一种核酸纯化方法

摘要

一种核酸纯化方法，包括：一次纯化步骤，包括将第一磁珠与待测样本混合，磁性分离，取第一上清液，备用；二次纯化步骤，将第一上清液与第二磁珠混合，磁性分离，弃去第二上清液，得到结合有靶核酸分子的磁珠。本发明进行两轮磁珠纯化，污染程度不同的样本，两轮磁珠用量不同，第一轮磁珠可以结合分子量较大的DNA，通过丢弃磁珠去除这部分产物；第二轮磁珠结合剩余产物中所有DNA，达到去除大片段，保留目的片段的目的。

权利要求

1.一种核酸纯化方法，其特征在于，包括：一次纯化步骤，包括将第一磁珠与待测样本混合，磁性分离，取第一上清液，备用；

二次纯化步骤，将所述第一上清液与第二磁珠混合，磁性分离，弃去第二上清液，得到结合有靶核酸分子的磁珠，所述靶核酸分子为小片段核酸分子；

所述待测样本中含有小片段核酸分子、大片段核酸分子；

所述小片段核酸分子的长度为150 500bp；

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所述第一磁珠与待测样本的体积比为（0.05 1）：1；

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所述第二磁珠与所述第一上清液的体积比≥1；

所述小片段核酸分子来源于cfDNA；

所述大片段核酸分子的长度≥1000bp；

所述大片段核酸分子来源于基因组DNA；

所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为90 91%时，所述第~一磁珠与待测样本的体积比为0.05：1；

所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为80 81%时，所述第~一磁珠与待测样本的体积比为（0.05 0.3）：1；

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所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为70 70.5%时，所述~第一磁珠与待测样本的体积比为（0.05 0.4）：1；

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所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为60 65%时，所述第~一磁珠与待测样本的体积比为（0.2 0.5）：1；

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所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为50 50.3%时，所述~第一磁珠与待测样本的体积比为（0.4 0.6）：1；

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所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为40 42%时，所述第~一磁珠与待测样本的体积比为（0.45 0.6）：1；

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所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为30 32%时，所述第~一磁珠与待测样本的体积比为（0.4 0.5）：1；

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所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为20 22%时，所述第~一磁珠与待测样本的体积比为（0.4 0.55）：1；

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所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为10 12%时，所述第~一磁珠与待测样本的体积比为（0.45 0.6）：1。

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2.如权利要求1所述的核酸纯化方法，其特征在于，所述第一磁珠与待测样本的体积比为（0.05 0.6）：1。

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3.如权利要求1所述的核酸纯化方法，其特征在于，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比≥1%。

4.如权利要求1所述的核酸纯化方法，其特征在于，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比≥5%。

5.如权利要求1所述的核酸纯化方法，其特征在于，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比≥10%。

6.如权利要求1所述的核酸纯化方法，其特征在于，所述第二磁珠与所述第一上清液的体积比≥1.5。

7.如权利要求1所述的核酸纯化方法，其特征在于，还包括洗脱步骤，包括从所述结合有靶核酸分子的磁珠上洗脱得到靶核酸分子；

洗脱所使用的洗脱液包含TE缓冲液；

洗脱步骤中，包括将洗脱液与结合有靶核酸分子的磁珠混合，磁性分离后，取上清液，即为含有靶核酸分子的溶液；

洗脱步骤中，先对结合有靶核酸分子的磁珠进行洗涤，弃去上清液，然后将洗脱液与结合有靶核酸分子的磁珠混合；

洗涤时，使用的洗涤剂包含乙醇水溶液；

所述乙醇水溶液的体积百分比为80%；

洗涤的次数为≥1次；

洗涤并弃去上清液后，对结合有靶核酸分子的磁珠进行干燥，然后使用洗脱液对干燥后的磁珠进行洗脱；

所述核酸分子包含DNA；

所述DNA包含双链DNA；

所述待测样本中核酸分子的浓度为1 20μg/μL。

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8.如权利要求7所述的核酸纯化方法，其特征在于，洗涤的次数为1 3次。

