荜茇酰胺抑制程序性坏死的新用途

摘要

本发明属于医药技术领域，本发明公开了一种天然产物活性成分荜茇酰胺(Piperlongumine)，在体内外能够有效抑制受体相互作用蛋白激酶‑1(Receptor‑interacting protein kinase 1,RIPK1)依赖的细胞程序性坏死，且毒性小。本发明针对现有的治疗瓶颈，为这类以程序性坏死异常活化为特征的相关疾病的治疗提供新的方案和希望。

权利要求

1.荜茇酰胺在制备用于治疗程序性坏死相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述程序性坏死相关疾病是全身炎症反应综合征。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述全身炎症反应综合征是TNF‑α诱导的。

3.根据权利要求1或2任一项所述的应用，其特征在于，所述药物可以改善低体温状态。

说明书

荜茇酰胺抑制程序性坏死的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种荜茇酰胺作为程序性坏死抑制剂的应用，属于医药技术领域。

背景技术

[0002] 程序性坏死(Necroptosis)是近几十年来新发现的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)之一，细胞给予肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNFα)刺激后，RIPK1(受体相互作用蛋白激酶1，receptor interacting protein kinase 1)、RIPK3(受体相互作用蛋白激酶3，receptor‑interacting protein kinase 3)和MLKL(混合谱系激酶结构域样假激酶，mixed‑lineage kinase domain‑like pseudokinase)可形成“程序性坏死小体(Necrosome)”，诱导Necroptosis发生，而这一过程能被关键调控分子RIPK1激酶特异性抑制剂Necrostatin‑1s(Nec‑1s)挽救。Linde等人发现，程序性坏死抑制剂可保护通过尾静脉注射TNF‑α诱导的SIRS小鼠模型的体温降低并延长其生存率。

[0003] 细胞的主动性死亡在机体正常发育、衰老，抵抗病原微生物入侵、维持内环境稳态等生理活动中不可或缺，其失调往往导致发育畸形、免疫系统疾病、神经退行性疾病及癌症等多种疾病，乃至个体的死亡。因此，对细胞程序性死亡进行干预，对于疾病治疗研究有着重要的意义。

[0004] RIPK1和RIPK3参与炎症、细胞应激和感染后的生理反应。环境线索(如细菌或病毒感染、促炎刺激或细胞应激)激活这些途径，产生复杂的信号，对决定细胞命运的RIPK1起核心作用。许多炎症性、感染性和退行性疾病都是由RIPK1激酶活性驱动的，这使得它成为疾病治疗的一个有价值的靶点。

[0005] 2020年7月15日发表的综述中进一步总结了与RIPK1相关的人类疾病，其中就包括以RIPK1为调节子的炎症性肠病(克罗恩病)、多发性硬化以及系统性红斑狼疮。已有几个不同的研究团队的研究和临床数据表明肌萎缩侧索硬化症、缺血再灌注损伤、缺血性脑卒中、出血性脑卒中、额颞叶痴呆、阿尔茨海默氏病、亨廷顿舞蹈症、杜氏肌营养不良与RIPK1的活化和程序性坏死密切相关。

[0006] 因此，通过研究发现细胞程序性坏死的抑制剂，对于细胞死亡相关疾病的治疗具有十分重要的意义。

[0007] 荜茇酰胺(piperlongumine,CAS#:20069‑09‑4)又名荜茇明碱(piplartine)、哌隆明，是一种从药食同源的中药常用药材、胡椒科植物荜茇中提取的酰胺类生物碱类化合物，在我国广东、广西、云南等地有栽培，资源非常丰富。

发明内容

[0008] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种荜茇酰胺作为程序性坏死抑制剂的应用。

[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

[0010] 荜茇酰胺作为RIPK1抑制剂的应用。

[0011] 进一步优选地，荜茇酰胺在人结肠癌细胞HT‑29、人T淋巴细胞白血病细胞株(FADD defficient Jurkat)及人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF‑CEM)上抑制T/S/Z诱导的程序性坏死中的应用。

