食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的荧光探针检测方法

摘要

本发明公开了一种食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的荧光探针检测方法，本发明采用热解法制备了双金属原子催化剂Cu,Fe‑N‑C纳米酶，Cu,Fe‑N‑C表现出拟过氧化酶活性，在双氧水存在下，Cu,Fe‑N‑C氧化邻苯二胺（OPD）生成具有荧光的2,3‑二氨基吩嗪(DAP)产物，邻苯二甲酸酯类物质（PAEs）能够抑制Cu,Fe‑N‑C拟过氧化酶活性，PAEs浓度变化与荧光强度的降低呈线性关系，由此建立邻苯二甲酸酯类物质荧光检测新方法，方法定量限达0.5μg/kg；该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。

权利要求

1.一种食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的荧光探针检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）邻苯二甲酸二甲酯工作曲线制作

在10mL具塞比色管中加入0.1mg/mL Cu,Fe‑N‑C纳米酶50‑100µL、5mmol/L的邻苯二胺

0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、邻苯二甲酸二甲酯标准溶液，用pH7.0的磷酸‑磷酸盐缓冲溶液稀释至5mL，其中邻苯二甲酸二甲酯在具塞比色管中的浓度范围在0.5 45μg/kg，摇匀，静~置5 10min，在360nm激发波长下，在560nm发射波长处测定荧光强度，以邻苯二甲酸二甲酯~浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；

（2）样品处理

 固体样品：将固体样品粉碎或匀浆处理，从处理后的试样中称取10.00g样品，置于具塞锥形瓶中，加入10 15mL丙酮、15 20mL无水乙醇，超声或振摇15 30min，过滤，滤液转移~ ~ ~至50mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，制得样品测定液；

②食用油样品：取食用油5 10mL于洁净分液漏斗中，加入1 2mL无水乙醇和1 2mL乙腈，~ ~ ~振摇，静置分层，取出上层清液，萃取2 3次，合并上层清液，转移至25mL容量瓶中，用纯净水~稀释至刻度，制得样品测定液；

水溶性样品直接用纯净水稀释定容；

（3）样品测定：在10mL具塞比色管中加入0.1mg/mL Cu,Fe‑N‑C纳米酶50‑100µL、5mmol/L的邻苯二胺0.2mL，20mmol/L的H2O2 0.2mL，加入步骤（2）制备样品测定液，用pH7.0的磷酸‑磷酸盐缓冲溶液稀释至5mL，摇匀，静置5 10min，在560nm发射波长处测定荧光强度，代入步~骤（1）回归方程，计算样品邻苯二甲酸酯类塑化剂含量；

所述Cu,Fe‑N‑C纳米酶是将10~15mL含有2~3g CuCl2的甲醇溶液与20~30mL含有4~6g中‑四（4‑羧基苯基）卟吩、2~3g FeCl3的甲醇溶液混匀后，在75~85℃下干燥老化2~3h，得到墨绿色干燥粉末，干燥粉末在700~800℃ 、N2保护下煅烧2h制得。

2.根据权利要求1所述的食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的荧光探针检测方法，其特征在于：邻苯二甲酸酯类塑化剂包括邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二辛酯、邻苯二甲酸二壬酯。

说明书

食品中邻苯二甲酸酯类塑化剂的荧光探针检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种食品中邻苯二甲酸酯荧光探针检测方法。

背景技术

[0002] 塑化剂是一种被广泛应用于塑料制品的用于增强柔韧性的材料助剂。商品化的塑化剂多达 100 余种，其中邻苯二甲酸酯类塑化剂(phthalic acid esters, PAEs)最为常见，超过塑化剂总量的 80%。研究证明PAEs是一种环境激素类物质，PAEs与塑料制品中的聚合物是以不稳定的非共价键形式结合的，因此很容易由塑料制品中迁移出来，造成环境，特别是食品的污染。目前，食品中PAEs的测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱‑质谱联用法、荧光法、电化学检测法等。

[0003] 纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米酶作为一类新型的模拟酶，它具有许多其他传统模拟酶所无法企及的优点，人们可以根据纳米材料模拟酶的特性进行研究并加以利用，让纳米酶具有更大的应用前景。设计具有高类酶活性的单原子纳米酶，极大提升了纳米酶的单位活性，成为当前研究的热点，而具有双活性中心的纳米酶，无论在酶活及选择性提高方面都显示出极大优势。

发明内容

[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种食品中邻苯二甲酸酯荧光探针检测方法，本发明采用热解法制备了双金属原子催化剂Cu,Fe‑N‑C纳米酶，Cu,Fe‑N‑C表现出极高的拟过氧化酶（POD）活性，邻苯二甲酸酯类物质（PAEs）能够抑制Cu,Fe‑N‑C拟过氧化酶活性。在双氧水存在下，Cu,Fe‑N‑C纳米酶氧化邻苯二胺（OPD）生成具有荧光的2,3‑二氨基吩嗪(DAP) 产物，PAEs浓度变化与酶抑制反应呈线性关系；由此建立PAEs荧光检测新方法，本发明方法定量限达0.5μg/kg；该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。