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9.如权利要求7所述的核酸纯化方法，其特征在于，洗涤的次数为2次。

10.如权利要求7所述的核酸纯化方法，其特征在于，所述待测样本中核酸分子的浓度为1 14μg/μL。

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说明书

一种核酸纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及核酸纯化技术领域，具体涉及一种核酸纯化方法。

背景技术

[0002] 核酸纯化磁珠的作用原理是基于一种固相载体可逆化固定(SPRI)的分离纯化方法。在一定浓度的PEG和盐离子环境下，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体)，该过程是可逆的，在适当条件下结合的DNA分子可以被洗脱回收。DNA在一定浓度的PEG存在条件下，盐离子促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随磁珠用量的不同，不同长度的DNA可以被选择性地沉淀出来。

[0003] 大片段核酸与磁珠的结合会快于小片段，因而可通过不同比例的磁珠吸附不同大小的片段。通过丢弃上清液中的非目的片段，之后将磁珠吸附的目的DNA洗脱回收，即可达到片段筛选的目的。目前，行业内对混合在小片段中的大片段，筛选的途径只是固定一个比例的磁珠用量，针对于不同污染程度的情况未做磁珠的适配。这样做会导致污染程度较轻时，使用磁珠用量较多，大片段可以去除干净，但会导致目的片段的丢失；如果污染程度较大，磁珠用量少，会导致大片段去除得不干净。

发明内容

[0004] 在一实施例中，提供一种核酸纯化方法，包括：

[0005] 一次纯化步骤，包括将第一磁珠与待测样本混合，磁性分离，取第一上清液，备用；

[0006] 二次纯化步骤，将所述第一上清液与第二磁珠混合，磁性分离，弃去第二上清液，得到结合有靶核酸分子的磁珠。

[0007] 依据上述实施例的核酸纯化方法，本发明进行两轮磁珠纯化，污染程度不同的样本，两轮磁珠用量不同，第一轮磁珠可以结合分子量较大的DNA，通过丢弃磁珠去除这部分产物；第二轮磁珠结合剩余产物中所有DNA，达到去除大片段，保留目的片段的目的。

附图说明

[0008] 图1为小片段质量占比为90％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0009] 图2为小片段质量占比为80％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0010] 图3为小片段质量占比为70％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0011] 图4为小片段质量占比为60％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0012] 图5为小片段质量占比为50％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0013] 图6为小片段质量占比为40％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0014] 图7为小片段质量占比为30％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0015] 图8为小片段质量占比为20％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0016] 图9为小片段质量占比为10％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

具体实施方式

[0017] 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

[0018] 另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

[0019] 本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

[0020] 如本文所用，“游离DNA”(Cell‑Free Circulating DNA，cfDNA)是指来自细胞凋亡或坏死，游离于细胞外的DNA片段，广泛存在于人类的血清、血浆、脑脊液、尿液或唾液当中。

[0021] 在一实施例中，提供一种核酸纯化方法，包括：

[0022] 一次纯化步骤，包括将第一磁珠与待测样本混合，磁性分离，取第一上清液，备用；

[0023] 二次纯化步骤，将所述第一上清液与第二磁珠混合，磁性分离，弃去第二上清液，得到结合有靶核酸分子的磁珠。

[0024] 在一实施例中，所述第一磁珠与待测样本的体积比为(0.05～1)：1，优选为(0.05～0.6)：1。

[0025] 在一实施例中，所述待测样本中含有小片段核酸分子、大片段核酸分子。

[0026] 在一实施例中，所述小片段核酸分子是指长度为150～500bp的核酸分子。

[0027] 在一实施例中，所述小片段核酸分子一般来源于cfDNA。

[0028] 在一实施例中，所述大片段核酸分子的长度≥1000bp。

[0029] 在一实施例中，所述大片段核酸分子一般是指来源于基因组DNA的核酸分子。

[0030] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比≥1％。

[0031] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比≥5％。

[0032] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的占比≥10％。

[0033] 在一实施例中，所述第二磁珠与所述第一上清液的体积比≥1。即第二磁珠的体积为第一上清液体积的1倍以上。

[0034] 在一实施例中，所述第二磁珠与所述第一上清液的体积比≥1.5。即第二磁珠的体积为第一上清液体积的1.5倍以上。

[0035] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为90～91％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.05～0.3：1。

