抑制G3BP1应激颗粒形成的化合物、制备方法及其用途

摘要

本公开提供了一种化合物(Ⅰ)或其药学上可接受的盐及前药，用于抑制G3BP1应激颗粒的形成，其结构如下：TDRD3蛋白结合物‑连接物‑TDRD3蛋白结合物

权利要求

1.一种化合物或其药学上可接受的盐，结构如下：TDRD3蛋白结合物‑连接物‑TDRD3蛋白结合物(Ⅰ)；

其中，所述TDRD3蛋白结合物的结构为：

所述连接物选自以下至少之一：

‑(CH2‑O‑CH2)3～20、‑CH2‑O‑(CH2‑CH2)3～20‑O‑CH2‑。

2.一种如权利要求1所述的化合物(Ⅰ)或其药学上可接受的盐的制备方法，包括：使用式(Ⅱ)或式(Ⅲ)的TDRD3蛋白结合物与连接物在碱性溶液、有机溶剂中进行反应，得到化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述碱性溶液选自：K2CO3、Na2CO3；所述有机溶剂为：DMF。

4.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)或其药学上可接受的盐在制备抑制细胞中G3BP1应激颗粒形成的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述细胞选自宫颈癌细胞或骨肉瘤细胞。

说明书

抑制G3BP1应激颗粒形成的化合物、制备方法及其用途

技术领域

[0001] 本公开涉及医药技术领域，尤其涉及一种抑制G3BP1应激颗粒形成的化合物、制备方法及其用途。

背景技术

[0002] 细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞内的各种组分如何在正确的时间以及空间上聚集以执行其相应的功能，是细胞在一系列基本的生命活动中需要解决的问题。为
此，细胞进化出了一系列的细胞器，包括有膜包裹的(比如线粒体，细胞核，溶酶体等)和无
膜包裹的细胞器(核仁等)。有膜包裹的细胞器将特定蛋白、核酸等物质包裹起来，以在特定
的空间内执行其功能。另一类是细胞内通过“液‑液相分离”让核糖核蛋白聚集形成无膜包
裹的细胞器，比如核仁、应激颗粒等。

[0003] 当真核细胞在受到热刺激、营养缺乏、氧化应激、紫外辐射和病毒感染等外界胁迫时，细胞会迅速启动其压力应答机制，通常在细胞质中形成颗粒状的mRNA‑蛋白质复合体，
即应激颗粒。应激颗粒的形成具有重要的生理意义，细胞对逆境环境的适应，主要依赖于对
某些促进环境适应和细胞存活的mRNA的选择性翻译以及抑制细胞凋亡相关信号通路等机
制，将逆境压力对细胞造成的损伤最小化，并促进细胞对逆境条件的适应以及在逆境条件
下的存活。

[0004] 研究表明应激颗粒与多种疾病的发生有着密切的关联，包括多种类型的肿瘤、神经退行性疾病、病毒感染等疾病。肿瘤细胞将应激颗粒作为逃脱细胞凋亡、促进细胞存活的
一种工具，从而促进了肿瘤的发生发展。而一些神经退行性疾病中蛋白聚集体可以将应激
颗粒作为凝结起始点，最终将生理型应激颗粒转化病理型的淀粉样蛋白沉积。

[0005] 因此，肿瘤及神经退行性疾病中的应激颗粒异常逐渐成为新型药物靶点，而通过开发应激颗粒抑制剂来阻断肿瘤及神经退行性疾病中异常应激颗粒的形成可能成为一种
新的疾病治疗策略。

发明内容

[0006] 针对上述技术问题，本公开提供了一种抑制G3BP1应激颗粒形成的化合物、制备方法及其用途，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。

[0007] 为了解决上述技术问题，本公开提供了一种化合物，用于抑制G3BP1应激颗粒形成，其结构如下：

[0008] TDRD3蛋白结合物‑连接物‑TDRD3蛋白结合物

[0009] 在其中一个实施例中，上述TDRD3蛋白结合物的结构包括：

[0010]

