抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体、该单克隆抗体的识别区域及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS‑CoV）N蛋白单克隆抗体。本发明将全长N蛋白基因克隆至pET32a载体中，构建出原核表达重组质粒pET32a‑N，通过诱导表达、蛋白纯化获得纯化的N蛋白。将纯化的N蛋白免疫Balb/c小鼠，随后取免疫鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，筛选获得两个抗N蛋白的单克隆抗体，分别命名为4B10和6E8。通过截短表达，发现该抗体能特异性识别并结合N蛋白的N端区域，4B10和6E8识别区域是64～84aa。本发明提供的上述单克隆抗体，可利用基因工程或蛋白质工程方法获得。该抗体能特异性识别SADS‑CoV，对病毒还具有中和活性，为探究SADS‑CoV致病机制的研究、早期检测试剂盒和治疗性抗体的开发提供了新的原材料。

权利要求

1.抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区；其特征在于，A：所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3，单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3；

B：所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3；单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，

A：抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

B：抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

3.编码权利要求2所述抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的DNA，其特征在于，A：所述编码抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:15所示，编码抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:19所示；

B：编码抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:16所示；编码抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:20所示。

4.权利要求1所述的抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体在制备治疗猪急性腹泻综合征冠状病毒感染药物中的应用。

5.一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含有权利要求3所述的DNA。

6.一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有权利要求5所述的重组表达载体。

说明书

抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体、该单克隆抗

体的识别区域及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS‑CoV)N蛋白单克隆抗体、该单克隆抗体的识别区域及其应用。

背景技术

[0002] 猪急性腹泻综合征(swine acute diarrhea syndrome，SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS‑CoV)引起的一类急性传染病。临床表现主要有感染仔猪急性腹泻、呕吐，5日龄内新生仔猪由于体重骤减和严重脱水而迅速死亡，且死亡率高达90％。猪肠道冠状病毒，与蝙蝠来源的HKU2核苷酸序列同源性达到90％以上。由于至今仍无有效的SADS疫苗和抗病毒药物问世，目前防控该病主要措施就是控制传染源和切断潜在的传播途径。

[0003] 冠状病毒(coronaviruses,CoVs)是具有囊膜的、单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)。SADS‑CoV基因组大小约为27kb，5′端有帽子结构，3′端有Poly(A)尾。基因组由5′非编码区(UTR)，9个开放阅读框(ORFs)和3′UTR区组成。5′端2/3基因组是ORF1a和ORF1b，编码16个非结构蛋白(nsp1‑16)。3′端1/3基因组序列包括7个ORF，编码4个结构蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)；在S和E蛋白间有一个ORF3；N后面有两个重叠的ORFs，编码非结构蛋白NS7a和NS7b。N基因编码区长度为1128个碱基，共编码375个氨基酸，蛋白分子质量约为41.7ku。N蛋白是一个核质穿梭蛋白，是血清抗体的主要结合位点，有着良好的免疫原性。由于N蛋白保守性好，且在病毒感染的整个过程中均能大量表达，因此，可以作为病毒诊断候选蛋白。

发明内容

[0004] 本发明提出了一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体，并确定了该单克隆抗体识别N蛋白的区域以及该单克隆抗体的应用。

[0005] 本发明第一方面，提供一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区；

[0006] 所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6所示的CDR3；本发明制备的单克隆抗体4B10的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3，本发明制备的单克隆抗体6E8的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3。

[0007] 轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12所示的CDR3。本发明制备的单克隆抗体4B10的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:
7所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3，本发明制备的单克隆抗体6E8的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的CDR3。

[0008] 抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示；抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示。

[0009] 本发明第二方面提供一种编码所述抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体重链可变区和轻链可变区DNA序列。

[0010] 编码抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体重链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示；编码抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示。

[0011] 所述的抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体重链恒定区为IgG1或IgG2a型。

[0012] 所述的抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体轻链恒定区为Kappa型。

[0013] 本发明第三方面，提供一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体能够特异性识别猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白的区域；上述抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体能够特异性识别猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白的N端区域为SEQ ID NO:21所示序列。

[0014] 本发明第四方面，提供一种抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备方法，通过将猪急性腹泻综合征冠状病毒N基因克隆到pET‑32a载体中构建出了原核表达载体，利用不同浓度咪唑洗脱的方式纯化蛋白，将纯化后的N蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，将细胞上清进行间接ELISA和间接免疫荧光验证，筛选得到阳性克隆，经过三次亚克隆后，将杂交瘤细胞注射小鼠进行腹水的制备，最后将得到的腹水进行纯化，得到抗猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体。