[0036] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为80～81％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.05～0.3：1。

[0037] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为70～70.5％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.05～0.4：1。

[0038] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为60～65％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.2～0.5：1。

[0039] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为50～50.3％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.4～0.6：1。

[0040] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为40～42％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.45～0.6：1。

[0041] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为30～32％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.4～0.5：1。

[0042] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为20～22％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.4～0.55：1。

[0043] 在一实施例中，所述小片段核酸分子在所述待测样本所有核酸分子中的质量占比为10～12％时，所述第一磁珠与待测样本的体积比为0.45～0.6：1。

[0044] 在一实施例中，还包括洗脱步骤，包括从所述结合有靶核酸分子的磁珠上洗脱得到靶核酸分子。

[0045] 在一实施例中，洗脱所使用的洗脱液包含TE缓冲液。

[0046] 在一实施例中，洗脱步骤中，包括将洗脱液与结合有靶核酸分子的磁珠混合，磁性分离后，取上清液，即为含有靶核酸分子的溶液。

[0047] 在一实施例中，洗脱步骤中，先对结合有靶核酸分子的磁珠进行洗涤，弃去上清液，然后将洗脱液与结合有靶核酸分子的磁珠混合。

[0048] 在一实施例中，洗涤时，使用的洗涤剂包含乙醇水溶液。

[0049] 在一实施例中，所述乙醇水溶液的体积百分比为80％。

[0050] 在一实施例中，洗涤的次数为≥1次，优选为1～3次，更优选为2次。

[0051] 在一实施例中，洗涤并弃去上清液后，对结合有靶核酸分子的磁珠进行干燥，然后使用洗脱液对干燥后的磁珠进行洗脱。

[0052] 在一实施例中，所述核酸分子包含DNA。

[0053] 在一实施例中，所述DNA包含双链DNA。

[0054] 在一实施例中，所述待测样本中核酸分子的浓度为1～20μg/μL，优先为1～14μg/μL。待测样本中核酸分子的浓度可以通过Qubit检测或酶标仪检测等方法检测得到。

[0055] 在一实施例中，所述磁珠为用于纯化核酸的磁珠。可以从市场上购买得到。

[0056] 在一实施例中，本发明针对不同程度污染的片段所使用的磁珠用量做出调整。

[0057] 在一实施例中，本发明进行两轮磁珠纯化(污染程度不同的样本两轮磁珠用量不同)，第一轮磁珠可以结合分子量较大的DNA，通过丢弃磁珠去除这部分产物；第二轮磁珠结合剩余产物中所有DNA，经乙醇漂洗后，使用一定体积的TE缓冲液将DNA进行洗脱回收，达到去除大片段，保留目的片段的目的。有效解决小DNA分子中去除大片段核酸分子时，磁珠比例选择不当，造成大分子核酸分子去除不彻底或造成小分子核酸分子丢失的问题。

[0058] 以下实施例使用不同污染程度的样本进行实验，实验条件及所用试剂均相同。

[0059] 以下实施例中，如无特别说明，“室温”是指23℃±2℃。

[0060] 以下实施例中，如无特别说明，“80％乙醇”均是指体积百分浓度为80％的乙醇，亦称“80％V/V乙醇”，是由乙醇与NF‑H2O(无核酸酶水，亦称Nuclease‑Free Water)按照80:20的体积比配制而成。