[0011] 在其中一个实施例中，上述化合物中的连接物为化学连接基团。

[0012] 在其中一个实施例中，上述的化学连接基团包括：3～20个碳原子的直链或支链亚烷基的二溴化合物。

[0013] 在其中一个实施例中，上述直链或支链亚烷基上的一个或多个碳原子被独立基团替换包括以下至少之一：

[0014] ‑O‑、‑NH‑、‑N(CH3)‑、‑CO‑、哌啶、哌嗪、嘧啶、吡啶。

[0015] 在其中一个实施例中，上述的连接物包括以下至少之一：

[0016] ‑(CH2‑O‑CH2)3～20、‑CH2‑O‑(CH2‑CH2)3～20‑O‑CH2‑、‑CH2‑CH2‑CONH‑、‑CH2‑CH2‑CONH‑(CH2)3‑、‑(CH2‑NH‑CH2)3～20、‑(CH2‑CO‑CH2)3～20‑、‑CH2‑CH2‑N(CH3)1～2‑CH2‑、‑CH2‑CH2‑N(CH3)(CH2CH3)‑CH2‑、

[0017]

[0018] 其中R基可选为氢、甲基、烷基、芳基。

[0019] 本公开提供了一种化合物或其药学上可接受的盐及前药的制备方法，包括：使用化合物(Ⅱ)或化合物(Ⅲ)与连接物在碱性溶液、有机溶剂中进行反应，得到本公开的化合
物(Ⅰ)。

[0020] 在其中一个实施例中，上述碱溶液包括：K2CO3、Na2CO3等；上述有机溶剂包括：DMF等。

[0021] 本公开提供了上述化合物或其药学上可接受的盐及前药，在抑制细胞中G3BP1应激颗粒形成的应用。

[0022] 在其中一个实施例中，上述细胞包括宫颈癌、骨肉瘤等。

[0023] 从上述技术方案可以看出，本公开提供的一种抑制G3BP1应激颗粒形成的化合物、制备方法及其用途具有以下至少之一有益效果：

[0024] (1)化合物(Ⅰ)的结构是TDRD3蛋白结合物‑连接物‑TDRD3蛋白结合物，是一种二价态抑制剂，其可以有效阻断TDRD3识别G3BP1的二甲基化修饰的精氨酸，进而抑制细胞内应
激颗粒的形成；

[0025] (2)化合物(Ⅰ)的制备方法简单；

[0026] (3)化合物(Ⅰ)或其药学上可接受的盐及前药，可以抑制宫颈癌、骨肉瘤等细胞内的G3BP1应激颗粒的形成。

附图说明

[0027] 图1A是体外荧光分子标记法检测小分子化合物抑制G3BP1液‑液相分离测试中抑制剂浓度依赖的液‑液相分离效果图；

[0028] 图1B是体外荧光分子标记法检测小分子化合物抑制G3BP1液‑液相分离测试中抑制剂浓度依赖的液‑液相分离抑制效果统计图；

[0029] 图2A是细胞内随抑制剂浓度变化的应激颗粒形成测试图；

[0030] 图2B是细胞内随抑制剂浓度变化的应激颗粒抑制效果统计图。

具体实施方式

[0031] 为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开作进一步的详细说明。

[0032] 应激颗粒和化疗药物的耐药性有重要的关联。G3BP1/2是应激颗粒的核心成分，对多数应激颗粒的形成至关重要，G3BP1/2是亚砷酸盐诱导应激颗粒组装的核心节点蛋白，精
氨酸甲基化是无膜细胞器组装的重要调控因子，在应激情况下，G3BP蛋白的碳末端多位点
精氨酸甲基化，进而招募识别蛋白TDRD3，提高了G3BP蛋白和RNA互作的价态(此处价态定义
为分子间相互作用的最小重复单元，如一个结构域与底物的作用定义为1个价态)，最终促
进了应激颗粒的组装。

[0033] 目前用化疗手段处理肿瘤细胞时，细胞内的翻译暂时中止，mRNA从多聚核糖体脱落，和G3BP1/2蛋白结合，并招募很多其它组分，形成应激颗粒以延长肿瘤细胞的生存时间。
因此应激颗粒的存在会导致细胞在恶劣的环境中生存，当外界刺激去除后，应激颗粒自动
解聚，肿瘤细胞继续翻译进程，所以当前的化疗手段并不能将肿瘤细胞全部杀死，导致肿瘤
细胞总是存在残留，所以肿瘤总是会复发，本公开的化合物(Ⅰ)可以阻断甲基化G3BP1与
TDRD3 Tudor结构域的结合，通过调控应激颗粒的组装进而影响化疗药物治疗癌症的疗效。

