一种产蔗糖磷酸化酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明提供了一种产蔗糖磷酸化酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用，本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2菌株从从广西来宾甘蔗地的土壤中分离而得，其保藏编号为CCTCC NO：M2021698，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，该菌株具有较高产酶活力，且产蔗糖磷酸化酶稳定性好，该菌产酶的酶活达98.4U/mL，利用该菌产酶转化制备AA‑2G产量达到13.16g/L。

权利要求

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株SLLSM2，其保藏编号为CCTCC NO：M2021698，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

2.包含如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株SLLSM2的微生物制剂。

3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有活菌数不低于8

1.0×10个/mL的贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2细胞。

4.一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，具体的方法为：在无菌操作下，用灭菌接种环接贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2到已高温灭菌的发酵培养基（pH=6.0）中，在37℃、180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液按照接种量10%接入新的发酵培养基中摇床恒温37℃培养96h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液；所述贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2其保藏编号为CCTCC NO：M2021698。

5.如权利要求4所述一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：硫酸镁 2 g/L、酵母粉50 g/L、蔗糖70 g/L、磷酸氢二钾5 g/L、H2O 1000 mL。

6.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2在生产2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸上的应用。

7.一种制备如权利要求6所述2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）、将保存的贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2接种于斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱培养

2天，获得活化菌种，用无菌水洗脱菌种获得贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2菌悬浮液，将菌种悬浮液接入摇瓶发酵培养基；在37℃、180r/min摇床恒温培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液；

所述斜面培养基为PS培养基；PS培养基：0.5 g蔗糖、0.02 gKH2PO4、0.61 gNa2HPO4、0.1 gNH4Cl、0.01 g酵母膏、0.05 gMgSO4・7H2O、0.5 mgCaCl2、琼脂粉 1g，100 mL蒸馏水，自然pH，121℃湿热灭菌；

所述摇瓶发酵培养基为：硫酸镁 2 g/L、酵母粉50 g/L、蔗糖70 g/L、磷酸氢二钾5 g/L、H2O 1000 mL，pH 6.0，121℃湿热灭菌；

（2）、以10g的蔗糖和10g的抗坏血酸为底物，加入50mmol/L、pH为6.0磷酸盐缓冲液

100mL，以20mL的酶液作为催化剂，在50℃的摇床中反应6h，即可得到2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2菌悬浮液浓度为6

1.0×10个/ml。

9.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2在化妆品或制药领域中的应用。

说明书

一种产蔗糖磷酸化酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种产蔗糖磷酸化酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。【背景技术】

[0002] 维生素C，又名L‑抗坏血酸是一种常见的水溶性维生素，广泛分布于新鲜蔬菜、水果、绿色植物中。L‑抗坏血酸也是人体内必需的营养元素，但由于人体内缺少古洛糖酸内酯氧化酶，无法合成抗坏血酸，必须通过体外摄取。L‑抗坏血酸在日常生产生活中有着广泛的应用。在医疗卫生方面，L‑抗坏血酸具有抑制黑色素形成、促进胶原蛋白的合成、抑制癌细胞增殖、防治坏血病和传染病、促进创伤愈合等作用，是辅助治疗的保健药品。在化妆品中L‑抗坏血酸酸可作为还原剂、紫外线吸收剂和黑色素形成抑制剂来使用。由于L‑抗坏血酸分子中存在极不稳定的连烯二醇结构，极易被热和氧化剂破坏，尤其是光、重金属和荧光物质都能促进其氧化，使其应用受到很大限制。2‑O‑α‑D‑吡喃糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)是L‑抗坏血酸的衍生物，该物质是在糖基转移酶(蔗糖磷酸化酶或葡聚糖蔗糖酶)的作用下，由蔗糖和L‑ 抗坏血酸缩合而成。AA‑2G具有非还原性，与抗坏血酸相比，稳定性更高，同时更易于吸收和利用。AA‑2G作为抗坏血酸最佳的替代品，有效弥补了抗坏血酸自身稳定性差、易被氧化分解的缺陷，极大提高其应用价值。我国对于AA‑2G的研究正在不断推进，但离工业化生产仍有一定的距离，成本过高是困扰我们的一大难题。一方面是由于工业酶本身的酶活力较低，导致生产成本提高；另一方面，底物转化率低、分离纯化手段不够完善也是阻碍其工业化生产的另一重要原因。