[0015] 本发明第五方面，提供猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白单克隆抗体在制备治疗猪急性腹泻综合征冠状病毒感染药物中的应用。

[0016] 本发明的有益效果为：

[0017] 本发明利用原核表达系统表达并纯化重组SADS‑CoV N蛋白，以此作为免疫源免疫小鼠，通过细胞融合和亚细胞筛选，成功获得两个针对N蛋白的单克隆抗体。将N基因截短表达，发现该抗体能特异性识别并结合N蛋白的N端区域。具体的，能够特异性的识别并结合N蛋白的N端区域的64～84aa，为探究N蛋白的功能提供了可靠的研究工具。

[0018] 本发明提供的单克隆抗体，可以利用常规基因工程或蛋白质工程的方法获得，避免了杂交瘤细胞长期冻存抗体丢失，同样也有利于抗体在基因和蛋白水平上进行优化，进而提高抗体的特异性和亲和力。

[0019] 本发明制备的单克隆抗体能够特异性识别并中和猪急性腹泻综合征冠状病毒，因此，该抗体为探究SADS‑CoV致病机制的研究、早期检测试剂盒和治疗性抗体的开发提供了新的原材料。

附图说明

[0020] 图1为SADS‑CoV N基因PCR扩增及pET32a‑N重组质粒酶切鉴定结果；

[0021] A.M:DL2000相对分子质量标准；1:N基因，大小约为1000bp；2：对照水。

[0022] B.M:DL5000相对分子质量标准；1：pET32a‑N重组质粒用BamHI和XhoI双酶切。

[0023] 图2为pET32a‑N重组蛋白表达及纯化结果；

[0024] A.M：蛋白Marker；1：pET32a‑N诱导前；2：pET32a‑N裂解上清；3：pET32a‑N裂解后沉淀；

[0025] B.M：蛋白Marker；1～2：纯化后的pET32a‑N蛋白。

[0026] 图3为N蛋白免疫后ELISA检测小鼠抗体效价；

[0027] 1～3：1、2和3号免疫鼠，NC：阴性对照。

[0028] 图4为IFA鉴定单克隆抗体的反应性；

[0029] A.4B10单克隆抗体；

[0030] B.6E8单克隆抗体；

[0031] C.SP2/0细胞培养液。

[0032] 图5为Western blot鉴定单克隆抗体的反应性；

[0033] A.4B10单克隆抗体；

[0034] B.6E8单克隆抗体。

[0035] M：蛋白Marker，1：pET32a‑N纯化蛋白；2：Huh7细胞对照；3：SADS‑CoV感染Huh7细胞。

[0036] 图6为亚类鉴定结果。

[0037] 图7为4B10和6E8单克隆抗体10、20和40倍稀释后与0.01MOI的SADS‑CoV病毒中和结果；

[0038] 图8为抗体识别N蛋白区域鉴定结果；

[0039] A.N蛋白截短表达示意图；

[0040] B.R1和R2区诱导表达SDS‑PAGE鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1诱导前；2：R1裂解上清；3：R1裂解沉淀；4：R2诱导前；5：R2诱导后。

[0041] C.4B10 western blot鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1表达菌；2：R2表达菌。

[0042] D.6E8 western blot鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1表达菌；2：R2表达菌。

[0043] E.R1.1和R1.2区诱导表达SDS‑PAGE鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1.1诱导前；2：R1.1诱导后；3：R1.2诱导前；4：R1.2诱导后。

[0044] F.4B10 western blot鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1.1表达菌；2：R1.2表达菌。

[0045] G.6E8 western blot鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1.1表达菌；2：R1.2表达菌。

[0046] H.R1.2.1和R1.2.2区诱导表达SDS‑PAGE鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1.2.1诱导前；2：R1.2.1诱导后；3：R1.2.2诱导前；4：R1.2.2诱导后。

[0047] I.4B10 western blot鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1.2.2表达菌；2：R1.2.1表达菌。

