一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备方法转让专利
申请号 : CN202111242030.X
文献号 : CN113975245B
文献日 : 2022-07-08
发明人 : 邵敬伟 , 尹梦蝶 , 林娟芳
申请人 : 福州大学
摘要 :
本发明属于纳米药物领域，具体涉及一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备方法。本发明以具有抗氧化、降血脂作用的纳米硒为药物载体，递送具有促进脂质代谢和抗炎作用的药物人参皂苷，同时结合血小板膜固有的靶向斑块能力制备得到低毒、生物相容性好、可靶向病灶部位的仿生纳米递药系统，该体系分别保留了纳米药物和血小板膜的优势，可以显著提高动脉粥样硬化斑块处的药物浓度富集，降低毒副作用，具有广阔的潜在临床应用前景。
权利要求 :
1.一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备方法，其特征在于：所述的仿生纳米递药系统由人参皂苷/硒纳米粒骨架内核和表面包覆血小板膜组成；
所用的血小板膜是从健康大鼠血液中提取的源生血小板膜，通过离心纯化和反复冻融法制得；
所述的一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备方法，具体包括以下步骤：
A.人参皂苷/硒纳米粒的制备：在稳定剂普朗尼克F‑127的水溶液中逐滴加入谷胱甘肽水溶液，紧接着滴加亚硒酸钠水溶液，用氢氧化钠调节反应液的 pH 为弱碱性，反应液由无色变为橙色，表明硒纳米的生成，然后加入人参皂苷甲醇溶液，继续搅拌6 h，直至甲醇挥发完全，将反应得到的溶液装入MWCO为 3500 Da的透析袋中，透析 24 h除掉残余的有机溶剂，透析结束后，将液体装于MWCO为10000 Da 的超滤管中，离心机 3000 rpm，20 min 浓缩纳米溶液，得到人参皂苷/硒纳米粒溶液；
B.仿生人参皂苷/硒纳米粒的制备：将等体积的血小板膜与人参皂苷/硒纳米粒溶液混合均匀后，超声 5 min，继续搅拌过夜得到最终的血小板膜包覆的人参皂苷/硒纳米粒，即所述的仿生纳米递药系统。
2.根据权利要求1所述的一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备方法，其特征在于：血小板膜包覆的人参皂苷/硒纳米粒的平均粒径为50 100 nm。
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说明书 :
一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于纳米药物领域，特别涉及一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备方法。
背景技术
[0002] 心血管疾病是威胁国民健康的“头号杀手”。引起心血管疾病的主要原因有以下几点：高血压、吸烟、血清脂质异常、糖尿病、肥胖、身体活动不足、大气污染等，这些因素最终通过共同的病理基础即动脉粥样硬化而导致心血管疾病的发生。目前用于治疗动脉粥样硬化的药物主要策略是通过调脂和抗炎，如具有降低脂质水平、抑制斑块炎症以及抗氧化等作用的他汀类药物；用于 AS 晚期的血小板抑制剂药物阿司匹林和氯吡格雷等。尽管这些药物经过临床实践证明有一定的改善效果，但这些药物普遍存在生物利用度低，靶向性差，毒副作用大的治疗缺陷。因此，迫切需要寻找一种低毒、生物相容性好、可靶向病灶部位的药物解决上述问题。
[0003] 人参是一种广泛使用的传统中药材，它的使用已经超过2000年，在韩国、中国和日本得到了广泛的使用。人参皂苷是人参的主要提取物，也是人参发挥药效的关键成分，有研究表明人参皂苷可以改善内皮功能紊乱和血管炎症，同时可以通过减少巨噬细胞源性泡沫细胞中脂质的积累并增强AS斑块的稳定性，说明人参皂苷在治疗动脉粥样硬化疾病方面有一定的潜力，但人参皂苷的水溶性差，生物利用度低，从而限制了其在临床上的应用。目前将人参皂苷纳米应用到疾病治疗只有较少的研究，如中国专利文献CN103271891A公开了一种人参皂苷纳米胶束及其制备方法、应用和药物组合物，该人参皂苷纳米胶束作为脂溶性化合物的助溶剂或作为药物载体的应用，替代了现有的医药品载体、助溶剂。虽然人参皂苷实现纳米化能够提高药效和生物利用度，但是人参总皂苷主要有效成分的种类和含量受种属、采收、提取工艺等多种因素影响。而人参皂苷单体有利于后续的分子机制研究。
[0004] 开发能够降低免疫排斥，较好的生物兼容性以及更安全的纳米药物是必要的。
