一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法

摘要

本发明公开一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，属于生物材料制备领域。本发明所述水凝胶具有促进细胞黏附、血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。该水凝胶是以天然来源的高分子材料明胶为基底材料，通过丁二酸酐对明胶进行处理，并在此基础上采用EDC、NHS活化明胶、共价连接将具有血管内皮生长因子（VEGF）接枝到明胶的分子骨架上。通过NO循环与其他循环（例如尿素循环）的生物合成偶合，使NH3部分氧化而连续释放NO；本发明制备的水凝胶具有良好的生物相容性，在体内可降解，具有促进血管化的作用，可以主动诱导细胞黏附，在再生医学及临床治疗中应用前景良好。

权利要求

1.一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）按15‑25g/L的比例将碳酸钠溶解于去离子水中，调节PH=7‑10，按50 200g/L的比例~加入明胶，于35‑60°C的温度条件下搅拌溶解制得明胶溶液；

（2）按30 80g/L的比例将丁二酸酐溶解于二甲基亚砜和三乙胺的混合溶液中；

~

（3）将步骤（1）和步骤（2）的所得溶液混合得到混合溶液，混合溶液中明胶与丁二酸酐的质量比为1:0.1 1，室温搅拌12‑48h后稀释1‑3倍，用去离子水在常温下透析，透析结束~后，冷冻干燥得到处理后的明胶；

（4）按50 150g/L的比例将步骤（3）得到的明胶溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.1 0.5g/~ ~L的比例加入1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺，按0.1 0.5g/L比例加入N‑羟基琥珀~酰亚胺，活化反应0.5‑4h；按0.1 0.4g/L的比例加入血管内皮生长因子与活化的材料混合~搅拌6‑24小时，透析、冻干，得明胶‑血管内皮生长因子；

（5）按24 96g/L的比例取谷氨酰胺转胺酶溶于去离子水中，于20‑35℃下磁力搅拌1‑8~小时配置成溶液A；按50 200g/L的比例将明胶‑血管内皮生长因子加入去离子水中，于20‑~

60℃下磁力搅拌0.5‑4小时配置成溶液B；

（6）按体积比为1:1 9:1的比例将溶液A与溶液B混合均匀，交联0.3‑12h得程序性释放~NO促血管生成多肽水凝胶。

2.根据权利要求1所述程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中二甲基亚砜:三乙胺体积比为20 30:1。

~

3.根据权利要求1所述程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）和（4）中所述透析的条件为：在常温下透析3‑7d，每6‑18h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa。

4.根据权利要求1所述程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，其特征在于：

1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺与N‑羟基琥珀酰亚胺的质量比为：1:1‑1:3。

说明书

一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法。技术背景

[0002] 水凝胶是一种具有三维网络结构的高分子材料，通过物理或化学交联将聚合物连[0003] 接形成，它具有良好的生物相容性、吸水能力、降解性以及低细胞毒性，在水溶液中能够溶胀并保持大量水分而又不会溶解，因此可以维持水分和体液，从而促进新生血管形成和皮肤再生。

[0004] 一氧化氮（NO）是通过内皮细胞（ECS）产生的有效的促胰刺激剂，并且可以使用氨（NH3）产生；NO是血管扩张剂，并促进EC生长和迁移，从而促进新血管萌芽从现有的；因此，各种释放NO的生物材料最近已用于研究NO对组织再生的有益效果；这种特定的功能被编程，以促进血管再生和治疗在表面涂层，纳米颗粒，水凝胶，和支架的形式。

[0005] 血管内皮细胞分泌血管生成因子与血管抑制因子，共同调节血管的生成。血管内皮生长因子（VEGF），又称血管通透因子（VPF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。抗体和生长因子均属于蛋白类药物，在生物医药领域已得到广泛应用。由于蛋白对体内多种组织细胞均有可能发挥作用，系统性过量使用会导致潜在风险；而且蛋白在体内的半衰期较短，易失去生物活性。因此，有必要设计缓释载体来递送抗体和生长因子从而提升其治疗疗效。

