一种啶虫脒半抗原、完全抗原及其合成与应用

摘要

本发明提供一种啶虫脒半抗原、完全抗原的合成与应用，包括一种啶虫脒半抗原。本发明涉及一种啶虫脒半抗原，该啶虫脒半抗原是以氯甲基烟酸甲酯为原料所合成的一种新的啶虫脒半抗原，该啶虫脒半抗原保留了啶虫脒的主要结构；本发明还涉及该啶虫脒半抗原的合成方法，该合成方法保留了啶虫脒的主要结构，相比于现有技术能够节约啶虫脒半抗原的合成成本，提高啶虫脒半抗原的合成效率。

权利要求

1.一种啶虫脒半抗原，其特征在于，结构式如下：

2.一种啶虫脒半抗原的合成方法，用于制备权利要求1所述的啶虫脒半抗原，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将N‑甲基‑N‑氰基乙脒和氯甲基烟酸甲酯加入反应溶剂中，调节反应溶液的环境为碱性，反应温度控制在5‑35℃范围内，反应10‑20小时得到中间体；

S2.将步骤S1制得的中间体进行水解反应，得到啶虫脒半抗原。

3.根据权利要求2所述的一种啶虫脒半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤S1中的N‑甲基‑N‑氰基乙脒和氯甲基烟酸甲酯的摩尔比为1‑1.2:1。

4.根据权利要求2所述的一种啶虫脒半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤S1中的反应溶剂为DMF、DMSO、乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、异丙醇中的一种。

5.根据权利要求2所述的一种啶虫脒半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤S1中的反应溶液为DMF。

6.根据权利要求2所述的一种啶虫脒半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤S1中使用氢化钠调节反应溶液的环境达到碱性，且氢化钠与氯甲基烟酸甲酯的摩尔比为1‑3:1。

7.根据权利要求2所述的一种啶虫脒半抗原的合成方法，其特征在于：所述步骤S2的水解反应在NaOH/LiOH水溶液与甲醇/四氢呋喃的混合溶液中进行，水解时间为20min‑5h，水解温度在0‑60℃范围内。

8.一种啶虫脒完全抗原，由权利要求1所述啶虫脒半抗原与载体蛋白偶联制得，其特征在于，结构式如下：

其中， 代表载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵血清蛋白、钥孔血蓝蛋白中的一种。

9.一种啶虫脒半抗原的应用，其特征在于：利用权利要求1所述的一种啶虫脒半抗原或利用权利要求3‑7任一所述合成方法合成的啶虫脒半抗原制备检测啶虫脒产品。

说明书

一种啶虫脒半抗原、完全抗原及其合成与应用

技术领域

[0001] 本发明是一种啶虫脒半抗原、完全抗原及其合成与应用，属于半抗原、完全抗原技术领域。

背景技术

[0002] 啶虫脒属氯化烟碱类化合物，是一种新型低毒杀虫剂，外观为白色晶体，可有效的防治棉蚜、菜蚜、桃小食心虫等害虫，作用于昆虫神经系统突触部位后膜内的烟碱乙酰胆碱
受体，干扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经系统通路阻塞，造成神经递质乙酰胆碱在突
触部位的积累，从而导致昆虫麻痹，最终死亡，在实际生产生活中得到广泛使用，在一定程
度上提高蔬菜粮食作物以及烟草等的产量和质量。

[0003] 但作物上会残留一定量的农药，且啶虫脒对人畜有一定毒性，现有的啶虫脒残留分析的研究主要集中于气相色谱、液相色谱及气相色谱‑质谱联用技术、液相色谱‑质谱联
用技术，虽然可以实现准确定性定量，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样
品前处理繁琐费时、检测时间长、检测费用高，检测具有局限性。因此，免疫分析作为一种简
单、快速、准确、可靠的啶虫脒残留的检测方法，为该项研究提供了一个新的途径，该方法基
于有机合成、免疫化学及生物化学等学科，依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手
段，结合抗原抗体特异性识别的特性，设计合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质
偶联，制备有效人工抗原，再进一步通过免疫动物制备对小分子分析物特异性识别的抗体，
利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量的检测样品
中超微量小分子目标物。

