目前从脐血中分离纯化CD34+造血干细胞主要的方法是通过免疫磁珠法(MiniMACS)进行分离纯化，得到高纯度的CD34+造血干细胞。但这种方法分离纯化CD34+造血干细胞的成本高，很难大规模应用。
[0007] 因此，如何提供一种操作简单、生产成本低、纯度较高的造血干细胞的分离纯化的方法，已成为亟待解决的问题。
发明内容
[0008] 针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种造血干细胞分离纯化的方法及其应用，本发明先使用分离液进行单个核细胞的分离，再通过冻存及复苏，进一步去除粒细胞和红细胞等成熟细胞，制备得到的造血干细胞纯度更高，操作简单，具有广阔的应用前景。
[0009] 为达此目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 第一方面，本发明提供了一种造血干细胞分离纯化的方法，所述方法包括：
[0011] 将血液与生理盐水混合，加入分离液，离心分离；
[0012] 吸取白膜层细胞悬液，洗涤后离心；
[0013] 收集沉淀，进行冻存；
[0014] 复苏冻存后的细胞，培养，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞。
[0015] 本发明中，首先使用淋巴细胞分离液进行单个核细胞的分离，去除大量红细胞和粒细胞。随后进行冷冻保存，进一步去除粒细胞和红细胞等成熟细胞。复苏后的单个核细胞使用不添加生长因子和血清的培养基进行短暂培养，成熟细胞不容易存活，从而去除贴壁的单核类细胞、所有贴壁细胞和淋巴细胞，最终留下高纯度的造血干细胞。这种方法无需使用免疫磁珠、流式细胞仪、分选抗体等昂贵的试剂和仪器，分离纯化成本低，且得到的造血干细胞纯度很高，操作简单，便于大规模的生产和储存，具有广阔的应用前景。
[0016] 优选地，所述血液与生理盐水的体积比为1:(1～3)，例如可以是1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0017] 优选地，所述分离液包括Ficoll淋巴细胞分离液。
[0018] 优选地，所述离心分离的时间为20～30min，例如可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min等，所述离心分离的离心力为450～550g，例如可以是450g、460g、470g、480g、490g、500g、510g、520g、530g、540g或550g等，所述离心分离的温度为18～25℃，例如可以是18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0019] 优选地，所述离心分离的离心加速度为5～10，例如可以是5、6、7、8、9或10等，离心减速度为1～3，例如可以是1、2或3等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0020] 优选地，所述洗涤包括一次洗涤和二次洗涤。
[0021] 优选地，所述一次洗涤使用的洗涤液为生理盐水，所述白膜层细胞悬液与生理盐水的体积比为1:(2～5)，例如可以是1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0022] 优选地，所述一次洗涤后所述离心的离心力为550～650g，例如可以是550g、560g、570g、580g、590g、600g、610g、620g、630g、640g或650g等，所述离心的时间为8～12min，例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0023] 优选地，所述二次洗涤使用的洗涤液为含人血清白蛋白的PBS溶液，所述人血清白蛋白的浓度为0.8％～1.5％，例如可以是0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1％。
[0024] 优选地，所述二次洗涤后所述离心的离心力为150～250g，例如可以是150g、160g、170g、180g、190g、200g、210g、220g、230g、240g或250g等，所述离心的时间为8～12min，例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0025] 优选地，所述冻存的步骤包括：
[0026] 向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制进行降温，再进行冻存。
[0027] 本发明中，造血干细胞生命力更顽强，抵抗外界环境变化更有优势，通过先冻存再进行复苏，成熟细胞因无法抵御环境的变化而死亡，进一步去除了粒细胞和红细胞等成熟细胞，而造血干细胞不会发生损失。
[0028] 优选地，所述冻存保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷的组合物，所述二甲基亚砜和低分子右旋糖苷的体积比为1:(0.8～2)，例如可以是1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1:1。