[0061] 以下实施例中，如无特别说明，TE缓冲液的组成如下：10mM Tris‑HCl、1mM EDTA，pH＝8.0。

[0062] 以下实施例中，小片段核酸分子是指来源于cfDNA的长度为150～500bp的核酸分子。

[0063] 以下实施例中，大片段核酸分子是指基因组DNA，长度一般在1000bp以上。

[0064] 以下实施例中，磁珠生厂商：翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号：12601ES75；具体为羧基修饰的磁珠。

[0065] 以下实施例中，样本为提取得到的血浆游离DNA(cfDNA)样本，浓度范围为1～14μg/μL。

[0066] 各实施例的样本中核酸分子的浓度具体如表1所示。

[0067] 表1

[0068]实施例 小片段质量占比 Qubit检测浓度(μg/μL)
实施例1 90.58％ 8.042
实施例2 80.34％ 3.148
实施例3 70.42％ 3.72
实施例4 60.06％ 1.356
实施例5 50.3％ 3.54
实施例6 40.16％ 5.66
实施例7 30.50％ 3.367
实施例8 21.24％ 2.509
实施例9 11.69％ 13.7

[0069] 表1中的小片段质量占比为Labchip原始检测结果，具体为Labchip结果显示的该片段下核酸总量占所有片段的比例，体现为各片段的质量占比。

[0070] 以下实施例中，各样本中小片段质量占比表述为接近实际质量占比的整十数，例如，实施例1的样本中小片段质量占比接近于90％，因此，表述为“90％”，其他实施例中的样本中小片段质量占比表述方式与此同理。

[0071] 实施例1

[0072] 选择小片段质量占比为90％的样本，设置0.3X/1.5X、0.2X/1.5X、0.1X/1.5X、0.05X/1.5X四组磁珠比例进行纯化。

[0073] 磁珠用量“0.3X/1.5X”是指：第一次磁珠体积用量为样本体积100μL的0.3倍，即30μL，第二次磁珠体积用量为第一次纯化上清液体积130μL的1.5倍，即195μL。其他组的磁珠比例含义与此同理。

[0074] 具体操作步骤如下：

[0075] 步骤1：提前从4℃冰箱取出购买的纯化磁珠，室温平衡至少半小时，使用前需充分振荡混匀。

[0076] 步骤2：取四份相同体积量的上清液(除脑脊液外)，提取DNA，使用TE缓冲液，全部补充体积至100μL，分别加入5μL、10μL、20μL、30μL纯化磁珠，涡旋混匀(Vortex)30秒。

[0077] 步骤3：室温静置(磁力架外静置)5min，同时准备4个新1.5mL离心管，管中分别加入157.5μL、165μL、180μL、195μL的纯化磁珠(1个样本对应1个离心管)。

[0078] 步骤4：瞬离，磁力架静置3min至上清液澄清。

[0079] 步骤5：吸取全部上清液，加入提前准备好的含不同体积纯化磁珠的新1.5mL离心管中，涡旋混匀30秒。由于吸取的是上清液，因此，大片段核酸分子随磁珠被去除。

[0080] 步骤6：室温静置(磁力架外静置)10min，同时准备新制备的80％乙醇。

[0081] 步骤7：瞬离，磁力架静置3min至上清液澄清。

[0082] 步骤8：丢弃全部上清液(使得150bp以下的小片段被丢弃)，加入500μL新制备的80％乙醇，静置30秒。

[0083] 步骤9：丢弃全部上清液(使得150bp以下的小片段被丢弃)，再加入500μL新制备的80％乙醇，静置30秒。

[0084] 步骤10：丢弃全部上清液(使得150bp以下的小片段被丢弃)，磁力架上取下并全速瞬离10秒，置于磁力架上开盖室温干燥3～5min(随时观察干燥程度，避免磁珠过干)。