[0004] 目前为研究啶虫脒抗原能使动物体内产生免疫反应的相关机理，大多实验人员通过水解啶虫脒中的氰基或用巯基丙酸取代啶虫脒吡啶2位的氯原子来制备啶虫脒半抗原，
如公布号CN109111394A和公布号CN110045114A中记载的啶虫脒半抗原的制备方法也具有
一定局限性，因此本发明涉及一种新的啶虫脒半抗原以及相关合成方法，可应用于免疫分
析技术，且避免了上述局限。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明提供一种新的啶虫脒半抗原、完全抗原以及相关的合成方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

[0006] 为了实现第一个目的，提供一种啶虫脒半抗原，结构式如下：

[0007] 。

[0008] 为了实现第二个目的，提供一种上述啶虫脒半抗原的合成方法，本发明通过下述技术方案实现。

[0009] 一种啶虫脒半抗原的合成方法，用于制备上述啶虫脒半抗原，包括如下步骤：

[0010] S1.将N‑甲基‑N‑氰基乙脒和氯甲基烟酸甲酯加入反应溶剂中，调节反应溶液的环境为碱性，反应温度控制在5‑35℃范围内，反应10‑20小时得到中间体；

[0011] S2.将步骤S1制得的中间体进行水解反应，得到啶虫脒半抗原。

[0012] 优选的，所述步骤S1中的N‑甲基‑N‑氰基乙脒和氯甲基烟酸甲酯的摩尔比为1‑1.2:1。

[0013] 优选的，所述步骤S1中的反应溶剂为DMF、DMSO、乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、异丙醇中的一种。

[0014] 优选的，所述步骤S1中的反应溶液为DMF。

[0015] 优选的，所述步骤S1中使用氢化钠调节反应溶液的环境达到碱性，且氢化钠与氯甲基烟酸甲酯的摩尔比为1‑3:1。

[0016] 优选的，所述步骤S2的水解反应在NaOH/LiOH水溶液与甲醇/四氢呋喃的混合溶液中进行，水解时间为20min‑5h，水解温度在0‑60℃范围内。

[0017] 为了实现第三个目的，提供一种啶虫脒完全抗原，本发明通过下述技术方案实现。

[0018] 一种啶虫脒完全抗原，由上述啶虫脒半抗原与载体蛋白偶联制得，结构式如下：

[0019] ，

[0020] 其中， 代表载体蛋白。

[0021] 为了实现第四个目的，提供一种由上述啶虫脒半抗原/啶虫脒完全抗原制备而成的啶虫脒特异性抗体，本发明通过下述技术方案实现。

[0022] 一种啶虫脒特异性抗体，由上述啶虫脒半抗原或上述啶虫脒完全抗原制备而成，能与啶虫脒发生特异性免疫反应。

[0023] 为了实现第五个目的，提供一种上述啶虫脒半抗原的应用：利用上述一种啶虫脒半抗原或利用上述合成方法合成的啶虫脒半抗原进行啶虫脒检测或制备检测啶虫脒产品。

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] （1）本发明涉及一种啶虫脒半抗原，该啶虫脒半抗原是以氯甲基烟酸甲酯为原料所合成的一种新的啶虫脒半抗原，该啶虫脒半抗原保留了啶虫脒的主要结构。

[0026] （2）本发明涉及一种啶虫脒半抗原的合成方法，该啶虫脒半抗原的合成方法保留了啶虫脒的主要结构，相比于现有技术能够节约啶虫脒半抗原的合成成本，提高啶虫脒半
抗原的合成效率。

[0027] （3）本发明涉及一种啶虫脒完全抗原，该啶虫脒完全抗原直接在啶虫脒半抗原的吡啶环上引入羧基用于与载体蛋白偶联，合成出能在动物体内产生免疫反应的完全抗原，
可用于免疫分析技术，提高啶虫脒的合成效率。