[0006] 但是，此类多肽水凝胶在实际应用中，受到两方面因素的制约。一方面，例如伤口愈合、组织修复等组织工程领域，在应用中必须严格控制在使用到目标组织前的时间，实际应用受到了很大的制约。如果时间控制不好，就会大大降低其应用效果。另一方面，很多不同的应用需要水凝胶的强度也不尽相同，单纯靠提高多肽的浓度来增加水凝胶的强度则会造成成本的增加，也会带来一些负面的效应。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于针对上述研究领域的不足，提供一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，得到了一种既能缓释管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、又能释放NO气体水凝胶兼具有可控的力学性能及良好的生物相容性，具有促进血管化的作用，在再生医学及临床治疗中应用前景良好。

[0008] 为实现上述目的，采用以下技术方案:

[0009] 本发明制备一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0010] （1）按15‑25g/L的比例将碳酸钠溶解于去离子水中，调节PH=7‑10，按50 200g/L的~比例加入明胶，于35‑60°C的温度条件下搅拌溶解制得明胶溶液。

[0011] （2）按30 80g/L的比例将丁二酸酐溶解于二甲基亚砜（DMSO）和三乙胺的混合溶液~中。

[0012] （3）将步骤（1）和步骤（2）的所得溶液混合得到混合溶液，混合溶液中明胶与丁二酸酐的质量比为1:0.1 1，室温搅拌12‑48h后稀释1‑3倍，用去离子水在常温下透析，透析结~束后，冷冻干燥得到处理后的明胶，反应式如下：

[0013]

[0014] （4）按50 150g/L的比例将步骤（3）得到的明胶溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.1~ ~0.5g/L的比例加入1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺（EDC），按0.1 0.5g/L比例加入~
N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS），活化反应0.5‑4h；按0.1 0.4g/L的比例加入血管内皮生长因子与~
活化的材料混合搅拌6‑24小时，透析、冻干，得明胶‑血管内皮生长因子，反应式如下：

[0015]

[0016] （5）按24 96g/L的比例取谷氨酰胺转胺（mTG）酶溶于去离子水中，于20‑35℃下磁~力搅拌1‑8小时配置成溶液A；按50 200g/L的比例将明胶‑血管内皮生长因子加入去离子水~
中，于20‑60℃下磁力搅拌0.5‑4小时配置成溶液B。

[0017] （6）按体积比为1:1 9:1的比例将溶液A与溶液B混合均匀，交联0.3‑12h得程序性~释放NO促血管生成多肽水凝胶。

[0018] 优选的，本发明步骤（2）中二甲基亚砜:三乙胺体积比为20 30:1。~

[0019] 优选的，本发明步骤（3）和（4）中所述透析的条件为：在常温下透析3‑7d，每6‑18h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa。

[0020] 优选的，本发明1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺与N‑羟基琥珀酰亚胺的质量比为：1:1‑1:3。

[0021] 本发明的有益效果：

[0022] （1）本发明以明胶为原料，利用丁二酸酐对明胶进行处理，采用EDC、NHS将明胶的羧基活化，并使多肽的N端和活化位置结合；本发明采用mTG酶交联，可通过控制mTG酶的浓度调控水凝胶的力学性能，对天然高分子水凝胶产生交联网络，避免了合成高分子、有毒交联剂的使用，得到明胶‑血管内皮生长因子水凝胶。

[0023] （2）明胶是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，水溶性高，具有优良的生物活性、吸湿保湿性，成膜性和生物相容性等特点；该水凝胶能维持负载在水凝胶中的药物，且释放速率可以通过调整交联度和水凝胶的组成实现。

[0024] （3）本发明材料成分简单、原料易得、生物相容性好,有望在生物医学工程材料领域得到广泛应用；采用共价接枝的方法所得到的材料除了能得到稳定的效果外，还可能通过控制反应的条件得到可控力学性能、可控接枝率的生物医用材料。