[0005] 基于现有的纳米技术现状，本发明拟提供一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统，本发明的递药系统中，人参皂苷与纳米硒共组装成纳米内核，表面再包覆血小板膜。该仿生纳米递药系统优良的小尺寸和生物相容性，可将药物靶向递送至动脉粥样硬化病灶部位，提高斑块部位的药物浓度和治疗效果，同时降低药物产生的副作用，具有广阔的应用前景。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服现有心血管药物及制剂的不足，提供一种增强治疗效果的仿生纳米递药系统，该系统具有优良的粒径大小和生物相容性，可以使药物靶向递送至斑块部位，提高动脉粥样硬化治疗效果，降低毒副作用。
[0007] 为了实现上述目的，一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统所采用的技术方案包括以下步骤：
[0008] （1）制备硒纳米；
[0009] （2）制备人参皂苷/硒纳米粒；
[0010] （3）采用血小板膜包覆人参皂苷/硒纳米粒。
[0011] 进一步地，所述的制备硒纳米的方法为：向小烧杯中加入1% 稳定剂普朗尼克F‑127水溶液，在不断搅拌的条件下，逐滴滴加谷胱甘肽水溶液，紧接着滴加亚硒酸钠水溶液，用氢氧化钠调节反应液的 pH 为弱碱性（pH=7.4 8.5），肉眼可见反应液由无色变为橙色，~
表明硒纳米的生成；
表明硒纳米的生成；
[0012] 所述的人参皂苷/硒纳米粒的制备方法为：在硒纳米溶液中加入人参皂苷甲醇溶液，搅拌6 h，直至甲醇挥发完全。将反应得到的溶液装入分子量 3500（MWCO: 3500 Da）的透析袋中，透析 24 h除掉其中残余的有机溶剂。透析结束后，将液体装于MWCO为10000 Da 的超滤管中，离心机 3000 rpm，20 min 浓缩纳米溶液，即得到人参皂苷/硒纳米粒溶液。
[0013] 再进一步地，所述的血小板膜包覆人参皂苷/硒纳米粒制备方法为：人参皂苷/硒纳米粒溶液与血小板膜等体积混合超声5分钟后搅拌过夜，即得所述的仿生纳米递药系统。
[0014] 所用的血小板膜是从健康大鼠血液中提取的源生血小板膜，通过离心纯化和反复冻融法制得。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0016] （1）硒纳米采用简便的氧化还原法制得，不仅具有优良的粒径大小和比表面积，而且具有良好的抗氧化治疗效果。
[0017] （2）人参皂苷和硒纳米共组装制备而成的纳米粒大大改善了人参皂苷在临床应用上的生物利用率，同时该复合纳米粒可更有效的抑制细胞粘附作用。
[0018] （3）血小板膜的包裹不仅可以减少巨噬细胞的吞噬，而且可以将合成的纳米粒子带到动脉粥样硬化病灶部位，实现纳米粒子在斑块处的高效蓄积。本发明展现了低毒性、提高载体生物相容性以及在斑块部位的聚集，可用于动脉粥样硬化病灶部位药物的递送。
附图说明
[0019] 图1是血小板膜包裹纳米组的粒径电势分布图；
[0020] 图2是血小板膜包裹纳米组的原子力图像；
[0021] 图3是血小板膜包裹纳米组的细胞粘附；
[0022] 图4是血小板膜包裹纳米组对ApoE‑/‑小鼠动脉粥样硬化的斑块占比。
具体实施方式
[0023] 根据具体实施方式对本发明所述的技术方案作进一步的说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，作出各种替换和变更，均应包括在本发明范围内。
[0024] 实施例1
[0025] 一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的制备：
[0026] A：人参皂苷/硒纳米粒（Se/Rb1 NPs）的制备：向 10 mL 的小烧杯中加入 3 mL 1% F‑127 母液，在不断搅拌的条件下逐滴滴加 100 μL 谷胱甘肽（40 mM）水溶液，紧接着滴加 100 μL 亚硒酸钠（10 mM）水溶液，用氢氧化钠调节反应液为弱碱性（pH= 7.4)，肉眼可见反应液由无色变为橙色，表明纳米硒（Se NPs）的生成，然后加入500 μL人参皂苷Rb1甲醇溶液（10 mM），继续搅拌 6 h，直至甲醇挥发完全。将反应得到的溶液装入分子量 3500（MWCO:
3500 Da）的透析袋中，透析 24 h除掉其中残余的有机溶剂。透析结束后，将液体装于MWCO为10000 Da 的超滤管中，离心机 3000 rpm，20 min 浓缩纳米溶液，得到Se/Rb1 NPs。
