一种双特异性抗体的稳定制剂转让专利
申请号 : CN202111566377.X
文献号 : CN113940997B
文献日 : 2022-04-08
发明人 : 叶烨 , 季霜仪 , 欧阳子均 , 李纲
申请人 : 迈威(上海)生物科技股份有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种水性组合物,所述组合物成分由如下构成:缓冲液:10‑20mM的柠檬酸缓冲液;
保护剂:4%(w/v)的蔗糖;
表面活性剂:0.005‑0.08%(w/v)的Tween‑80;以及50mM的NaCl,和一种双特异性抗体;
所述双特异性抗体是人源化重组抗NKG2A和PD‑L1双特异性抗体,其包括SEQ ID NO:1所示轻链可变区和SEQ ID NO:2所示重链可变区形成的抗NKG2A特异性抗原结合位点; SEQ ID NO:3所示纳米抗体结构域形成的抗PD‑L1特异性抗原结合位点;
所述水性组合物的pH为5.5‑6.5。
2.如权利要求1所述的水性组合物,其特征在于:所述缓冲液为20mM的柠檬酸缓冲液,所述水性组合物的pH为6.0‑6.5。
3.如权利要求2所述的水性组合物,其特征在于:所述水性组合物的pH为6.2。
4.如权利要求1所述的水性组合物,其特征在于:所述双特异性抗体的浓度为10‑50mg/mL。
5.如权利要求4所述的水性组合物,其特征在于:所述双特异性抗体的浓度为20mg/mL。
6.如权利要求4所述的水性组合物,其特征在于所述双特异性抗体包括提供NKG2A特异性的Fab、提供PD‑L1特异性的纳米抗体结构域;其中,所述Fab段通过其重链C端连接于抗体Fc段的N端,所述纳米抗体结构域通过其N端连接于抗体Fc端的C端。
7.人源化重组抗NKG2A和PD‑L1双特异性抗体的水针制剂,包括:双特异性抗体 10‑50mg/ml柠檬酸缓冲液 20mM
氯化钠 50mM
蔗糖 4%(w/v)
Tween‑80 0.005‑0.08%(w/v)pH 5.5‑6.5
所述双特异性抗体是人源化重组抗NKG2A和PD‑L1双特异性抗体,其包括SEQ ID NO:1所示轻链可变区和SEQ ID NO:2所示重链可变区形成的抗NKG2A特异性抗原结合位点; SEQ ID NO:3所示纳米抗体结构域形成的抗PD‑L1特异性抗原结合位点。
说明书 :
一种双特异性抗体的稳定制剂
技术领域
背景技术
制性免疫受体可能是一种可行的策略。
合物的结构域CRD(Carbohydrate‑recognitiondomain,通常由115‑130个氨基酸组成,含2‑
3个二硫键,有2‑3个N连接的糖基化位点,其配体识别的过程往往是Ca2+依赖性的)。NKG2A
主要在NK细胞、NKT细胞以及T细胞中表达;相对分子质量为43000,由233个氨基酸组成,其
胞外区有135个氨基酸。NKG2A通过与其配体HLA‑E的相互作用来抑制免疫细胞的激活。HLA‑
E广泛表达于头颈癌、肺癌、前列腺癌以及结直肠癌等多种肿瘤细胞表面,而免疫细胞释放
的IFN‑γ会进一步上调HLA‑E的表达 (J Clin Invest. 2019; 129(5): 2094‑2106)。与其
它受体‑配体(如PD‑1/PD‑L1)类似,NKG2A/HLA‑E这对免疫检查点也是肿瘤免疫逃逸的重要
信号通路,阻断NKG2A/HLA‑E之间的相互作用成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的
靶点。目前有多家公司(如Innate Pharma/Novo Nordisk/AstraZeneca 和 ChemPartner)
开发了针对NKG2A的单克隆抗体,通过阻断NKG2A/HLA‑E的相互作用来提高NK细胞以及T细
胞的免疫活性来杀伤肿瘤细胞。
2018; 175: 1‑13, Cell. 2018; 175: 1744‑1755)。同时针对多种靶点进行治疗对提高肿
瘤免疫治疗的响应率及降低免疫耐受有积极的作用。目前针对NKG2A的治疗性抗体对抗原
的亲和力不足、结合NKG2A单靶点对肿瘤的治疗效果不佳,全球范围内尚没有针对NKG2A的
上市药物。法国Paoli‑Calmettes研究院正在推进一项人源化抗NKG2A单抗IPH2201与同种
异体干细胞移植联用治疗血液恶性肿瘤的I期临床安全性实验(NCT02921685)。申请人已经
通过构建轻重链突变抗体库进行亲和力提高和/或解离常数改善的突变抗体,将突变抗体
的CDRs区构建人Fab重链基因表达载体和含人κ亚类轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达
载体中,将亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对,筛选获得抗NKG2A的突变Fab
抗体,连接人抗体Fc段。将抗PD‑L1纳米抗体通过linker连接到Fc段的C端,获得对NKG2A和
PD‑L1具有双特异性的抗体。
在生产和贮存过程中,易发生聚集、变性、沉淀等物理变化及异构化、脱酰胺和氧化等化学
变化,这些改变会影响产品的安全性及有效性,因此需要一种稳定的制剂来保证抗体用于