[0003] 本发明利用自行筛选的蔗糖磷酸化酶酶法催化合成，即蔗糖磷酸化酶酶液催化蔗糖和L‑ 抗坏血酸合成2‑O‑D‑吡喃糖基‑L‑抗坏血酸，此反应具有绿色高效、反应温和的优势。【发明内容】

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种产蔗糖磷酸化酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

[0006] 一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株SLLSM2，其保藏编号为CCTCC NO： M2021698，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

[0007] 进一步说明，所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株SLLSM2，所述菌株从广西来宾甘蔗地的土壤中分离而得。

[0008] 本申请还提供一种包含如上所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株SLLSM2 的微生物制剂。

[0009] 进一步说明，所述的微生物制剂，所述微生物制剂中含有活菌数不低于1.0×108个/mL的贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2细胞。

[0010] 本申请还提供一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，具体的方法为：在无菌操作下，用灭菌接种环接贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2到已高温灭菌的发酵培养基(pH＝6.0)中，在37℃、 180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液按照接种量10％接入新的发酵培养基中摇床恒温37℃培养96h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。

[0011] 进一步说明，所述发酵培养基为：硫酸镁2g/L、酵母粉50g/L、蔗糖70g/L、磷酸氢二钾5g/L、H2O 1000mL，pH 6.0，121℃湿热灭菌。

[0012] 本申请还提供一种所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2在生产2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑ 抗坏血酸产品上的应用。

[0013] 本申请还提供一种制备如上所述2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸的方法，所述方法包括如下步骤：

[0014] (1)、将保存的贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2接种于斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱培养2天，获得活化菌种，用无菌水洗脱菌种获得贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2菌悬浮液，将菌种悬浮液接入摇瓶发酵培养基；在37℃、180r/min摇床恒温培养72h，经10000r/min、 15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液；

[0015] 所述斜面培养基为PS培养基；PS培养基：0.5g蔗糖、0.02gKH2PO4、0.61gNa2HPO4、 0.1gNH4Cl、0.01g酵母膏、0.05gMgSO4·7H2O、0.5mgCaCl2、琼脂粉1g，100mL蒸馏水，自然pH，
121℃湿热灭菌；

[0016] 所述摇瓶发酵培养基为：硫酸镁2g/L、酵母粉50g/L、蔗糖70g/L、磷酸氢二钾5g/L、 H2O 1000mL，pH 6.0，121℃湿热灭菌；

[0017] (2)、以10g的蔗糖和10g的抗坏血酸为底物，加入50mmol/L、pH为6.0磷酸盐缓冲液100mL，以20mL的酶液作为催化剂，在50℃的摇床中反应6h，即可得到2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸。

[0018] 进一步说明，所述贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2菌悬浮液浓度为1.0×106个/ml。

[0019] 本申请还公开上述所述的贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2在食品、化妆品或制药领域中的应用。

[0020] 本发明磷酸盐缓冲液可以在市场上购买，产至合肥博美生物科技有限责任公司。

[0021] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

[0022] 本发明贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2菌是从广西来宾甘蔗地的土壤中分离筛选出一株菌，研究发现该菌是产蔗糖磷酸化酶的贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2，为了研究该菌的产酶能力，做了单因素的研究，通过本申请人研究确定贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2发酵产酶的最佳条件为：发酵时间92h，接种量量为10％，发酵温度为37℃，酵母膏9％、蔗糖7％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.5％，初始pH为6.0；该菌产酶的酶活达98.4U/mL，可见该菌具有产酶活力高、稳定性好；并利用该菌产酶转化制备AA‑2G产量达到13.16g/L。【附图说明】