3500 Da）的透析袋中，透析 24 h除掉其中残余的有机溶剂。透析结束后，将液体装于MWCO为10000 Da 的超滤管中，离心机 3000 rpm，20 min 浓缩纳米溶液，得到Se/Rb1 NPs。
[0027] B：血小板膜（PM）的制备：取正常大鼠的血液，室温放置 10 min 后，100 g，25℃离心 20 min，上层淡黄色的血清即为所需要的血小板；接着再次 100 g，25℃离心 20 min，要上清除去 EP 管底部的沉淀物；在取出的上清中加入含 1 mM EDTA 的 PBS（pH 7.4），轻轻吹打洗涤，800 g，25℃离心 20 min，去除上清；血小板沉淀重悬于含 1 mM EDTA 的 PBS 中，并加入蛋白酶抑制剂，置于‑80℃冰箱中冻住，接着室温下融化，如此反复冻融 4‑5 次后，4000 g，4℃离心 3 min 得到沉淀，用含蛋白酶抑制剂的 PBS 洗涤 2‑3 次，重悬于 ddH2O 中，即得到血小板膜（PM）。
[0028] C：仿生人参皂苷/硒纳米粒的制备：将等体积的血小板膜与步骤A中得到的人参皂苷/硒纳米溶液混合均匀后超声5 min，继续搅拌过夜即得到PM@Se/Rb1 NPs。
[0029] 实施例2
[0030] 一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的表征：
[0031] 利用马尔文粒度仪分别测量PM、Se/Rb1 NPs和PM@Se/Rb1 NPs的粒径分布及电势电位大小。采用原子力显微镜观察最终的PM@Se/Rb1 NPs的形态，将纳米溶液滴于云母片的中心，用氮气吹干云母片，再用 ddH2O 滴洗多次，最后用原子力显微镜进行拍摄。
[0032] 结果如图1所示，未处理的血小板本身的粒径大于 3000 nm，Se/Rb1 NPs 的粒径为 51.5 ± 1.1 nm，经过细胞膜包被后 PM@Se/Rb1 NPs 的粒径增加到了 58.7 ± 1.4 nm，表明 PM 包裹在 Se/Rb1 NPs 表面的厚度大约为 7 nm。同时，电势的数据显示，Se/Rb1 NPs 经过PM的包裹后，电势从‑4.6 ± 0.4 mV 下降到‑16.4 ± 1.1 mV。图2的原子力显微镜可以看出 PM@Se/Rb1 NPs 分布较为均匀，整体呈扁球状，直径为 60 nm 左右，与粒径仪所测得的粒径大小较为一致。
[0033] 实施例3
[0034] 一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统的细胞粘附：
[0035] A: 考察药物对HUVEC与基质胶的粘附：在 24 孔板中铺200 μL用未配制的 DMEM 培养基稀释一倍后的Matrigel， 放入培养箱使其完全凝固。然后，弃去不凝固的 Matrigel，并用 1% BSA 封闭1 h。弃去封闭溶液，用 PBS 清洗3次。 取经浓度 10 ng/mL的TNF‑α刺激4 h 后的 HUVEC 消化后，与可以将整个细胞染色的试剂罗丹明 123 在黑暗的培养箱中孵育 0.5 h。把含有不同药物的 HUVEC 细胞重悬液吸到孔板中继续孵育45 min，并以空白培养基为对照。PBS 洗掉不贴壁的细胞后，加入 4% 多聚甲醛固定细胞，用荧光显微镜拍摄 HUVEC 和 Matrigel 之间的粘附情况，每个孔随机选择 20个视野。
[0036] 如图3中 A和C所示，Rb1 对 HUVEC 和 Matrigel 之间粘附的抑制作用最弱，抑制率只有 10%，而 Se NPs 的抑制效果为 35%，PM@Se/Rb1 NPs 的抑制效果最强，达到了43%。
[0037] B: 考察药物对HUVEC与U937细胞的粘附：取长到 70‑80% 的 HUVEC 消化后，2×5
10个细胞/mL，铺到 24 孔板里，每孔 0.5 mL，培养过夜。用浓度 10 ng/mL 的 TNF‑α刺激
4 h，悬浮细胞 U937 细胞用含有荧光染料罗丹明 123 培养基孵育 30 min 后，1500 rpm，离心 5 min，保留沉淀，用含有药物 Rb1，Se NPs 及 PM@Se/Rb1 NPs 的培养基重悬 U937 细胞，空白培养基为对照组，并加入PBS 清洗过后的HUVEC中，相互作用 45 min 后，加入
4% 多聚甲醛固定细胞，在显微镜下拍摄 U937 和 HUVEC 细胞之间的粘附照片。每孔拍摄
20 个视野来计算平均粘附率，通过 Image J 软件输出粘附的细胞数，并由以下计算公式得出最终的粘附率：相对粘附率（%）=（样品组粘附细胞的数量/对照组中粘附细胞的数量）×100。