[0029] 优选地，所述复苏的温度为36.5～37.5℃，例如可以是36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃或37.5℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0030] 优选地，所述培养使用的培养基包括RPMI1640培养基，所述培养在含二氧化碳的条件下进行，所述培养的时间为18～24h，例如可以是18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0031] 本发明中，使用不含血清和细胞因子的RPMI1640培养基进行培养，去除了贴壁的单核类细胞及所有贴壁细胞，同时根据成熟的淋巴细胞在体外容易受到外界恶劣条件的影响，细胞不容易存活，淋巴细胞也被去除，最终仅保留高纯度的造血干细胞。
[0032] 优选地，所述方法还包括对所述造血干细胞进行扩增培养的步骤。
[0033] 本发明中，在扩增培养的过程中，可以进一步去除残留的无增殖能力的成熟细胞，进一步提高造血干细胞的纯度。
[0034] 优选地，所述扩增培养的步骤包括：
[0035] 向扩增培养基中接种造血干细胞，每间隔2～4天补充扩增培养基，培养8～12天，使用生理盐水洗涤2～3次，收集细胞，间隔时间例如可以是2天、2.5天、3天、3.5天或4天等，培养时间例如可以是8天、8.5天、9天、9.5天、10天、10.5天、11天、11.5天或12天等，洗涤次数例如可以是2次或3次，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0036] 优选地，所述接种的密度为(3～8)×104个/mL，例如可以是3×104个/mL、3.5×1044 4 4 4 4 4
个/mL、4×10个/mL、4.5×10 个/mL、5×10个/mL、5.5×10 个/mL、6×10个/mL、6.5×10
4 4 4
个/mL、7×10个/mL、7.5×10个/mL或8×10个/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
个/mL、4×10个/mL、4.5×10 个/mL、5×10个/mL、5.5×10 个/mL、6×10个/mL、6.5×10
4 4 4
个/mL、7×10个/mL、7.5×10个/mL或8×10个/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0037] 优选地，所述脐血浆在所述扩增培养基中的体积分数为13％～18％，例如可以是13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％或18％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0038] 优选地，所述低分子肝素钙在所述扩增培养基中的质量分数为0.02％～0.05％，例如可以是0.02％、0.03％、0.04％或0.05％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0039] 优选地，所述IL‑6在所述扩增培养基中的浓度为15～25ng/mL，例如可以是15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0040] 优选地，所述IL‑3在所述扩增培养基中的浓度为15～25ng/mL，例如可以是15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0041] 优选地，所述SCF在所述扩增培养基中的浓度为45～55ng/mL，例如可以是45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL或55ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0042] 优选地，所述Flt‑3L在所述扩增培养基中的浓度为45～55ng/mL，例如可以是45ng/mL、46ng/mL、47ng/mL、48ng/mL、49ng/mL、50ng/mL、51ng/mL、52ng/mL、53ng/mL、54ng/mL或55ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0043] 优选地，所述TPO在所述扩增培养基中的浓度为15～25ng/mL，例如可以是15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
[0044] 作为优选技术方案，本发明所述扩增培养基包括：体积分数为13％～18％的脐血浆、质量分数为0.02％～0.05％的低分子肝素钙、15～25ng/mL IL‑6、15～25ng/mL IL‑3、45～55ng/mL SCF、45～55ng/mL Flt‑3L和15～25ng/mL TPO。
[0045] 作为优选技术方案，本发明所述造血干细胞分离纯化的方法，包括以下步骤：
[0046] (1)离心分离：
[0047] 将血液与生理盐水按体积比为1:(1～3)混合，加入Ficoll淋巴细胞分离液，在18～25℃下，以450～550g、离心加速度为5～10、离心减速度为1～3的条件离心分离20～30min；