患者体内前仍具有治疗所需的生物活性。目前市场上尚没有专门针对双特异性抗体的稳定
制剂,大都直接使用天然抗体分子稳定制剂。虽然双特异性抗体或多或少具有一般抗体分
子的组件,然而双特异性抗体还具备以下三点与一般抗体分子不同之处:(1)双特异性抗体
是人工设计的分子,并非天然存在的分子,人工设计的因素导致双特异性抗体分子面临更
多不确定的降解、聚集、代谢影响。(2)双特异性抗体结构与天然抗体结构存在差异,这种分
子结构上的差异导致了在双特异性分子在分子量、等电点、酶切位点等理化参数上不同于
天然抗体分子。(3)双特异性抗体分子在活性和功能上不同于天然抗体分子,双特异性抗体
分子要同时维持两种特异性结合活性,必须使两种抗原结合位点都维持具有功能的结构,
特别是当两种抗原结合位点分别位于两端时,例如Fab‑Fc‑sdA(Fab段通过重链C端连接于
抗体Fc段的N端、纳米抗体通过N端连接于抗体Fc端的C端),必须维持整个分子的结构才能
具有活性。
发明内容
分。以人源化重组抗NKG2A和PD‑L1双特异性抗体为例,优化的稳定性制剂以pH5.5‑6.5的醋
酸缓冲液或柠檬酸缓冲液为缓冲体系、以4%蔗糖为稳定剂、添加0.005‑0.08%的Tween‑80。
高温试验、振摇试验、反复冻融试验、光照试验检测结果表明本发明的稳定制剂能够维持水
针剂的外观和物理状态,保持双特异性抗体分子的结构稳定和生物活性。
抗体Fc段的N端,所述纳米抗体结构域通过其N端连接于抗体Fc端的C端。
可变区形成抗NKG2A的抗原结合位点;SEQ ID NO:3所示纳米抗体结构域形成抗PD‑L1特异
性。
段的N端,所述纳米抗体结构域通过其N端连接于抗体Fc端的C端。
段的N端,所述纳米抗体结构域通过其N端连接于抗体Fc端的C端。
(1991) J. Exp. Med. 173:1017‑1020)。NKG2A由跨度25kb显示出一些差别剪接的7个外显
子编码。NKG2A与CD94一起形成发现于NK细胞、α/β T细胞、γ/δ T细胞和NKT细胞的亚组的
表面上的异二聚体抑制性受体CD94/NKG2A。与抑制性KIR受体类似,其在其胞质结构域具有
ITIM。如用于本文中,“NKG2A”指NKG2A基因或编码的蛋白的任何变体、衍生物或同种型
(isoform)。还包括与野生型全长NKG2A共享一个或多个生物学性质或功能,并共享至少
70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白序
列。人NKG2A在3个结构域中包含233个氨基酸,其中胞质结构域包含残基1‑70,跨膜区包含
残基71‑93,和胞外区包含残基94‑233。
homolog 1,B7‑H1),由CD274基因编码,是PD‑1(programmed cell death 1,程序性死亡受
体1)的配体。PD‑L1 是大小为 40kDa 的第一型跨膜蛋白,表达在T细胞、B细胞等免疫细胞
以及肿瘤细胞上,正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应,促
发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+ Tcell增生)。当肿瘤细胞膜上的PD‑L1与T细胞
等免疫细胞上的PD‑1结合后,肿瘤细胞发出抑制性信号,减低淋巴结CD8+ T细胞的增殖,进
而导致T细胞不能识别肿瘤细胞和对肿瘤细胞产生杀伤作用,机体的免疫功能受到抑制。
样本中存在的其它蛋白结合。
键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成,
即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结
构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区,其由较为保守的框架
区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成,从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、
FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。
抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括多种免疫系统细胞(例
如,效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
子、效应细胞、病毒和药物载体系统招募至靶标结构的作用。双特异性抗体这种可同时识别
两种不同分子(受体和/或配体) 的特点,提高了抗体的选择性和功能性亲和力。
片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段,由VL、
VH、CL和CH1构成的单价片段;(ii)F(ab′)2片段,包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的