[0025] （4）水凝胶兼具优异的可调控力学性能及生物相容性，为制备高强度蛋白质基水凝胶提供一种新的思路及方法，有助于蛋白质基水凝胶材料的开发利用，以便其应用在生物材料、组织工程等领域。

[0026] 本发明所述水凝胶是以天然来源的高分子材料明胶为基底材料，通过丁二酸酐对明胶进行处理，并在此基础上采用EDC、NHS活化明胶、共价连接将具有血管内皮生长因子（VEGF）接枝到明胶的分子骨架上；在明胶‑血管内皮生长因子交联过程中，mTG催化谷氨酰胺的γ‑羧酰胺基[‑（C=O）NH2 ]与赖氨酸的ε‑氨基（‑NH3）形成异肽键，产生NH3并在明胶中沉积；通过NO循环与其他循环（例如尿素循环）的生物合成偶合，使NH3部分氧化而连续释放NO。

附图说明

[0027] 图1为复合材料光刺激405nm成胶图；

[0028] 图2为鸡胚的发育情况。

具体实施方式

[0029] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

[0030] 实施例1

[0031] 一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0032] （1）将碳酸钠溶解于去离子水中，调节PH=7‑10，按50g/L的比例加入明胶，于60°C的温度条件下搅拌溶解制得明胶溶液。

[0033] （2）按30g/L的比例将丁二酸酐溶解于二甲基亚砜和三乙胺的混合溶液中；其中二甲基亚砜与三乙胺的体积比为25:1。

[0034] （3）将步骤（1）和步骤（2）的所得溶液混合得到混合溶液，混合溶液中明胶与丁二酸酐的质量比为1: 1，室温搅拌12h后稀释3倍，用去离子水在在常温下透析3d，每15h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa，透析结束后，冷冻干燥得到处理后的明胶。

[0035] （4）按50g/L的比例将步骤（3）得到的明胶溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.3g/L的比例加入1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺，按0.3g/L比例加入N‑羟基琥珀酰亚胺，活化反应4h；按0.1g/L的比例加入血管内皮生长因子与活化的材料混合搅拌24小时，在常温下透析3d，每15h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa，冻干，得明胶‑血管内皮生长因子。

[0036] （5）按24g/L的比例取谷氨酰胺转胺酶溶于去离子水中，于28℃下磁力搅拌1小时配置成溶液A；按200g/L的比例将明胶‑血管内皮生长因子加入去离子水中，于20℃下磁力搅拌4小时配置成溶液B。

[0037] （6）按体积比为9:1的比例将溶液A与溶液B混合均匀，交联0.3h得程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶。

[0038] 实施例2

[0039] 一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0040] （1）将碳酸钠溶解于去离子水中，调节PH=7‑10，按200g/L的比例加入明胶，于45°C的温度条件下搅拌溶解制得明胶溶液。

[0041] （2）按80g/L的比例将丁二酸酐溶解于二甲基亚砜和三乙胺的混合溶液中；其中二甲基亚砜与三乙胺的体积比为25:1。

[0042] （3）将步骤（1）和步骤（2）的所得溶液混合得到混合溶液，混合溶液中明胶与丁二酸酐的质量比为1:0.5，室温搅拌48h后稀释2倍，用去离子水在在常温下透析5d，每18h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa，透析结束后，冷冻干燥得到处理后的明胶。

[0043] （4）按150g/L的比例将步骤（3）得到的明胶溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.1g/L的比例加入1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺，按0.1g/L比例加入N‑羟基琥珀酰亚胺，活化反应0.5h；按0.4g/L的比例加入血管内皮生长因子与活化的材料混合搅拌6小时，在常温下透析7d，每18h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa，冻干，得明胶‑血管内皮生长因子。

[0044] （5）按96g/L的比例取谷氨酰胺转胺酶溶于去离子水中，于35℃下磁力搅拌8小时配置成溶液A；按50g/L的比例将明胶‑血管内皮生长因子加入去离子水中，于60℃下磁力搅拌0.5小时配置成溶液B。