[0023] 图1为本申请实施例的贝莱斯芽孢杆菌菌株在平皿上的形态图；

[0024] 图2为不同发酵时间对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图；

[0025] 图3为不同碳源对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图；

[0026] 图4为不同蔗糖浓度对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图；

[0027] 图5为不同氮源对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图；

[0028] 图6为不同酵母粉浓度对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图；

[0029] 图7为不同发酵培养基pH对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图；

[0030] 图8为菌种不同接种量对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图；

[0031] 图9为不同发酵温度对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的影响图。【具体实施方式】

[0032] 本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

[0033] 本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

[0034] 一、菌种的筛选

[0035] 土样取自广西来宾甘蔗地的土壤，以PS培养基形成筛选培养基筛选产蔗糖磷酸化‑1酶的菌株，工艺为：菌种初筛：取土壤1g加入装有9mL的无菌生理盐水中，制成10 浓度的样‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6
品液，震荡混匀后逐级稀释到10 、10 、10 、10 、10 浓度，静置备用。取后3个稀释度，采用涂布法在PS培养基平板上进行菌种分离，在平板上划线分离，反复纯化，从而得到分离菌株的纯培养物。平板置于4℃冰箱保存。

[0036] PS培养基为PS琼脂斜面固体培养基；

[0037] PS培养基的配方为：0.5g蔗糖、0.02gKH2PO4、0.61gNa2HPO4、0.1gNH4Cl、0.01g酵母膏、0.05gMgSO4·7H2O、0.5mgCaCl2、琼脂粉1g，100mL蒸馏水，自然pH，121℃湿热灭菌。

[0038] 二、菌种的鉴定及发酵条件的优化

[0039] 1、菌种的鉴定

[0040] (1)菌落形态观察：将斜面菌点接至有PS培养基的平皿中，于37℃培养48h，观察菌落形态。

[0041] (2)菌株的鉴定：将纯化好的菌株送至上海美吉生物医药科技有限公司鉴定。通过 Nucleotide BLAST分析，与光滑假丝酵母菌株的26S r DNA序列同源性为100％，可初步确定SLLSM2菌株为贝莱斯芽孢杆菌。

[0042] 所述筛选出的贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2的保藏信息如下：名称为贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2，其分类命名为为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis SLLSM2，保藏号为 CCTCC NO：M2021698，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

[0043] 本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SLLSM2在平皿上的形态特征如图1所示，该菌株贝莱斯芽孢杆菌革兰氏染色呈阳性，杆状，芽孢椭圆形，中生，末端膨大为孢子囊，不产生伴孢晶体，可通过鞭毛运动，单菌落乳白色，粗糙且边缘不规则。

[0044] 2、贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2产酶条件优化研究

[0045] (1)发酵时间对产酶的影响

[0046] 以发酵培养基接种贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2，在温度为37℃、pH6、装液量100ml/250ml、接种量10％，转速180r/min的条件下分别发酵60、72、84、96、108h取上清液测酶活。
结果见表1和图2。

[0047] 所述发酵培养基为：硫酸镁2g/L、酵母粉90g/L、蔗糖70g/L、磷酸氢二钾5g/L、H2O1000mL，pH 6.0，121℃湿热灭菌。

[0048] 表1不同发酵时间对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力

[0049]项目 60h 72h 84h 96h 108h
酶活(U/mL) 31.03 55.12 81.65 96.96 67.32

[0050] (2)碳源及其浓度的优化

[0051] 以PS培养基为基础接种贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2，碳源的变量为蔗糖、淀粉、乳糖、葡萄糖、麦芽糖。配制成液体培养基在摇床上37℃，转速180r/min，发酵培养96h，10000r/min 离心10min，在此基础上进一步探究蔗糖浓度(3、5、7、9、11％)对菌株的产酶影响，取其上清液测酶活。结果见表2和图3、4。

[0052] 表2不同碳源对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力

[0053] 项目 蔗糖 淀粉 乳糖 葡萄糖 麦芽糖酶活(U/mL) 97.88 20.99 26.87 87.57 41.95
项目 蔗糖浓度3％ 蔗糖浓度5％ 蔗糖浓度7％ 蔗糖浓度9％ 蔗糖浓度11％
酶活(U/mL) 66.51 81.44 98.83 90.62 82.97