10个细胞/mL，铺到 24 孔板里，每孔 0.5 mL，培养过夜。用浓度 10 ng/mL 的 TNF‑α刺激
4 h，悬浮细胞 U937 细胞用含有荧光染料罗丹明 123 培养基孵育 30 min 后，1500 rpm，离心 5 min，保留沉淀，用含有药物 Rb1，Se NPs 及 PM@Se/Rb1 NPs 的培养基重悬 U937 细胞，空白培养基为对照组，并加入PBS 清洗过后的HUVEC中，相互作用 45 min 后，加入
4% 多聚甲醛固定细胞，在显微镜下拍摄 U937 和 HUVEC 细胞之间的粘附照片。每孔拍摄
20 个视野来计算平均粘附率，通过 Image J 软件输出粘附的细胞数，并由以下计算公式得出最终的粘附率：相对粘附率（%）=（样品组粘附细胞的数量/对照组中粘附细胞的数量）×100。
[0038] 如图3中 B和 D所示，Rb1、Se NPs 和 PM@Se/Rb1 NPs 对 HUVEC和U937 之间粘附的抑制率分别为35%、70%和 85%，PM@Se/Rb1 NPs 抑制 HUVEC和U937之间粘附作用最强。
[0039] 实施例4
[0040] 一种基于人参皂苷的仿生纳米递药系统对ApoE‑/‑小鼠动脉粥样硬化斑块形成面积占整条动脉面积百分比：
[0041] 建模：所使用的动物为 ApoE 基因敲除的 C57小鼠，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养在普通动物房中，自然昼夜节律（12：12），室温 25 ± 1℃，给予充分的食物和水，每隔3天换垫料。
[0042] 分组、给药方式：30只雄性 ApoE‑/‑小鼠给予高脂饲料喂养，高脂饲料的成分为：基础料 83.3%，10%脂肪，5%蔗糖，1%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙硫氧嘧啶。高脂饲料喂养两个月后，30 只 ApoE‑/‑小鼠平均分成以下组别：正常饲养组（Normal diet, ND）、高脂饲养组（High‑fat diet, HFD）、Rb1 单独给药组、Se NPs 组、Se/Rb1 NPs 组、PM@Se/Rb1 NPs 组。其中 ND组作为阴性对照组（ND control），HFD组作为阳性对照组（HFD control）。Rb1单独给药组、Se/Rb1 NPs 组及 PM@Se/Rb1 NPs 组中药物 Rb1 的用药浓度为5 mg/kg, 尾静脉注射给药，3 天一次，治疗周期为一个月，具体的实施方案见图4 中A。
[0043] 实施例5
[0044] 主动脉大体油红 O 染色：分离出主动脉大体，将主动脉大体置于4% 的多聚甲醛中，尽可能去除主动脉外周的组织，纵向切开血管后，准备好现配的油红 O 染色液，将主动脉大体置于 60% 的异丙醇中分化 10 min，转移至油红O染料中染 2 h 后，用 70%乙醇分化多次，除去多余的染料，看到主动脉大体变成白色即可，最后用体式显微镜观察油红 O 染色情况并拍照。使用 Image J 软件对主动脉上油红O染色的斑块面积进行定量。
[0045] 如图4中B所示，ND control 组、HFD control 组、Rb1、Se NPs、Se/Rb1 NPs、PM@Se/Rb1 NPs组治疗的小鼠主动脉平均斑块面积为：6.5%、38.8%、28.1%、32.6%、24.9%、12.7%。HFD control 组显示出比正常饲养组更明显的油红O染色区域。游离的 Rb1、Se NPs 组与 HFD control 组相比无明显区别，未见明显的治疗效果。相比之下，Se/Rb1 NPs、PM@Se/Rb1 NPs 组在主动脉中观察到了油红O染色区域有不同程度的减少，其中 PM@Se/Rb1 NPs 组的油红O染色区域最少，表明其有较好减少主动脉斑块生成作用。
[0046] 综上可知，上述实施例中以硒纳米为载体与人参皂苷Rb1共组装成人参皂苷/硒纳米粒，并利用源生血小板膜构建了一种新型靶向动脉粥样硬化斑块的仿生纳米载体系统，其中，血小板膜固有的天然靶向作用能够提高病灶部位的药物浓度，同时该仿生人参皂苷/硒纳米体系粒子尺寸极小，能够很好的穿透生物膜与血管壁，延长在血液中的循环时间，从而发挥较好的治疗效果。基于上述原因，上述实施例中所制备的纳米系统具有低毒、高靶向性、强穿透力和较好的生物相容性，能够使动脉粥样硬化斑块部位的药物浓度富集，减少用药剂量，降低毒副作用，从而为动脉粥样硬化针对病灶部位的防治提供了一种新的有效途径。
[0047] 上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。