[0034] 本公开的实施例提供了一种化合物(Ⅰ)或其药学上可接受的盐及前药，用于抑制G3BP1应激颗粒的形成，其结构如下：TDRD3蛋白结合物‑连接物‑TDRD3蛋白结合物

[0035] 根据本公开的实施例，本公开的化合物(Ⅰ)其包括本文的化合物或其药学上可接受的盐及前药、水合物、溶剂化物、氮氧化物、代谢产物等。

[0036] 根据本公开的实施例，TDRD3蛋白结合物的结构包括：

[0037]

[0038] 根据本公开的实施例，化学连接基团包括：3～20个碳原子的直链或支链亚烷基的二溴化合物。

[0039] 根据本公开的实施例，直链或支链亚烷基上的一个或多个碳原子被独立基团替换包括以下至少之一：‑O‑、‑NH‑、‑N(CH3)‑、‑CO‑、哌啶、哌嗪、嘧啶、吡啶。

[0040] 根据本公开的实施例，连接物包括以下至少之一：‑(CH2‑O‑CH2)3～20、‑CH2‑O‑(CH2‑CH2)3～20‑O‑CH2‑、‑CH2‑CH2‑CONH‑、‑CH2‑CH2‑CONH‑(CH2)3‑、‑(CH2‑NH‑CH2)3～20、‑(CH2‑CO‑CH2)3～20‑、‑CH2‑CH2‑N(CH3)1～2‑CH2‑、‑CH2‑CH2‑N(CH3)(CH2CH3)‑CH2‑、其中R基可选为氢、甲基、烷基、芳基。

[0041] 在本公开的实施例中，化合物(I)或其药学上可接受的盐及前药，可以用于抑制G3BP1应激颗粒的形成。化合物(I)是以TDRD3结合蛋白物‑连接物‑TDRD3蛋白结合物的形式
存在，由于其具有两个重复单元TDRD3蛋白结合物，所以其是一个二价态的应激颗粒抑制
剂，可以有效阻断应激条件下TDRD3对甲基化G3BP1的识别，进而抑制细胞内应激颗粒的形
成。

[0042] 本公开的实施例提供了一种化合物或其药学上可接受的盐及前药的制备方法，包括：使用化合物(Ⅱ)或化合物(Ⅲ)与连接物在碱性溶液、有机溶剂中进行反应，得到本公开
的化合物(Ⅰ)。

[0043] 根据本公开的实施例，碱溶液包括：K2CO3、Na2CO3等；有机溶剂包括：DMF等。

[0044] 在本公开实施例中，使用化合物(Ⅱ)或化合物(Ⅲ)与连接物在碱性溶液、有机溶剂中进行反应，可以制备出本公开的化合物(I)，这种制备方法具有操作简单，易制备的特
点。

[0045] 以下通过具体实施例结合附图对本公开的技术方案做进一步阐述说明。需要注意的是，下述的具体实施例仅是作为举例说明，本公开的保护范围并不限于此。

[0046] 实施例1

[0047] 化合物(Ⅳ)的合成方法

[0048]

[0049] 将二溴化物(512mg，2mmol)和K2CO3(830mg，6mmol)添加到含有N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)的N‑芳基哌啶1(1.2g，5mmol)溶液中，将反应混合物在50℃下搅拌反应24小时。待反
应结束后冷却至室温，用乙酸乙酯稀释反应的混合物，去除混合物中不溶性的杂质，进行初
步提纯；用水和盐水冲洗混合物3次，进一步的提纯。将分离的有机相放置在无水Na2SO4上进
行干燥，溶剂在30℃真空下蒸发。最后，通过快速柱层析纯化残余物，即可得到所需产物
(Ⅳ)(272mg，32％产率)。

[0050] 利用核磁共振对实施例中的化合物(Ⅳ)进行1H NMR和13C NMR的分析，化合物(Ⅳ)的合成鉴定结果如下：

[0051] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J＝2.5Hz,2H),7.40(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),7.06(d,J＝8.8Hz,2H),3.69–3.54(m,12H),3.11–2.99(m,8H),2.71–2.60(m,12H).

[0052] 13C NMR(126MHz,CDCl3)δ144.8,143.2,133.5,126.7,125.8,122.3,70.7,70.5,68.9,57.7,53.4,51.6.

[0053] HRMS(ESI)Calcd.for C28H39Cl2N6O7([M+H]+):641.2252,found:641.2273.