[0048] (2)收集白膜层细胞：
[0049] 吸取白膜层细胞悬液，与生理盐水按体积比为1:(2～5)混合，一次洗涤后，在550～650g下离心8～12min；收集细胞，使用含浓度为0.8％～1.5％人血清白蛋白的PBS溶液二次洗涤后，以150～250g离心8～12min；
[0050] (3)冻存细胞：
[0051] 收集沉淀，向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制进行降温，再进行冻存；
[0052] 所述冻干保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷按体积比1:(0.8～2)为组成的组合物；
[0053] (4)纯化：
[0054] 在36.5～37.5℃下复苏冻存后的细胞，使用RPMI1640培养基在含二氧化碳的条件下培养18～24h，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞；
[0055] (5)扩增培养：
[0056] 向扩增培养基中按密度为(3～8)×104个/mL接种造血干细胞，每间隔2～4天补充扩增培养基，培养8～12天，使用生理盐水洗涤2～3次，收集细胞；
[0057] 所述扩增培养基包括：体积分数为13％～18％的脐血浆、质量分数为0.02％～0.05％的低分子肝素钙、15～25ng/mL IL‑6、15～25ng/mL IL‑3、45～55ng/mL SCF、45～
55ng/mL Flt‑3L和15～25ng/mL TPO。
55ng/mL Flt‑3L和15～25ng/mL TPO。
[0058] 第二方面，本发明提供了第一方面所述的造血干细胞分离纯化的方法在制备造血干细胞中的应用。
[0059] 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0060] 本发明首先通过离心去除红细胞和粒细胞，获取白膜层单个核细胞，再通过冻存以及复苏，去除贴壁细胞以及成熟的淋巴细胞，最终获得纯度极高的造血干细胞；制备得到的造血干细胞具有良好的增殖分裂能力以及集落形成能力，集落形成数目均不低于108个/3
10细胞，活性好，质量高，造血干细胞纯度在86.8％以上，CD34阳性表达率不低于91.62％，具有极高的应用价值；所述分离纯化的方法无需磁珠分选或流式分选，避免使用磁珠、分选抗体等昂贵的试剂，也无需专业的分选仪器，制备成本低，操作简单，生产效率高，为工厂化的大规模生产创造了条件，具有极高的应用价值。
10细胞，活性好，质量高，造血干细胞纯度在86.8％以上，CD34阳性表达率不低于91.62％，具有极高的应用价值；所述分离纯化的方法无需磁珠分选或流式分选，避免使用磁珠、分选抗体等昂贵的试剂，也无需专业的分选仪器，制备成本低，操作简单，生产效率高，为工厂化的大规模生产创造了条件，具有极高的应用价值。
附图说明
[0061] 图1为本发明实施例1中制备的造血干细胞的集落形成能力验证结果图片(放大倍数为40×)；
[0062] 图2为本发明实施例1中制备的造血干细胞的形态图片(放大倍数为100×)；
[0063] 图3为本发明实施例1中制备的造血干细胞的流式分析结果图片。
具体实施方式
[0064] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
[0065] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0066] 材料：
[0067] 脐血来自医院足月妊振健康产妇，产前检查乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒、G‑6PD和地贫等均为阴性。产妇及家属对脐带血用于实验研究均知情同意。采集的脐带血于4℃冰箱贮存，4小时内处理。
[0068] 脐血浆来自脐血库自制血浆，在采血袋中先加入抗凝剂再加入脐血，使抗凝剂与脐血液的体积比为1:9，颠倒混匀，3000rpm离心10min，所得的上清液即为血浆。
[0069] Ficoll淋巴细胞分离液购自GE公司。
[0070] 人血清白蛋白、二甲基亚砜、低分子右旋糖苷和低分子肝素钙购自Sigma公司。
[0071] RPMI1640培养基和基础培养基IMDM购自美国HYCLONE公司。
[0072] IL‑6、IL‑3、SCF、Flt‑3L和TPO购自美国PeproTech公司。
[0073] 甲基纤维素半固体培养基H4534购自Stem cell公司。
[0074] IgG‑FITC抗体、IgG‑PE抗体、CD45‑FITC抗体和CD34‑PE抗体购自BD公司。
[0075] 实施例1
[0076] 本实施例提供一种造血干细胞，所述造血干细胞通过以下方法进行制备：
[0077] (1)离心分离：
[0078] 将采集4h内的脐血与生理盐水按体积比为1:2混合，加入Ficoll淋巴细胞分离液，在20℃下，以500g、离心加速度为7、离心减速度为2的条件离心分离25min；
[0079] (2)收集白膜层细胞：
[0080] 在血浆层与分离液层之间吸取白膜层细胞悬液，与生理盐水按体积比为1:3混合，一次洗涤后，在600g下离心10min；收集细胞，使用含浓度为1％人血清白蛋白的PBS溶液二次洗涤后，以200g离心10min；