[0028] （4）本发明涉及一种啶虫脒特异性抗体，该啶虫脒特异性抗体利用啶虫脒人工抗原免疫动物所制得，能与啶虫脒发生特异性免疫反应，是一种高效的可发生特异性免疫反
应的单克隆或多克隆抗体。

[0029] （5）本发明涉及一种啶虫脒半抗原的应用，啶虫脒半抗原的应用为酶联免疫试剂盒，啶虫脒的定性与定量分析检测，还可用于免疫分析技术，具有特异性好、精密度高等优
点，能够对啶虫脒进行高效精确的检测。

具体实施方式

[0030] 为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明，下述实施方式中未经特殊说明的实验方法均为常规方
法。

[0031] 一种啶虫脒半抗原，结构式如下：

[0032] 。

[0033] 该啶虫脒半抗原的合成路径为：

[0034] 。

[0035] 该啶虫脒半抗原的合成方法包括如下步骤：

[0036] S1.将摩尔比为1‑1.2:1的N‑甲基‑N‑氰基乙脒和氯甲基烟酸甲酯加入反应溶剂中形成反应溶液，反应溶剂可以为DMF、DMSO、乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、异丙醇等
物质中的一种，其中DMF最佳，随后用氢化钠调节该反应溶液的环境达到碱性，且保证氢化
钠与氯甲基烟酸甲酯的摩尔比为1‑3:1，控制反应温度在5‑35℃范围内，反应10‑20小时得
到中间体；

[0037] S2.将步骤S1制得的中间体在NaOH/LiOH水溶液与甲醇/四氢呋喃的混合溶液中进行水解反应，水解时间为20min‑5h，水解温度在0‑60℃范围内，得到啶虫脒半抗原。

[0038] 该啶虫脒半抗原的整体合成时间在12‑24h内。

[0039] 一种啶虫脒完全抗原，由啶虫脒半抗原与载体蛋白偶联制得，结构式如下：

[0040] ，

[0041] 其中， 代表载体蛋白。

[0042] 该啶虫脒完全抗原的合成路径为：

[0043] 。

[0044] 该啶虫脒完全抗原的合成方法包括如下步骤：

[0045] S1.制备硼酸盐缓冲溶液和啶虫脒半抗原溶液

[0046] 称取适量Na2B4O7·10H2O和H3BO3溶于超纯水中，调节pH至8.04并定容，配制得到硼酸盐缓冲溶液；

[0047] 将EDC、NHS和啶虫脒半抗原以1‑2:1‑2:1的摩尔比溶于DMF溶液中，得到啶虫脒半抗原溶液；

[0048] S2.制备载体蛋白溶液

[0049] 将载体蛋白溶于pH值为8.7的硼酸盐缓冲液中得到载体蛋白溶液，载体蛋白可以为BSA（牛血清白蛋白）、OVA（卵血清蛋白）、KLH（钥孔血蓝蛋白）中的一种；

[0050] S3.制备啶虫脒完全抗原

[0051] 将啶虫脒半抗原溶液滴加至载体蛋白溶液中，控制啶虫脒半抗原溶液和载体蛋白溶液的摩尔比为1:1‑20，反应得到啶虫脒完全抗原。

[0052] 该啶虫脒完全抗原的整体合成时间在4‑6h内。

[0053] 实施例1

[0054] 本实施例涉及一种啶虫脒半抗原及其合成方法：

[0055] S1.将1g的N‑甲基‑N‑氰基乙脒溶于15ml的DMF中，分批次加入0.5g氢化钠，室温下搅拌，调节溶液达到碱性环境形成A液，再将2g氯甲基烟酸甲酯溶于10ml的DMF中，混合均匀
后缓慢滴加至上述A液中，室温搅拌过夜，再将室温过夜后的溶液倒入100ml冰水中，用
100ml的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，先后用10ml的蒸馏水和100ml的饱和食盐溶液水
洗，有机相无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩、残余物柱层析，得中间体I。