[0054] 实施例2

[0055] 化合物(Ⅴ)的合成方法

[0056]

[0057] 将二溴化物(600mg，2mmol)和K2CO3(830mg，6mmol)添加到含有N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)的N‑芳基二哌啶2(1.77g，5mmol)溶液中，将反应混合物在50℃下搅拌反应24小时。待
反应结束后冷却至室温，用乙酸乙酯稀释反应的混合物，去除混合物中不溶性的杂质，进行
初步提纯；用水和盐水冲洗混合物3次，进一步的提纯。将分离的有机相放置在无水Na2SO4上
进行干燥，溶剂在30℃真空下蒸发。最后，通过快速柱层析纯化残余物，即可得到所需产物
(V)(410mg，24％产率)。

[0058] 利用核磁共振对实施例中的化合物(V)进行1H NMR的分析，化合物(Ⅴ)的合成鉴定结果如下：

[0059] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J＝2.5Hz,2H),7.42(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),7.07(d,J＝8.8Hz,2H),3.52–2.95(m,8H),2.85–2.10(m,48H).

[0060] 本公开的实施例提供了一种化合物(Ⅰ)或其药学上可接受的盐及前药，在抑制细胞中G3BP1应激颗粒形成的应用。

[0061] 根据本公开的实施例，向细胞提供化合物(Ⅰ)或其药学上可接受的盐及前药，通过它们之间的相互接触、作用，可以抑制细胞中G3BP1应激颗粒的形成，其中细胞可选为宫颈
癌、骨肉瘤等细胞。

[0062] 根据本公开的实施例，抑制G3BP1应激颗粒的形成的表现为抑制细胞内部基因的表达(例如，转录)，其可以导致细胞中基因产物(RNA、mRNA、蛋白)的水平降低。

[0063] 根据本公开的实施例，向细胞提供化合物(I)或其药学上可接受的盐及前药，通过它们之间的相互接触、作用，可以诱导细胞凋亡(例如，癌细胞的凋亡)。

[0064] 在本公开的实施例中，向细胞提供本公开的化合物(I)或其药学上可接受的盐及前药，通过细胞与药物之间的相互作用，这种化合物可以抑制细胞内基因的表达，进而可以
抑制宫颈癌、骨肉瘤等细胞中的G3BP1应激颗粒的形成。

[0065] 为了说明本公开实施例中的化合物在抑制细胞中G3BP1应激颗粒形成的应用，进行了相关的活性测试。

[0066] 活性测试

[0067] NMR化学位移扰动测试亲和力(KD)：用NMR HSQC滴定的方法检测小分子化合物(Ⅳ)扰动的蛋白氨基酸残基，并通过剂量相关的信号扰动来检测小分子与蛋白的亲和力。
15 15
用 N标记TDRD3串联Tudor结构域，浓度为0.05mM～0.2mM，小分子化合物(Ⅳ)与 N标记
TDRD3串联Tudor的结构域蛋白的摩尔浓度比在0.0～4.0的范围内，分别进行滴定。使用
500MHz或700MHz的安捷伦核磁谱仪在298K温度下采集18分钟，来完成每个滴定数据点的
HSQC谱图。经测试，采用上述合成路线所合成的产物(Ⅳ)与TDRD3串联结构域的亲和力为5μ
M，结合稳定，可以阻断与其他蛋白的结合、异常信号的转导、代谢路径等生物过程的发挥。

[0068] 体外荧光分子标记法检测液‑液相分离

[0069] 通过与精氨酸(PRMT1)共表达获得甲基化G3BP1 RRM‑RGG区域，然后与Alex‑488荧光分子连接获得荧光标记蛋白。取1.5μL该荧光标记蛋白，与1.5μL TDRD3 Tudor结构域蛋
白的识别蛋白、1μL Trizol法提取的Hela细胞总RNA相混合于载玻片上，加入1μL抑制剂分
子化合物(Ⅳ)，并用硅脂将盖玻片与载玻片粘合防止脱落，在共聚焦显微镜下观察并拍摄
液滴形态。上述样品中蛋白的终浓度为25μM，RNA终浓度为20ng/μL。