[0081] (3)冻存细胞：
[0082] 收集沉淀，向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制(4℃，10min，20℃，30min；80℃，16h，再转移至液氮长期保存)进行降温，再进行冻存；
[0083] 所述冻干保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷按体积比为1:1组成的组合物；
[0084] (4)纯化：
[0085] 在37℃下复苏冻存后的细胞，转移到T75细胞培养瓶中，使用RPMI1640培养基在含5％二氧化碳、温度37℃的条件下孵育18h，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞；
[0086] (5)扩增培养：
[0087] 向装有扩增培养基的T75细胞培养瓶中按密度为5×104个/mL接种造血干细胞，每间隔3天补充扩增培养基，培养10天，使用生理盐水洗涤2次，离心收集细胞；
[0088] 所述扩增培养基为：体积分数为15％的脐血浆、质量分数为0.04％的低分子肝素钙、20ng/mL IL‑6、20ng/mL IL‑3、50ng/mL SCF、50ng/mL Flt‑3L和20ng/mL TPO，余量为基础培养基IMDM。
[0089] 实施例2
[0090] 本实施例提供一种造血干细胞，所述造血干细胞通过以下方法进行制备：
[0091] (1)离心分离：
[0092] 将采集4h内的脐血与生理盐水按体积比为1:1混合，加入Ficoll淋巴细胞分离液，在25℃下，以450g、离心加速度为5、离心减速度为1的条件离心分离30min；
[0093] (2)收集白膜层细胞：
[0094] 在血浆层与分离液层之间吸取白膜层细胞悬液，与生理盐水按体积比为1:2混合，一次洗涤后，在550g下离心12min；收集细胞，使用含浓度为0.8％人血清白蛋白的PBS溶液二次洗涤后，以150g离心12min；
[0095] (3)冻存细胞：
[0096] 收集沉淀，向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制(4℃，10min，20℃，30min；80℃，16h，再转移至液氮长期保存)进行降温，再进行冻存；
[0097] 所述冻干保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷按体积比为1:0.8组成的组合物；
[0098] (4)纯化：
[0099] 在36.5℃下复苏冻存后的细胞，转移到T75细胞培养瓶中，使用RPMI1640培养基在含5％二氧化碳、温度37℃的条件下孵育19h，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞；
[0100] (5)扩增培养：
[0101] 向装有扩增培养基的T75细胞培养瓶中按密度为8×104个/mL接种造血干细胞，每间隔2天补充扩增培养基，培养12天，使用生理盐水洗涤3次，离心收集细胞；
[0102] 所述扩增培养基为：体积分数为18％的脐血浆、质量分数为0.05％的低分子肝素钙、25ng/mL IL‑6、25ng/mL IL‑3、45ng/mL SCF、45ng/mL Flt‑3L和15ng/mL TPO，余量为基础培养基IMDM。
[0103] 实施例3
[0104] 本实施例提供一种造血干细胞，所述造血干细胞通过以下方法进行制备：
[0105] (1)离心分离：
[0106] 将采集4h内的脐血与生理盐水按体积比为1:3混合，加入Ficoll淋巴细胞分离液，在18℃下，以550g、离心加速度为10、离心减速度为3的条件离心分离20min；
[0107] (2)收集白膜层细胞：
[0108] 在血浆层与分离液层之间吸取白膜层细胞悬液，与生理盐水按体积比为1:5混合，一次洗涤后，在650g下离心8min；收集细胞，使用含浓度为1.5％人血清白蛋白的PBS溶液二次洗涤后，以250g离心8min；
[0109] (3)冻存细胞：
[0110] 收集沉淀，向沉淀中加入冻存保护剂，通过程序控制(4℃，10min，20℃，30min；80℃，16h，再转移至液氮长期保存)进行降温，再进行冻存；
[0111] 所述冻干保护剂为二甲基亚砜和低分子右旋糖苷按体积比为1:2组成的组合物；
[0112] (4)纯化：
[0113] 在37.5℃下复苏冻存后的细胞，转移到T75细胞培养瓶中，使用RPMI1640培养基在含5％二氧化碳、温度37℃的条件下孵育24h，去除贴壁细胞，保留悬浮细胞，得到所述造血干细胞；
[0114] (5)扩增培养：
[0115] 向装有扩增培养基的T75细胞培养瓶中按密度为3×104个/mL接种造血干细胞，每间隔4天补充扩增培养基，培养8天，使用生理盐水洗涤2次，离心收集细胞；
[0116] 所述扩增培养基为：体积分数为13％的脐血浆、质量分数为0.02％的低分子肝素钙、15ng/mL IL‑6、15ng/mL IL‑3、55ng/mL SCF、55ng/mL Flt‑3L和25ng/mL TPO，余量为基础培养基IMDM。
[0117] 实施例4