二价片段;(iii)由VH和CH1构成的Fd片段;(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段;(v)由VH
构成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544‑546);(vi)分离的互补决定区
(CDR);以及(vii)纳米抗体,一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此
外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码,它们可以通过重组法经由使两者
成为单蛋白链的合成接头而连接,其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv);参
见例如Bird et al.,(1988)Science 242:423‑426;and Huston et al.,(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879‑5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些
抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到,且片段可以通过与完整抗体相
同的方式进行功能筛选。
链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的
二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F
(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区,从动物的循环中更快速地清除,并且可能
具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如,Wahl等人,1983,J. Nucl. Med. 24:
316)。
条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链
中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
Riechmann,1999,Journal ofImmunological Methods 231:25–38)。
配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种,所述
技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外,衍生物可
以含有一种或多种非天然氨基酸,例如,使用ambrx技术(参见例如,Wolfson,2006,
Chem.Biol. 13(10):1011‑2)。
单价相互作用的两个分子(例如,抗体或其片段,和抗原)之间的结合亲和力,可通过测定解
离常数(KD)来定量测定。继而,可通过对复合物形成和解离动力学的测量,例如通过SPR方
法,来测定KD。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数,被分别称为缔合速率常数ka(或
kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD = kd / ka与ka和kd相联系。根据以上定
义,与不同分子相互作用相关的结合亲和力,例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力
的比较,可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值进行比较。类似地,可通过测定,并比较感
兴趣的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与不感兴趣的相互作用
的KD值,来评价相互作用的特异性。通过众所周知的方法可直接测定该解离常数的值,例
如,通过评价配体(例如抗体)对靶的结合能力的标准测定是本领域已知的,并包括例如
ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准测定,例如SPR,还可评
价抗体的结合动力学和结合亲和力。可进行竞争性结合测定,其中,将抗体与靶的结合,和
该靶的另外的配体(例如另外的抗体)与该靶结合,进行比较。
5.0x 10 M以下,更优选1.0x 10 M以下、5.0x 10 M以下,更优选1.0x 10 M以下。对于其他
‑6
抗体亚型,“高亲和性”结合可能会变化。例如,IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10 M以
‑7 ‑8
下,优选10 M以下,更优选10 M以下。
Ka)得到,并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定
抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的,优选使用生物传感系统例如