[0048] J.6E8 western blot鉴定结果。M：蛋白marker；1：R1.2.1表达菌；2：R1.2.2表达菌。

[0049] 图9为可变区PCR扩增结果；

[0050] A.重链可变区PCR扩增结果。M：DL2000 marker；1：水对照；2：4B10重链可变区PCR扩增；3：6E8重链可变区PCR扩增。

[0051] B.轻链K可变区PCR扩增结果。M：DL2000 marker；1：水对照；2：4B10轻链可变区PCR扩增；3：6E8轻链可变区PCR扩增。

具体实施方式

[0052] 下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

[0053] SADS‑CoV GDS04毒株由中山大学曹永长教授馈赠。

[0054] 1.SADS‑CoVN蛋白重组质粒的构建、表达、纯化

[0055] 1.1 pET32a‑N重组质粒的构建

[0056] 以SADS‑CoV GDS04毒株N蛋白(Genbank登录号：MF167434.1)为参考，设计特异性引物，上游P1：5′‑CGCGGATCCATGGCCACTGTTAATTGG‑3′，下游P2：5′‑CCGCTCGAGCTAATTAATAATCTCATC‑3′，在上下游引物5′端引入BamHI与XhoI酶切位点(下划线部分)。引物合成后，以SADS‑CoV GDS04毒株cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：
PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA 1μL，ddH2O补至50μL。反应程序为：
98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。按Omega公司EZNAGel Extraction Kit的使用说明书进行胶回收。

[0057] N基因PCR胶回收产物与pET32a载体用BamHⅠ与XhoI双酶切后，进行连接、转化DH5α感受态细胞。将构建好的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切鉴定为阳性的质粒再进行测序鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a‑N。

[0058] 1.2N重组蛋白的诱导表达与纯化

[0059] 将重组质粒pET32a‑N转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落于5mL氨苄抗性的LB中，待OD600约为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导后5h，12000rpm离心2min收集沉淀，沉淀用适量的PBS重悬后，进行超声处理5min(超3s，停3s)，超声后4℃，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。取上清液和沉淀加入5×loading buffer，沸水中煮沸10min，进行SDS‑PAGE鉴定。

[0060] 按照上述方法扩大pET32a‑N蛋白的诱导表达量，取超声后裂解上清，进行镍柱纯化。具体操作步骤如下：

[0061] 1)装树脂：取一个空柱，加入2mL镍柱NTA树脂，待保存液下降至树脂表面时，用5倍柱体积蒸馏水清洗柱子一次，然后用5倍柱体积平衡液(20mM Tris‑HCl，500mM NaCl，5mM咪唑，pH7.4)对柱子进行平衡；

[0062] 2)上样：待平衡液降至树脂表面时，加入3mL含重组蛋白的裂解上清，重复上样2～3次，每次作用2min，收集样品流穿液；加入5倍柱体积的平衡液冲洗柱子1次；

[0063] 3)蛋白洗脱：用平衡液配置不同浓度咪唑(25mM，50mM，75mM，100mM，150mM，200mM和300mM)对蛋白样品进行洗脱，每次1mL，每个浓度重复两遍，其目的是为了确定咪唑的最佳洗杂和蛋白洗脱浓度；

[0064] 4)柱子清洗及保存：5倍体积的0.5M的NaOH冲洗柱子一次，然后用蒸馏水冲洗一次，随后加入适量的70％无水乙醇，置4℃冰箱保存。每次收集的样品进行SDS‑PAGE鉴定。

[0065] 2动物免疫

[0066] 选取6W龄雌性BALB/c小鼠3只，将纯化的N重组蛋白按30μg/只的量免疫小鼠。首次免疫，将N蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后进行乳化，采用多点皮下注射小鼠(背部一个点，腹部两个点)。每隔2W进行加强免疫，共免疫四次，加强免疫是将N重组蛋白和弗氏不完全佐剂等体积混匀进行乳化，免疫方法同首次免疫。四免后7d尾部采血测定抗体效价。

[0067] 3 ELISA方法检测多克隆抗体效价

[0068] 将SADS‑CoV病毒液与包被液1:1稀释包被ELISA板，50μL/孔，4℃过夜包被，用PBST洗四次后，加入2％海藻糖4℃封闭10h。将阳性血清和阴性血清用PBST倍比稀释，稀释梯度从1:100至1:12800，稀释8个梯度，37℃作用1h，PBST洗四次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:20000稀释)，PBST洗四次后，TMB显色，置酶标仪上测定OD450。

[0069] 4单克隆抗体的制备

[0070] 具体操作步骤如下：

[0071] (1)制备饲养层细胞：将HAT培养液注射小鼠腹腔，慢慢反复抽吸，液体吸出后，铺于96孔板中。

[0072] (2)细胞融合：将脾细胞和适量的SP20细胞在融合剂PEG作用下进行细胞融合。融合后的细胞铺于含有饲养层细胞的96孔板中。

[0073] (3)阳性克隆的筛选：

[0074] a)间接ELISA检测方法，将纯化的N蛋白包被ELISA板，检测融合细胞分泌抗体的情况。

[0075] b)间接免疫荧光(IFA)检测方法，将ELISA抗体阳性细胞孔中的上清，加入SADS‑CoV感染Huh 7细胞，然后加入FITC标记的山羊抗鼠IgG，反应完毕后置荧光显微镜下观察结果。