[0085] 步骤11：当磁珠呈现哑光面，从磁力架取下并加入10μL TE缓冲液，涡旋混匀30秒(确保磁珠全部洗脱)。

[0086] 步骤12：室温静置5min，瞬离，磁力架静置3min至上清液澄清后，将全部上清液加入对应的新1.5mL离心管中。

[0087] 步骤13：对完成磁珠双选的样本进行Qubit定量并送检Labchip。

[0088] 图1为本实施例中小片段占比90％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。

[0089] 图1中，0.05X/1.5X‑1、0.05X/1.5X‑2是指0.05X/1.5X这一纯化比例做了两组平行实验。

[0090] 图1中，6000bp附近的长片段表示labchip的一个mark。

[0091] 结果显示，0.05X/1.5X这组磁珠可以将此样本的大片段去除干净，并且目的片段可以很好的保留下来。

[0092] 实施例2

[0093] 选择小片段占比80％的样本，设置0.3X/1.5X、0.2X/1.5X、0.1X/1.5X、0.05X/1.5X四组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0094] 图2为本实施例中小片段占比80％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，0.05X/1.5X这组磁珠可以将此样本的大片段去除干净，并且目的片段可以很好的保留下来。

[0095] 实施例3

[0096] 选择小片段占比70％的样本，设置0.4X/1.5X、0.3X/1.5X、0.2X/1.5X、0.1X/1.5X、0.05X/1.5X五组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0097] 图3为本实施例中小片段占比70％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，此类样本磁珠用量为0.05X/1.5X时，可以将大片段去除干净且可以保留目的片段。

[0098] 实施例4

[0099] 选择小片段占比60％的样本，设置0.5X/1.5X、0.4X/1.5X、0.3X/1.5X、0.25X/1.5X、0.2X/1.5X、0.1X/1.5X六组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0100] 图4为本实施例中小片段占比60％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，磁珠用量为0.2X/1.5X时，可以达到去除大片段保留目的片段的目的。

[0101] 实施例5

[0102] 选择小片段占比50％的样本，设置0.6X/1.5X、0.5X/1.5X、0.4X/1.5X、0.35X/1.5X、0.3X/1.5X五组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0103] 图5为本实施例中小片段占比50％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，磁珠用量为0.4X/1.5X时，可以将此样本的大片段去除干净且保留目的片段。

[0104] 实施例6

[0105] 选择小片段占比40％的样本，设置0.6X/1.5X、0.5X/1.5X、0.4X/1.5X、0.45X/1.5X四组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0106] 图6为本实施例中小片段占比40％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，磁珠用量为0.45X/1.5X时，可以将大片段去除干净，且保留目的片段。

[0107] 实施例7

[0108] 选择小片段占比30％的样本，设置0.5X/1.5X、0.45X/1.5X、0.4X/1.5X三组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0109] 图7为本实施例中小片段占比30％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，磁珠用量为0.5X/1.5X时，可以将大片段去除干净，且保留目的片段。

[0110] 实施例8

[0111] 选择小片段占比20％的样本，设置0.55X/1.5X、0.45X/1.5X、0.4X/1.5X三组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0112] 图8为本实施例中小片段占比20％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，磁珠用量为0.45‑0.55X/1.5X时，可以将大片段去除干净，且保留目的片段。

[0113] 实施例9

[0114] 选择小片段占比10％的样本，设置0.6X/1.5X、0.5X/1.5X、0.45X/1.5X三组磁珠比例进行纯化。具体操作步骤参照实施例1进行，只调整磁珠比例。

[0115] 图9为本实施例中小片段占比10％的样本去除大片段的磁珠用量结果图。结果显示，磁珠用量为0.6X/1.5X时，可以将大片段去除干净，且保留目的片段。

[0116] 在一实施例中，不同污染程度样本磁珠用量不同，减少磁珠用量的同时去除大片段可以达到提高建库成功率且节约成本。

[0117] 在一实施例中，本发明针对不同的样本使用不同用量的磁珠，能满足不同污染程度样本的纯化，例如污染较轻样本磁珠用量相应减少，污染程度较大的样本磁珠用量相应增加。

[0118] 以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。