[0012] 进一步优选地，荜茇酰胺作为RIPK1抑制剂在治疗神经退行性疾病：肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆、运动神经元病、多发性硬化、阿尔兹海默病、亨廷顿病、脊髓小脑共计失调、贝克杜氏肌营养不良、脑出血、缺血再灌注损伤(缺血性脑卒中、新生儿脑损伤、心肌缺血、肾脏缺血再灌注损伤、视网膜缺血、脑外伤)、克罗恩病、急性胰腺炎、器官移植、肝脏疾病(肝炎、肝癌)、年龄相关性黄斑变性、新冠肺炎、肺炎、系统性红斑狼疮、银屑病、全身炎症反应综合征等疾病中的应用。

[0013] 本发明具有以下有益效果：

[0014] (1)荜茇酰胺在体外能够有效抑制RIPK1依赖的细胞程序性坏死Necroptosis，且毒性小。

[0015] (2)荜茇酰胺可以作为程序性坏死抑制剂治疗神经退行性疾病：肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆、运动神经元病、多发性硬化、阿尔兹海默病、亨廷顿病、脊髓小脑共计失调、贝克杜氏肌营养不良、脑出血、缺血再灌注损伤(缺血性脑卒中、新生儿脑损伤、心肌缺血、肾脏缺血再灌注损伤、视网膜缺血、脑外伤)、克罗恩病、急性胰腺炎、器官移植、肝脏疾病(肝炎、肝癌)、年龄相关性黄斑变性、新冠肺炎、肺炎、系统性红斑狼疮、银屑病、全身炎症反应综合征等相关疾病。

附图说明

[0016] 图1荜茇酰胺(Piperlongumine)在不同细胞系对程序性坏死的保护作用；

[0017] 图2荜茇酰胺(Piperlongumine)挽救不同细胞系程序性坏死的IC50及EC50：A.用不同浓度的荜茇酰胺(Piperlongumine)处理HT‑29细胞；B.用不同浓度的荜茇酰胺处理FADD‑/‑Jurkat细胞；C.用不同浓度的荜茇酰胺处理CCRF‑CEM细胞；D.在HT‑29细胞，用不同浓度荜茇酰胺+200nM SM‑164+20μM zVAD预处理细胞；E.在FADD‑/‑Jurkat细胞，用不同浓度荜茇酰胺+200nM SM‑164+20μM zVAD预处理细胞；F.在CCRF‑CEM细胞，用不同浓度荜茇酰胺+200nM SM‑164+20μM zVAD预处理细胞。

[0018] 图3荜茇酰胺(Piperlongumine)对程序性坏死标志物的影响：RIPK1激酶S321位点磷酸化；

[0019] 图4荜茇酰胺保护TNFa诱导的全身炎症反应综合征小鼠的生存曲线及肛温附图。

具体实施方式

[0020] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

[0021] 本实施例公开了荜茇酰胺作为程序性坏死抑制剂的应用。

[0022] 优选地，荜茇酰胺能够有效抑制RIPK1依赖的细胞程序性坏死。

[0023] 进一步优选地，荜茇酰胺在抑制T/S/Z诱导的程序性坏死中的应用。

[0024] 进一步优选地，荜茇酰胺在人源细胞上抑制T/S/Z诱导的程序性坏死中的应用。

[0025] 本实施例在人类结肠癌细胞(HT‑29)、人T淋巴细胞白血病细胞株(FADD defficient Jurkat，FADD‑/‑Jurkat)及人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF‑CEM)，用DMSO、200nM SM‑164+20μM zVAD(S/Z)、200nM SM‑164+20μM zVAD+25μM Nec‑1(S/Z/N)、
200nM SM‑164+20μM zVAD+10uM荜茇酰胺(Piperlongumine)(S/Z/PL)预处理细胞30min后，加入20ng/ml hTNF‑α诱导细胞发生程序性坏死，采用ATP assay检测存活细胞数目。