[0056] S2.取200mg中间体I加入0.33ml的10%氢氧化钠溶液和1ml的甲醇，室温下搅拌30min进行水解反应，随后加入4ml水，水相乙醚洗涤，弃有机相，再水相冰浴降温，用浓盐酸
调节pH=2‑3，用5ml的乙酸乙酯萃取5次，合并有机相，无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩、残余物
加入乙醚研磨，最终得到类白色固体状的啶虫脒半抗原。

[0057] 随机称取啶虫脒半抗原样品进行ESI‑MS（电喷雾质谱法）检测，发现[M+H]+=233.3，说明该方法能成功合成啶虫脒半抗原。

[0058] 实施例2

[0059] 本实施例涉及一种啶虫脒完全抗原及其合成方法：

[0060] S1.制备硼酸盐缓冲溶液和啶虫脒半抗原溶液

[0061] 称取1.43g的Na2B4O7·10H2O和2.16g的H3BO3溶于400ml超纯水中，调节pH至8.04，定容至500ml，配制得到硼酸盐缓冲溶液；

[0062] 称取8.3mg的EDC盐酸盐、2.8mg的NHS、5mg啶虫脒半抗原溶于300μL的DMF溶解中形成A液，室温搅拌反应4‑6h，得到啶虫脒半抗原溶液；

[0063] S2.制备载体蛋白溶液

[0064] 称取10mg的牛血清白蛋白BSA，溶解于2mL的硼酸缓冲溶液中，得到B液；

[0065] S3.制备啶虫脒完全抗原

[0066] 室温条件下逐滴将A液滴加到B液中，室温反应过夜，完毕，透析得啶虫脒BSA完全抗原（BSA免疫原），冷冻保存。

[0067] 实施例3

[0068] 不同于实施例2，本实施例步骤S2中所添加的载体蛋白为卵血清蛋白OVA，其余步骤相同，制备得到啶虫脒OVA完全抗原（OVA免疫原）。

[0069] 实施例4

[0070] 本实施例涉及一种啶虫脒特异性抗体（啶虫脒BSA单克隆抗体）的合成方法。

[0071] 1.动物免疫

[0072] 将实施例2中得到的BSA免疫原注入到Balb/c（8周）小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

[0073] 2.细胞融合和克隆化

[0074] 测定小鼠血清含量，待小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，与FO骨髓瘤细胞以数量配比7:1的比例进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限
稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌啶虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0075] 3.细胞冻存和复苏

[0076] 将可分泌啶虫脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，液氮中保存备用；复苏时，取出冻存管于37℃水浴中速融，离心去除冻存液，移入培养瓶
内培养。

[0077] 4.单克隆抗体的生产与纯化

[0078] 采用动物体内诱生单克隆抗体方法进行单克隆抗体的生产，7天后采集腹水，用protein G纯化柱进行腹水纯化，得到啶虫脒BSA单克隆抗体，‑20℃保存。

[0079] 实施例5

[0080] 不同于实施例4，本实施例采用的实施例3制备得到的OVA免疫原，其余步骤相同，制备得到啶虫脒OVA单克隆抗体。

[0081] 实施例6

[0082] 本实施例涉及一种啶虫脒半抗原的应用，应用于通过酶标试剂盒检测啶虫脒。

[0083] 1.酶标二抗的制备

[0084] 以山羊作为免疫动物，以实施例4制得的啶虫脒单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到啶虫脒抗抗体，将啶虫脒抗抗体与辣根过氧化物酶（HRP）进行偶联得到
酶标二抗。

[0085] 2.酶标板的制备

[0086] 用pH=9.6的碳酸盐包被缓冲液将实施例2制得的啶虫脒BSA完全抗原稀释成2μg/mL，每孔加入100μl，4℃避光孵育16h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤1次，静置30s，拍干，然
后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体，拍干，干燥后用铝膜真空密
封保存。