[0070] 图1A和图1B是体外荧光分子标记法检测小分子化合物抑制G3BP1液‑液相分离测试图。

[0071] 结合图1A和图1B可知，随着化合物(Ⅳ)抑制剂浓度的增加，图1A中液滴荧光面积在不断减小，图1B中液滴面积占视野面积的比例也在不断的减小，当化合物(Ⅳ)抑制剂浓
度为8μM时，液‑液相分离达到IC50，说明抑制剂阻断了甲基化G3BP1 RRM‑RGG区域与TDRD3 
Tudor结构域的相互作用，抑制了应激颗粒的形成。

[0072] 免疫荧光染色检测细胞内应激颗粒形成

[0073] 采用免疫荧光染色的方法检测化合物对细胞内应激颗粒形成的抑制效果。先将细胞植入到玻片上，接着将0～40μM化合物(Ⅳ)分别滴加入到细胞培养基中并反应1小时，再
加入500μM亚砷酸盐处理细胞1小时诱导细胞内应激颗粒的形成。随后采用4％多聚甲醛固
定细胞15分钟，再用0.2％TritonX‑100通透10分钟，以增加细胞膜的通透性，便于后续操作
中的荧光染料可以进入细胞，接着加入1％BSA封闭30分钟。封闭结束后用鼠源的G3BP1和兔
源的TDRD3一抗共同室温孵育2小时，二抗室温孵育1小时，并用4,6‑二脒基‑2苯基吲哚
(DAPI)染细胞核5分钟，最后用抗淬灭剂DAKO进行封片。

[0074] 用DeltaVision荧光倒置显微镜分别拍摄DAPI通道，GFP通道和TRITC通道观察应激颗粒形成的状况。

[0075] 图2A和图2B是细胞内随抑制剂浓度变化的应激颗粒形成测试图。

[0076] 结合图2A和图2B可知，聚集的G3BP1和TDRD3亮点反映了应激颗粒的形成，随着化合物(Ⅳ)处理浓度的增加，图2A中应激颗粒逐渐变少，图2B中应激颗粒面积占细胞质面积
也在不断的减小，这些结果说明化合物(Ⅳ)可以有效的抑制细胞内的应激颗粒的形成。

[0077] 定义和一般术语

[0078] 本公开所用的术语“盐”是指任何和所有盐，且包括药学上可接受的盐。

[0079] 本公开所用的术语“药学上可接受的盐”是指那些盐，其在合理的医学判断范围内适用于与人和低等动物的组织接触而没有过分毒性、刺激性、过敏性反应等且与合理的利
益/风险比相称，药学上可接受的盐是本领域技术人员所熟知的。本公开化合物的要学上可
接受的盐包括化合物与合适的无机或有机酸(如氢溴酸、盐酸、磷酸、硝酸、对甲苯磺酸、苯
磺酸、硫酸、草酸、柠檬酸)在合适的溶剂中反应得到的盐。化合物(Ⅰ)的药学上可接受的酸
或加成盐包括硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、苯磺酸盐等。

[0080] 本公开所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称
的那些化合物、材料、组合物和剂型。

[0081] 本公开所用的术语“前药”指适用于对患者给药的无过分毒性、刺激性和变态反应等的并且对其应用目的有效化合物(Ⅰ)的形式。药物经过化学结构修饰后得到的体外无活
性或活性较小，在体内经酶或非酶的转化释放处活性药物而发挥药效的化合物。

[0082] 本公开所用的术语“溶剂化物”是指由溶质(本公开中的化合物(Ⅰ)或盐)和溶剂所形成的可变化学计量的复合物。另外，本公开所使用的溶剂不会干扰溶质的生物活性。

[0083] 本公开所用的术语“水合物”指与水结合的化合物，水合物包括化学计量的水合物以及含有不同量的水的组合物。

[0084] 本公开所用的术语“氮氧化物”是指含有氮、氧元素的化合物。

[0085] 本公开所用的术语“代谢产物”是指化合物(Ⅰ)在体内通过代谢过程产生的物质。

[0086] 本公开所用的术语“抑制或抑制剂”是指相对于媒介物，化合物降低、减缓、停止或阻止细胞中具体生物过程的活性的能力。

[0087] 本公开所用的术语“神经性疾病”是指神经系统的任何疾病。

[0088] 本公开所用的术语“基因”是指核酸片段，其表达特定蛋白。

[0089] 本公开所用的术语“癌症”是指恶性肿瘤。

[0090] 以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在
本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护
范围之内。