[0026] 实施例1荜茇酰胺抑制细胞程序性死亡

[0027] 结果如图1所示，荜茇酰胺(Piperlongumine,PL)均可抑制T/S/Z(TNF‑α/SM‑164/zVAD)诱导的细胞程序性坏死的发生，具体结果见表1。

[0028] 表1不同细胞系，利用荜茇酰胺挽救细胞程序性坏死结果

[0029]

[0030] 注：T：TNFα；S：SM164；Z：zVAD；N：Nec‑1(作为程序性坏死抑制剂的阳性对照)；PL：Piperlongumine。在人源细胞系中，荜茇酰胺组与模型组比较，(****P<0.0001)。

[0031] 实施例2：荜茇酰胺在不同细胞系的安全性与有效性。

[0032] 用不同浓度的荜茇酰胺(Piperlongumine)处理HT‑29细胞、FADD‑/‑Jurkat细胞、CCRF‑CEM细胞，采用ATP assay检测存活细胞数目(如图2A‑C)。

[0033] 在此基础上，再添加200nM SM‑164+20μM zVAD预处理细胞30min后，用20ng/ml hTNF‑α诱导程序性坏死，采用ATP assay检测存活细胞数目(如图2D‑F)。

[0034] 具体结果如图2，以及表2、表3，荜茇酰胺(Piperlongumine)在HT‑29、FADD‑/‑Jurkat、CCRF‑CEM细胞的EC50分别为0.484uM、2.403uM、11.34uM，且毒性小(HT‑29IC50：95.40μM，FADD‑/‑Jurkat IC50：83.44μM，CCRF‑CEM IC50：141.3μM)。实验结果还发现，5uM‑
10uM的荜茇酰胺可明显抑制人源肿瘤坏死因子(human TNFa，hTNF‑α)诱导的细胞程序性坏死，提高细胞存活率。

[0035] 表2不同浓度荜茇酰胺处理后细胞活率比较

[0036]

[0037]

[0038] 表3不同浓度荜茇酰胺抑制程序性坏死的细胞活性比较

[0039]

[0040] 注：所有细胞均用TNFα/SM164/zVAD处理诱导细胞发生程序性坏死。

[0041] 实施例3荜茇酰胺(Piperlongumine)抑制p‑RIPK1的表达

[0042] 利用T/S/Z处理HT‑29细胞系，hTNFa处理FADD‑/‑Jurkat细胞系，诱导细胞发生程序性坏死，在2小时可明显观察到加入荜茇酰胺可明显挽救细胞程序性坏死。在0、1、2小时收取细胞样本，提取蛋白后，进行蛋白免疫印迹，程序性坏死激活的标志物p‑RIPK1(S166)可以被明显抑制，提示荜茇酰胺可以在细胞水平抑制程序性坏死，挽救细胞死亡。

[0043] 实施例4荜茇酰胺改善RIPK1依赖的细胞死亡

[0044] 采用8周龄C57BL/6小鼠尾静脉注射2μg TNFα的方法，成功建立SIRS小鼠模型。如图4所示，RIPK1依赖的细胞死亡通路参与了TNF‑α诱导全身炎症反应综合征(SIRS)。荜茇酰胺可明显改善小鼠的低体温状态(*P<0.05)，提高小鼠生存率(**P<0.05)，具体结果见表4、表5。

[0045] 图4显示荜茇酰胺(Piperlongumine)可明显提高SIRS小鼠生存率和体温。在程序性坏死异常活化为特征全身炎症反应综合征的小鼠模型应用荜茇酰胺(Piperlongumine)可明显改善小鼠的低体温状态(*P<0.05)，提高小鼠生存率(**P<0.05)。

[0046] 表4在mTNF‑α诱导SIRS小鼠模型中不同处理小鼠存活只数比较

[0047]

[0048] 表5在mTNF‑α诱导SIRS小鼠模型中不同处理小鼠体温的比较(Mean±SD)

[0049]

[0050]

[0051] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。