[0005] 本发明食品中邻苯二甲酸酯荧光探针检测方法，包括以下步骤：

[0006] （1）邻苯二甲酸二甲酯（DMP）工作曲线制作

[0007] 在10mL具塞比色管中加入0.1mg/mL Cu,Fe‑N‑C纳米酶50‑100µL、5mmol/L的邻苯二胺（OPD）0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、邻苯二甲酸二甲酯标准溶液，用pH7.0的磷酸‑磷酸盐缓冲溶液稀释至5mL，其中邻苯二甲酸二甲酯在具塞比色管中的浓度范围在0.5 45μg/~kg，摇匀，静置5 10min，在360nm激发波长下，在560nm发射波长处测定荧光强度，以邻苯二~
甲酸二甲酯浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；

[0008] （2）样品处理

[0009]  固体样品（食品包装塑料袋、蔬菜等）：将固体样品粉碎或匀浆处理，从处理后的试样中称取10.00g样品，置于具塞锥形瓶中，加入10 15mL丙酮、15 20mL无水乙醇，超声~ ~或振摇15 30min，过滤，滤液转移至50mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，制得样品测定液；
~

[0010] ②食用油样品：取待测液体5 10mL于洁净分液漏斗中，加入1 2mL无水乙醇和1~ ~ ~2mL乙腈，振摇，静置分层，取出上清液，萃取2 3次，合并上清液，转移至25mL容量瓶中，用纯~
净水稀释至刻度，制得样品测定液；

[0011] （3）样品测定：在10mL具塞比色管中加入浓度为0.1mg/mL的Cu,Fe‑N‑C纳米酶50‑100µL、5mmol/L的邻苯二胺0.2mL，20mmol/L的H2O2 0.2mL，加入步骤（2）制备样品测定液，用pH7.0的磷酸‑磷酸盐缓冲溶液稀释至5mL，摇匀，静置5 10min，在560nm发射波长处测定荧~
光强度，代入步骤（1）回归方程，计算样品邻苯二甲酸酯类塑化剂含量。

[0012] 所述Cu,Fe‑N‑C纳米酶是将10~15mL含有2~3g CuCl2的甲醇溶液与20~30mL含有4~6g中‑四（4‑羧基苯基）卟吩、2~3g FeCl3的甲醇溶液混匀后，在75~85℃下干燥老化2~3h，得到墨绿色干燥粉末，干燥粉末在700~800℃ 、N2保护下煅烧2h制得。

[0013] 所述邻苯二甲酸酯类塑化剂包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP) 、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯（DOP）和邻苯二甲酸二壬酯（DINP），这五种邻苯二甲酸酯对Cu,Fe‑N‑C纳米酶具有的拟过氧化酶活性，氧化OPD产生的荧光抑制效应一致，在工作曲线制作时以DMP为模型，样品测定得到的是这五种邻苯二甲酸酯类物质中的一种或多种的含量。

[0014] 本发明的优点在于：

[0015] 1、本发明制备的双金属原子催化剂Cu,Fe‑N‑C纳米酶，具有拟过氧化酶活性，邻苯二甲酸酯类物质（PAEs）能够抑制Cu,Fe‑N‑C拟过氧化酶活性，在双氧水存在下，Cu,Fe‑N‑C氧化邻苯二胺（OPD）生成具有荧光的2,3‑二氨基吩嗪(DAP)产物，PAEs浓度变化与酶抑制反应的荧光强度呈线性关系，由于建立PAEs荧光检测新方法，方法定量限达0.5μg/kg；

[0016] 2、本方法检测PAEs类物质的含量，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、快速等特点。

附图说明

[0017] 图1为实施例1中DMP对Cu,Fe‑N‑C拟氧化酶氧化OPD的抑制作用的线性关系；

[0018] 图2为实施例1中共存离子对检测体系的影响结果，空白为不添加物质；

[0019] 图3为实施例1中共存物质对检测体系的影响结果，空白为不添加物质。

具体实施方式

[0020] 下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

[0021] 实施例1：食品包装塑料袋中PAEs测定

[0022] 1、Cu,Fe‑N‑C纳米酶的制备：将10mL含有2.636g CuCl2的甲醇溶液与20mL含有5g 中‑四（4‑羧基苯基）卟吩、2.376 g FeCl3的甲醇溶液混合均匀后，在80℃烘箱中干燥老化3h；得到的墨绿色干燥粉末，称取 5g于石英舟中，然后在管式炉中750℃、N2保护下煅烧2 h得到；

[0023] 2、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）工作曲线制作：在10mL具塞比色管中加入0.1mg/mL Cu,Fe‑N‑C纳米酶100µL、5mmol/L的邻苯二胺（OPD）0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL、DMP标准溶液，用pH7.0的磷酸‑磷酸盐缓冲溶液稀释至5mL，其中DMP在具塞比色管中的浓度范围在0.5 45μg/kg，摇匀，静置8min，在360nm激发波长下，在560nm发射波长处测定荧光强度，以~
DMP浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1；