[0076] (4)阳性杂交瘤细胞的亚克隆：选取ELISA和IFA阳性孔，采用有限稀释法对筛选到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清，利用上述ELISA和IFA方法进行抗体检测。阳性细胞进入下一轮的亚克隆，共进行三次。

[0077] (5)腹水的制备：取10～12W的Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂5
0.5mL，1W后每只小鼠腹腔注射5×10 个杂交瘤细胞(0.2mL)，7～10天后，鼠体腹腔明显隆起，采集腹水，ELISA检测其效价，分装，‑80℃保存。

[0078] (6)腹水的纯化：按照PIERCE公司NAbTM Protein G Spin Purification Kit进行亲和层析纯化，后经SDS‑PAGE电泳鉴定纯度。

[0079] 5单克隆抗体的鉴定

[0080] (1)特异性鉴定：包括ELISA、IFA及Western blot验证。

[0081] a)ELISA验证：将纯化的N蛋白及His标签的无关蛋白(2μg/mL)用包被液稀释后包被ELISA板，50μL/孔，4℃过夜包被，用PBST洗四次后，加入2％海藻糖4℃封闭10h。将单克隆抗体加入N蛋白及His标签的无关蛋白包被板，37℃作用1h，PBST洗四次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:20000稀释)，PBST洗四次后，TMB显色，置酶标仪上测定OD450。

[0082] b)IFA验证：将SADS‑CoV感染Huh7细胞，病毒感染后36h，用多聚甲醛固定细胞，细胞固定后，腹水用PBS稀释(500倍)加入病毒感染细胞，随后孵育FITC‑抗鼠二抗(100倍稀释)，待反应结束后置荧光显微镜下观察。

[0083] c)Western blot验证：取纯化的N蛋白或收集病毒感染和未感染的Huh7细胞跑SDS‑PAGE，随后将蛋白胶转移至NC膜上，进行werstern blot验证。一抗为单克隆抗体，二抗为HRP‑抗鼠IgG。

[0084] (2)亚类鉴定：按照Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明对所获得的单抗进行抗体亚类鉴定。

[0085] (3)中和活性鉴定：腹水按不同比例(10、20和40倍)稀释后与等体积的0.01MOI的SADS‑CoV混合，在37℃孵育1h，随后加入铺满单层的96孔板的Huh7细胞，每孔100μL。48h后用4％的多聚甲醛固定细胞，进行IFA验证。

[0086] (4)表位鉴定：将N基因截短后克隆至原核表达载体上，诱导表达后跑SDS‑PAGE，并将其转移至NC膜上，通过Western blot验证单克隆抗体的反应性，从而确定单克隆抗体识别的抗原表位。

[0087] 6单克隆抗体可变区基因PCR扩增与序列测定

[0088] 首先提取单克隆抗体杂交瘤细胞RNA，利用Oligo‑dt或随机引物分别将其逆转录合成cDNA(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA，6210A)。

[0089] 抗体可变区基因采用套式PCR扩增。首先以上述cDNA为模板，利用第一轮鼠源抗体IgG1及κ轻链引物扩增抗体可变区基因，然后以第一轮产物为模板，利用第二轮鼠源抗体IgG1及κ轻链引物扩增抗体可变区基因。PCR反应体系为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA 1μL，ddH2O补至50μL。反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。抗体可变区基因扩增的引物参照文献(von Boehmer,L.,Liu,C.,Ackerman,S.,Gitlin,A.D.,Wang,Q.,Gazumyan,A.,Nussenzweig,M.C.,2016.Sequencing and cloning of antigen‑specific antibodies from mouse memory B cells.Nature protocols 11,1908‑1923.)

[0090] 扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，重链、κ轻链可变区基因大小约为300bp，切胶回收目的片段。将回收的目的片段插入pMD‑19T载体中，进行序列测定。

[0091] 7结果

[0092] 7.1 N基因的扩增及重组质粒的构建

[0093] 以SADS‑CoV cDNA为模板扩增N基因，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图1A所示，N片段大小约为1000bp。

[0094] N基因PCR胶回收产物与pET32a载体用BamHⅠ与XhoI双酶切后，进行连接、转化DH5α感受态细胞。将构建好的重组质粒pET32a‑N进行双酶切鉴定，酶切结果如图1B所示，双酶切产物在5000bp以上(载体条带)及在1000bp左右(目的片段)处均出现条带，与预期相符。将酶切鉴定为阳性的质粒进行测序鉴定，测序结果与目的序列一致。