[0045] （6）按体积比为5:1的比例将溶液A与溶液B混合均匀，交联12h得程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶。

[0046] 实施例3

[0047] 一种程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0048] （1）将碳酸钠溶解于去离子水中，调节PH=7‑10，按100g/L的比例加入明胶，于35°C的温度条件下搅拌溶解制得明胶溶液。

[0049] （2）按60g/L的比例将丁二酸酐溶解于二甲基亚砜和三乙胺的混合溶液中；其中二甲基亚砜与三乙胺的体积比为25:1。

[0050] （3）将步骤（1）和步骤（2）的所得溶液混合得到混合溶液，混合溶液中明胶与丁二酸酐的质量比为1:0.1，室温搅拌30h后稀释1倍，用去离子水在在常温下透析7d，每6h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa，透析结束后，冷冻干燥得到处理后的明胶。

[0051] （4）按100g/L的比例将步骤（3）得到的明胶溶于磷酸盐缓冲盐溶液中，按0.1g/L的比例加入1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺，按0.3g/L比例加入N‑羟基琥珀酰亚胺，活化反应2h；按0.3g/L的比例加入血管内皮生长因子与活化的材料混合搅拌15小时，在常温下透析6d，每6h换一次水，透析袋截留分子量为8KDa‑14KDa，冻干，得明胶‑血管内皮生长因子。

[0052] （5）按60g/L的比例取谷氨酰胺转胺酶溶于去离子水中，于20℃下磁力搅拌6小时配置成溶液A；按100g/L的比例将明胶‑血管内皮生长因子加入去离子水中，于40℃下磁力搅拌2小时配置成溶液B。

[0053] （6）按体积比为1:1的比例将溶液A与溶液B混合均匀，交联8h得程序性释放NO促血管生成多肽水凝胶，如图1所示。

[0054] 验证实验：

[0055] 0日龄受精鸡胚于培养箱温度37．5℃、湿度75%的环境中，进行孵育每日观察现象；

[0056] 第一天：照蛋时可以发现蛋黄表面有一颗颜色稍深、四周稍亮的圆点；

[0057] 第二天：可以看到卵黄囊血管区，其形状很像樱桃形；

[0058] 第三天：卵黄囊血管的形状像静止的蚊子，卵黄颜色稍深的下部像月牙；

[0059] 第四天：蛋转动时，卵黄不易跟随着转动，胚胎和卵黄囊血管形状像一只小蜘蛛；

[0060] 第五天：明显看到黑色的眼点；

[0061] 第六天：胚胎形似“电话筒”，一端是头部，另一端为弯曲增大的躯干部，可以看到羊水；

[0062] 第七天：羊水增多，胚胎活动尚不强，正面已布满扩大的卵黄和血管；

[0063] 第八天：胚胎较易看到，像在羊水中浮游一样，卵黄已扩大到背面，蛋转动时两边卵黄不易晃动；

[0064] 第九天：蛋转动时，两边卵黄容易晃动，接着背面尿囊血管迅速伸展出卵黄；

[0065] 通过观察鸡胚的发育情况，至9日龄时，开始下一步操作。

[0066] （2）在无菌条件下用牙科锯齿弯镊剥去己标记气室位置的蛋壳部分，取大约1mL的生理盐水润湿白色蛋膜，用镊子把蛋膜去除，暴露出尿囊膜；放入特氟龙环，将实施例3中第（5）步得到的A溶液和B溶液滴加于特氟龙环内交联的尿囊膜表面，交联后取出特氟龙环，观察CAM反映情况；当材料置于正在发育的尿囊膜表面，刺激24‑48h，如图2所示，由图2可以看出材料周围的血管呈放射状，血管密度增加；证明材料有促血管生成的功能。

[0067] 使用实施例1和2制备得到的水凝胶进行相同的验证实验，也可以看出其有促血管生成的功能。