[0054] (3)氮源的优化

[0055] 以PS培养基为基础接种贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2，分别选取牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米粉、黄豆粉为发酵培养基中唯一的有机氮源。配制成液体培养基在摇床上37℃，转速 180r/min，发酵培养96h，10000r/min离心10min，在此基础上进一步探究酵母粉浓度(5、7、9、11、13％)对菌株产酶的影响，取其上清液测酶活。结果见表3和图5、图6。

[0056] 表3不同氮源对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力

[0057]

[0058] (4)pH对酶活的影响

[0059] 以发酵培养基接种贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2，将发酵培养基的初始pH盐酸调为3、4、5、 6、7，取上清液测酶活。配制成液体培养基在摇床上37℃，转速180r/min，发酵培养96h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。结果见表4和图7。

[0060] 表4不同发酵培养基pH对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力

[0061]项目 pH(3) pH(4) pH(5) pH(6) pH(7)
酶活(U/mL) 50.02 69.53 86.59 96.91 83.44

[0062] (6)接种量对产酶的影响

[0063] 以发酵培养基接种贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2，将菌种分别以6％、8％、10％、12％、14％的接种量接种。配制成液体培养基在摇床上37℃，转速180r/min，发酵培养96h，取出发酵液10000rpm离心10min，取其上清液测酶活。结果见表5和图8。

[0064] 表5菌种不同接种量对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力

[0065]项目 6％ 8％ 10％ 12％ 14％
酶活(U/mL) 71.76 86.13 98.32 91.25 81.43

[0066] (7)发酵温度对产酶的影响

[0067] 以发酵培养基接种贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2，在pH6、装液量100ml/250ml、接种量10％，转速180r/min的条件下分别在28、30、35、37、40℃发酵96h取上清液测酶活。结果见表
6 和图9。

[0068] 表6菌种不同发酵温度对贝莱斯芽孢杆菌产酶能力

[0069]项目 28℃ 30℃ 35℃ 37℃ 40℃
酶活(U/mL) 54.39 67.34 86.04 97.16 74.40

[0070] 通过表1‑表6的单因素实验优化检测的酶活数据可以确定贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2 发酵产酶的最佳条件为：发酵时间96h，接种量为10％，发酵温度为37℃，硫酸镁2g/L、酵母粉90g/L、蔗糖70g/L、磷酸氢二钾5g/L、H2O 1000mL，初始pH为6.0。

[0071] 采用上述的得到的贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2发酵产酶的最佳条件，对贝莱斯芽孢杆菌SLLSM2进行发酵培养后对，发酵液10000rpm离心10min，取上清液测酶活。经过检测酶活达到98.4U/mL。

[0072] 三、利用贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2的应用：产2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸产品

[0073] 利用贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2转化制备AA‑2G的方法，步骤如下：

[0074] (1)蔗糖磷酸化酶粗酶液的配置

[0075] 在无菌操作下，用灭菌接种环接贝莱斯芽孢杆菌菌株SLLSM2到已高温灭菌的发酵培养基(硫酸镁2g/L、酵母粉90g/L、蔗糖70g/L、磷酸氢二钾5g/L、H2O 1000mL)(pH＝6.0) 中，在37℃、180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液接入新的发酵培养基(：硫酸镁 2g/L、酵母粉90g/L、蔗糖70g/L、磷酸氢二钾5g/L、H2O 1000mL)中摇床恒温培养96h，经
10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。

[0076] (2)催化制备2‑O‑α‑D‑吡喃葡糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)

[0077] 以10g的蔗糖和10g的抗坏血酸为底物，加入50mmol/L、pH为6.0磷酸盐缓冲液100mL，以20mL的蔗糖磷酸化酶粗酶液作为催化剂，在50℃的摇床中反应6h。按分光光度法测定反应液中AA‑2G的含量。

[0078] 经过测定，AA‑2G产量达到13.16g/L。

[0079] 磷酸缓冲液的配方为：产至合肥博美生物科技有限责任公司。

[0080] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。