[0087] 3.检测啶虫脒的酶联免疫试剂盒的组建

[0088] 组建检测啶虫脒的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

[0089] （1）包被啶虫脒偶联抗原的酶标板；

[0090] （2）啶虫脒标准品浓缩液溶液6瓶（浓缩液溶剂甲醇），浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L，使用时用0.02mol的pH=7.2的磷酸盐缓冲液9:1稀释
成标准品溶液，稀释后浓度分别为0μg/L，0.01μg/L，0.03μg/L，0.09μg/L，0.27μg/L，0.81μ
g/L；

[0091] （3）用辣根过氧化物酶标记的啶虫脒抗抗体；

[0092] （4）底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；

[0093] （5）终止液为2mol/L硫酸；

[0094] （6）洗涤液为pH值为7.2，含有0.01％吐温‑20、3g/L叠氮化钠防腐剂、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

[0095] （7）复溶液为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

[0096] 4.啶虫脒试剂盒检测

[0097] 加标准溶液/样本50μl到对应的微孔中，再加入抗体50μl/孔，最后加入酶标二抗50μl/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中反应45min；小心揭开盖板膜，
将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔充分洗涤4‑5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍
干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头轻轻戳破）；依次加入底物液A液50μl/孔和底物
液B液50μl/ 孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置于25℃避光环境中显色15min；加入终止
液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪的检测波长450nm，参比波长620nm，测定每孔的OD
值。

[0098] 标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值除以第一个标准品（0标准）的吸光度值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值；以标准品百分吸光率
为纵坐标，以啶虫脒标准品浓度（μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图；将样本的百分吸
光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为
样本中啶虫脒的实际浓度。

[0099] 对比例1

[0100] 选用公布号CN109111394A的实施例1中记载的啶虫脒半抗原和实施例2的1中记载的啶虫脒BSA完全抗原。

[0101] 对比例2

[0102] 选用公布号CN110045114A的实施例1中记载的啶虫脒半抗原和实施例2的1.1中记载的啶虫脒BSA完全抗原。

[0103] 试验例1 特异性检测

[0104] 选用实施例6、对比例1以及对比例2中涉及的啶虫脒酶联免疫试剂盒，进行特异性检测试验。

[0105] 分别配置吡虫啉、烯啶虫胺、噻虫啉不同浓度标准曲线0μg/L，0.01μg/L，0.03μg/L，0.09μg/L，0.27μg/L，0.81μg/L，使用啶虫脒试剂盒检测，通过吸光光度值得出吡虫啉、烯
啶虫胺、噻虫啉的IC50值，交叉反应率的计算方式如下：

[0106]

[0107] 测得吡虫啉、烯啶虫胺、噻虫啉交叉反应率结果如表1所示：

[0108] 表1 交叉反应率

[0109]

[0110] 由上述试验可看出，与对比例1和2相比，实施例2制备的啶虫脒酶联免疫试剂盒测得的吡虫啉、烯啶虫胺、噻虫啉的交叉反应率均小于1%，明显较小，说明本发明涉及的啶虫
脒酶联免疫试剂盒的特异性较高，实施例1制备的啶虫脒半抗原以及实施例2制备的啶虫脒
BSA完全抗原特异性较强。

[0111] 试验例2 精密度检测

[0112] 选用实施例6、对比例1以及对比例2中涉及的啶虫脒酶联免疫试剂盒，进行精密度检测试验。

[0113] 从实施例6的3个不同试剂盒批次中各抽取10个试剂盒，每个酶标板随即抽取10个微孔测定标准溶液（含1μg/L啶虫脒）的吸光光度值，计算变异系数，结果如表2所示：

[0114] 表2 啶虫脒酶联免疫试剂盒测试的标准溶液浓度和变异系数

[0115]

[0116] 由上述试验可看出，由实施例6制备的啶虫脒酶联免疫试剂盒测试的标准溶液（含1μg/L啶虫脒）的变异系数在6.0‑7.5%之间，说明与对比例1和2相比，实施例6制备的啶虫脒
酶联免疫试剂盒能够有效提高啶虫脒含量检测的准确度。

[0117] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或
基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将
实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说
明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明
内。

[0118] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当
将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员
可以理解的其他实施方式。