[0095] 7.2 N重组蛋白的诱导表达与纯化

[0096] 重组质粒pET32a‑N转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达，诱导产物超声处理后进行SDS‑PAGE鉴定，结果显示pET32a‑N在上清和沉淀中均有表达(图2A)，说明N蛋白有部分是可溶性的，因此，采用镍柱纯化方法对该蛋白进行纯化。由图2B可见，获得了纯度较高的N蛋白。

[0097] 7.3 ELISA检测多克隆抗体的效价

[0098] 纯化的N重组蛋白免疫Balb/c小鼠，共免疫四次，随后进行抗体效价检测。用SADS‑CoV灭活后的病毒液包被ELISA板，检测抗体效价，以未免疫小鼠血清作为阴性对照(NC)，结果显示，血清1:12800稀释时，1、2和3号免疫鼠OD450/NC>2.0，说明该抗体效价能达到1:12800以上(图3)。

[0099] 7.4单克隆抗体特异性鉴定

[0100] 通过细胞融合技术，筛选得到特异性识别SADS‑CoVN蛋白的单克隆抗体，将其命名为4B10和6E8。ELISA鉴定结果显示，这两株单抗均与N蛋白有反应，而与His标签的无关蛋白无反应，说明筛到的单克隆抗体是特异性识别N蛋白的(表1)。IFA结果显示，4B10和6E8作用SADS‑CoV感染的Huh7细胞能够检测到特异性的绿色荧光信号(图4A和B)，而SP2/0细胞上清液作用SADS‑CoV感染细胞未见荧光信号(图4C)。Westernblot结果显示，4B10和6E8均能识别纯化的N蛋白以及病毒感染细胞中的N蛋白(图5A和B)。

[0101] 表1单克隆抗体ELISA检测结果

[0102]

[0103] 7.5单克隆抗体亚类鉴定

[0104] 按照小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对4B10和6E8单抗进行亚型鉴定，鉴定结果显示，4B10单抗重链恒定区为IgG1型，6E8为IgG2a型，它们的轻链恒定区为Kappa型(图6)。

[0105] 7.6单克隆抗体中和活性鉴定

[0106] 为了验证4B10和6E8是否具有中和病毒的能力，首先，将收集到的腹水以不同比例进行稀释(10、20和40倍)，随后与0.01MOI的SADS‑CoV等体积混合。通过IFA验证，可以看出4B10和6E8均能中和病毒，且与腹水呈剂量依赖关系，稀释倍数越低中和能力越强(图7)。

[0107] 7.7单克隆抗体识别N蛋白区域的鉴定

[0108] 为了鉴定单克隆抗体识别N蛋白的区域，将N蛋白进行如图8A所示的截短重组质粒，分别命名为R1，R2，R3，R1.1和R1.2区。将R3区插入原核表达载体pET32a中并不能诱导表达该蛋白，而R1和R2区域均能表达(图8B)。Western blot结果显示，4B10和6E8单抗识别R1区，不能识别R2区(图8C和D)。接着又将R1区进行截短表达(图8E)，Western blot结果显示，4B10和6E8能识别R1.1和R1.2区(图8F和G)，说明4B10和6E8识别N蛋白的区域是R1.1和R1.2这两个区域重叠的部分，即43～95aa。将R1.2区进一步截短表达(图H)，如图8I和J所示，
4B10和6E8只与R1.2.1有反应，而与R1.2.2无反应，因此，4B10和6E8单抗识别区域是与R1.2.2不重叠的部分，即64～84aa，如SEQ ID NO:21所示。

[0109] 7.8单克隆抗体可变区PCR扩增

[0110] 从4B10和6E8杂交瘤细胞cDNA中扩增得到大小约为300bp的PCR产物(图9)，与预期扩增产物大小一致；切胶回收后，克隆至pMD19T载体测序。将测序结果与抗体基因库(IMGT)进行比对分析，测序结果证实扩增得到的序列为单克隆抗体的重链可变区的DNA序列和轻链可变区的DNA序列。具体的，编码鼠抗SADS‑CoV N蛋白单克隆抗体4B10的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:15所示；编码鼠抗SADS‑CoV N蛋白单克隆抗体4B10的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:19所示。编码鼠抗SADS‑CoV N蛋白单克隆抗体6E8的重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:16所示；编码鼠抗SADS‑CoV N蛋白单克隆抗体6E8的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO:20所示。

[0111] 以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。