[0118] 本实施例提供一种造血干细胞，其在制备过程的步骤(4)中，使用含15％的脐血浆的RPMI1640培养基进行培养，其余步骤及参数与实施例1相同。
[0119] 对比例1
[0120] 本对比例提供一种造血干细胞，其在制备过程中不进行步骤(3)中的冻存以及步骤(4)中的复苏，二次洗涤后直接使用RPMI1640培养基进行培养，其余步骤及参数与实施例1相同。
[0121] 对比例2
[0122] 本对比例提供一种造血干细胞，其在步骤(4)中的复苏后直接进行扩增培养，不进行使用RPMI1640培养基在含二氧化碳的条件下培养18h并去除贴壁细胞的步骤，其余步骤及参数与实施例1相同。
[0123] 测试例1纯度测试
[0124] 离心收集扩增培养后的细胞，生理盐水离心洗涤2次，进行流式分析。同型对照管中加入鼠IgG‑FITC和IgG‑PE各5μL，检测管分别加入鼠抗人CD45‑FITC和CD34‑PE各5μL，室温避光孵育30min，流式细胞仪检测。
[0125] 测试例2集落形成能力测试
[0126] 将扩增培养后的细胞接种在甲基纤维素半固体培养基H4534中，检测造血干细胞分裂后形成的粒细胞‑巨噬细胞集落(CFU‑GM)数目。检测于6孔板中进行，培养10d后，显微镜下观察，并计算集落数。
[0127] 实施例1～4以及对比例1～2的纯度测试和集落形成能力测试结果如表1所示。
[0128] 表1
[0129]
[0130]
[0131] 由表1可知，实施例1～3制备得到的造血干细胞具有良好的纯度及增殖能力，纯度3
在86.8％以上，集落形成能力不少于108个/10细胞，细胞活性好，质量高，用于广泛；
在86.8％以上，集落形成能力不少于108个/10细胞，细胞活性好，质量高，用于广泛；
[0132] 更换培养条件后，造血干细胞的纯度和集落形成能力下降，造血干细胞状态受到影响。实施例4中使用含血清的培养基进行培养，对造血干细胞的纯度影响极大，集落形成能力也受到了一定的影响；对比例1中未进行冻存和复苏，对比例2中未去除贴壁细胞，细胞纯度及增殖能力均受到了一定的影响，尤其纯度受到的影响很大。
[0133] 此外，实施例1中的造血干细胞集落形成能力验证结果如图1所示，由图可以看出，倒置显微镜下观察培养至第10天的造血干/祖细胞，细胞数量多，呈分散状态，细胞体积大而圆，包体透亮，细胞胞质丰富，表明按照实施例1分离纯化造血干细胞的方法可行。
[0134] 测试例3形态学分析及细胞计数
[0135] 将扩增培养后的细胞置于倒置显微镜下观察并拍照，观察细胞的形态及生理状态。
[0136] 取微量细胞悬液，使用血球计数板计数细胞数量。
[0137] 测试例4细胞表型检测
[0138] 离心收集扩增培养后的细胞，生理盐水离心洗涤2次，进行流式分析。同型对照管中加入鼠IgG‑FITC和IgG‑PE各5μL，检测管分别加入鼠抗人CD45‑FITC和CD34‑PE各5μL，室温避光孵育30min，流式细胞仪检测。
[0139] 实施例1中制备的造血干细胞的形态图片如图2所示，流式分析结果如图3所示。
[0140] 由图2可以看出，扩增培养后的细胞呈分散状态，数量多，细胞体积大而圆，包体透亮，细胞胞质丰富，证明细胞的生理状态良好。计数后可知，造血干细胞数量达到(1～5)×7
10个，细胞增殖能力很强。
10个，细胞增殖能力很强。
[0141] 由图3可知，细胞表面抗原CD34阳性表达率达到了91.62％，证明造血干细胞的纯3
度很高。经CFU‑GM集落计数，细胞集落数达到112个/10细胞。综上，根据本发明实施例1中的方法制备得到的造血干细胞活性好，纯度高，符合相关的要求，具有广阔的应用前景。
度很高。经CFU‑GM集落计数，细胞集落数达到112个/10细胞。综上，根据本发明实施例1中的方法制备得到的造血干细胞活性好，纯度高，符合相关的要求，具有广阔的应用前景。
[0142] 实施例2～3的检测结果与实施例1类似，此处不再赘述。
[0143] 测试例5
[0144] 本测试例验证步骤(4)中使用RPMI1640培养基在含二氧化碳的条件下培养的时间对制备得到的造血干细胞的纯度及集落形成能力的影响，步骤如下：
[0145] 采用实施例1中的制备方法，在步骤(4)中分别设置培养1h、2h、3h、4h、5h、6h、12h和24h的组别，测试不同组别的造血干细胞的纯度及集落形成能力。
[0146] 纯度测试及集落形成能力测试的结果如表2所示。
[0147] 表2
[0148]
[0149]
[0150] 由表2可以看出，培养时间对造血干细胞的纯度影响较大，随着培养时间的延长，造血干细胞的纯度逐渐升高，培养24h后，纯度可达90.8％以上；而培养时间对造血干细胞3
的集落形成能力无明显影响，培养时间在1～24h内，集落形成数目均不低于106个/10 细胞。
的集落形成能力无明显影响，培养时间在1～24h内，集落形成数目均不低于106个/10 细胞。
[0151] 综上所述，本发明所述的造血干细胞分离纯化的方法操作简单，生产效率高而成本较低，具有实际应用的价值；制备得到的造血干细胞具有良好的生理状态、增殖能力以及集落形成的能力，纯度高，活性好，可应用于相关疾病的治疗中，使用方便，风险较低。
[0152] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。