[0024] 表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围

[0025];

[0026] 3、方法特异性考察：将浓度100μg/kg的可能干扰物质替换10μg/kg的DMP，用于验+ + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+证本发明检测体系的特异性，可能干扰物质为共存离子（Na、K 、Ca 、Mg 、Cu 、Zn 、Fe 、‑ 2‑ ‑ ‑
Cl、SO4 、NO2、NO3）及物质（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乙醇）；图2、3结果显示仅有DMP有明显的猝灭作用，其它物质几乎没有猝灭作用，该方法具有好的选择特异性。

[0027] 4、食品包装塑料袋中PAEs总量的测定

[0028] （1）样品处理：将食品包装塑料袋剪碎处理，从处理后的试样中称取10.00g样品，置于具塞锥形瓶中，加入10mL丙酮、20mL无水乙醇，振摇30min，过滤，滤液转移至50mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，制得样品测定液；

[0029] （2）样品测定：在10mL具塞比色管中加入0.1mg/mL Cu,Fe‑N‑C纳米酶100µL、5mmol/L的邻苯二胺（OPD）0.2mL、20mmol/L的H2O2 0.2mL，加入步骤（1）制备样品测定液，用pH7.0的磷酸‑磷酸盐缓冲溶液稀释至5mL，摇匀，静置10min，在560nm发射波长处测定荧光强度，代入步骤2回归方程，计算样品邻苯二甲酸酯含量为45.0μg/kg；

[0030] （3）回收率与精密度实验：在食品包装塑料袋样品中分别添加3个不同浓度的DMP标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表2；测得DMP的加标回收率在97.2％～102.4％，RSD在1.21％～2.31％，本方法有好的的准确性和精密度；

[0031] 表2 样品加标回收率及RSD（n = 3）

[0032] 。

[0033] 实施例2：塑料袋包装的腌黄瓜样品中PAEs的测定

[0034] 1、Cu,Fe‑N‑C纳米酶的制备：Cu,Fe‑N‑C纳米酶是将15mL含有2g CuCl2的甲醇溶液与30mL含有4g中‑四（4‑羧基苯基）卟吩、3g FeCl3的甲醇溶液混匀后，在85℃下干燥老化2h，得到墨绿色干燥粉末，干燥粉末在800℃ 、N2保护下煅烧2h制得；

[0035] 2、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）工作曲线制作：同实施例1；

[0036] 3、塑料袋包装的腌黄瓜样品中PAEs的测定

[0037] （1）样品处理：将腌黄瓜匀浆处理，从处理后的试样中称取10.00g样品，置于具塞锥形瓶中，加入12mL丙酮、20mL无水乙醇，超声25min，过滤，滤液转移至50mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，制得样品测定液；

[0038] （2）样品测定：同实施例1，邻苯二甲酸酯含量为8.2μg/kg。

[0039] 实施例3：食用油样品中PAEs测定

[0040] 1、Cu,Fe‑N‑C纳米酶的制备：Cu,Fe‑N‑C纳米酶是将10~1512mL含有2.636g CuCl2的甲醇溶液与25mL含有6g中‑四（4‑羧基苯基）卟吩、2.376g FeCl3的甲醇溶液混匀后，在75℃下干燥老化3h，得到墨绿色干燥粉末，干燥粉末在700℃ 、N2保护下煅烧2h制得；

[0041] 2、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）工作曲线制作：同实施例1；

[0042] 3、食用油中PAEs的测定

[0043] （1）样品处理：取食用油10mL于洁净分液漏斗中，加入2mL无水乙醇和2mL乙腈，振摇，静置分层，取出上层清液，萃取两次，合并上层清液，转移至25mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，制得样品测定液；

[0044] （2）样品测定：同实施例1，邻苯二甲酸酯含量为14.1μg/kg。

[0045] 实施例4：玻璃瓶装的白酒样品PAEs的测定

[0046] 1、Cu,Fe‑N‑C纳米酶的制备：同实施例1；

[0047] 2、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）工作曲线制作：同实施例1；

[0048] 3、玻璃瓶装的白酒样品中PAEs测定

[0049] （1）样品处理：取白酒样品10mL于洁净25mL容量瓶中，用纯净水稀释至刻度，制得样品测定液；

[0050] （2）样品测定：同实施例1，邻苯二甲酸酯含量为38.0μg/kg；

[0051] 将实施例1‑4方法与国家标准GB 5009.271‑2016 食品安全国家标准食品中邻苯二甲酸酯的测定方法进行比对，结果见表3，从结果可以看出，两种方法结果一致。

[0052] 表3 对比实验结果（μg/kg）

[0053]

[0054] 本发明建立的组胺测定法具有处理步骤少，所用时间短，处理成本低，操作简便，不需要大型仪器设备，在实际检测中具有较强优势。