BiacoreTM系统测得。
的改变为依据,对影响其稳定性的缓冲剂、渗透压调节剂、保护剂、表面活性剂的种类和含
量进行了优化,以提高其生产、贮存、运输的稳定性。
量的优化,全面提高了双特异性抗体高温稳定性、振摇稳定性、冻融稳定性、光照稳定性。
谱(IEC,Ion‑exchange chromatography)、非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(NR CE‑SDS,
Non‑Redundant Capillary Electrophoresis Sodium Dodecyl Sulfate)多角度检测双特
异性抗体微观分子的改变。
附图说明
的限制。而且在整个附图中,用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中:
具体实施方式
传达给本领域的技术人员。
PD‑L1单可变域抗体VHH‑F2可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3;后续简称为6MW3411)置换至
以下目的缓冲液中,分装,进行稳定性考察。缓冲液体系如表1所示。
对其它参数进行优化,同时对柠檬酸缓冲液和组氨酸缓冲液通过添加促溶剂等进行改进。
制条件试验,并在0天、7天、14天时取样进行SEC、IEC、NR CE‑SDS检测。实验结果如下:
度不利于6MW3411的稳定,样品更容易聚集、断裂及产生电荷异质性。鉴于上述结果,综合考
虑临床用药方案,后续将围绕20mg/ml的浓度进行进一步考察。
SEC、IEC、NR CE‑SDS检测。实验结果如下:
度显著高于蔗糖中的样品,说明蔗糖有利于维持6MW3411样品的稳定性。因此,后续研究采
用蔗糖作为6MW3411的保护剂。
进行高温强制条件试验,并在0天、7天、14天时取样进行SEC、IEC、NR CE‑SDS检测。实验结果
如下:
NR‑CE纯度显著降低;柠檬酸pH大于6.0时,SEC纯度和NR‑CE纯度的变化幅度小于醋酸和组
氨酸。在pH6.5中,CEX主峰下降较明显,其他条件中CEX电荷异质性变化没有显著差异。综合
上述结果,后续选择柠檬酸+氯化钠6.0左右进行下一步考察。
6.0的条件下柠檬酸缓冲液的稳定效果是最优的、主峰下降值最小。
1次、3次、5次、震荡1天、3天及40℃放置14天后经MFI测定样品中的不溶性微粒。结果如表
11‑12所示。
品在冻融5次后,0.005%聚山梨酯80中的样品微粒显著增加;震荡3天和40℃放置14天后,
0.005%和0.01%聚山梨酯80中的样品微粒均显著增加;40℃放置14后,当聚山梨酯80浓度≥
0.04%时,≥5μm的颗粒低于500个/ml,≥10μm的颗粒低于100个/ml。因此,有效抑制6MW3411
样品产生不溶性微粒的合适聚山梨酯80浓度为0.05%±0.01%。
NR‑CE纯度轻微降低,IEC主峰明显降低,不溶性微粒少量增加,表明6MW3411对高温敏感,样
品应该低温保存。
均未发生显著变化,表明在优选处方中,6MW3411双抗对振荡不敏感,稳定性良好。
的SEC、IEC、NR CE‑SDS、相对结合活性和不溶性微粒,结果如表15所示。结果显示,各检测指
标均未发生显著变化,表明6MW3411双抗在优选处方中,对反复冻融不敏感,稳定性良好。
活性和不溶性微粒检测,结果如表16所示。结果显示,光照试验中,6MW3411双抗的SEC和IEC
主峰含量显著降低、NR‑CE主峰有明显下降,相对结合活性显著降低;而避光对照组中,所有
检测指标均未见显著变化。表明光照对优选处方中的6MW3411双抗有影响,而普通纸质包装
盒即可起到避光作用。
6MW3411用PBS缓冲液稀释至4μg/ml,流经AHC探针表面,时间为240s。使用人NKG2A胞外区融
合蛋白或人PD‑L1胞外区融合蛋白作为流动相,结合时间300s,解离时间300s。实验完毕,扣
除空白对照响应值,用软件进行1:1 Langmuir 结合模式拟合,计算抗原抗体结合的动力学
常数。
细胞浓度为:1×105cells/样品,抗体终浓度:55 nM起始3倍连续稀释8个梯度。以冰冷PBS
(含0.05%吐温)洗涤细胞3次后上机检测。PBST洗涤细胞3次后通过流式细胞仪(型号
B49007AD,SNAW31211,BECKMAN COULTER)检测细胞的平均荧光强度(MFI),以检测人源化抗
体与天然细胞NK92的结合能力。结果如图1所示,6MW3411能与NK92细胞表面的NKG2A抗体特
异性结合。
始,3倍连续稀释10个梯度。以冰冷PBST(0.05%吐温)洗涤细胞3次后,加入1:100稀释的羊抗
人IgG‐FITC(Cat.:F9512,Sigma)并在4℃孵育30min。PBST洗涤细胞3次后通过流式细胞仪
检测细胞的平均荧光强度(MFI),以检测人源化抗体与MDA‑MB‑231细胞表面的人PD‑L1结合
能力。结果如图2所示,双特异性抗体均保持了与细胞表面PD‑L1结合活性。
都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范
围为准。