麦芽酚铁过氧化物模拟酶在杀菌中的应用

摘要

本发明涉及麦芽酚铁过氧化物模拟酶在杀菌中的应用，属于医疗卫生技术领域。麦芽酚铁作为纳米模拟酶在酸性条件下催化H2O2释放出具有高度氧化的O2·‑，O2·‑可氧化损伤细菌细胞膜及蛋白质、核酸和脂质生物大分子，进而有效杀灭各种常见细菌、真菌甚至耐药菌；尤其是当麦芽酚铁纳米模拟酶的浓度为500μg/mL，H2O2浓度为100μmol/L时，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率>99％。

权利要求

1.麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，将麦芽酚铁、过氧化氢和pH=2.0 6.0~的PBS缓冲液制备成所述杀菌剂；所述杀菌剂中所述麦芽酚铁的浓度为200~500μg/mL，H2O2的浓度为100μmol/L。

2.根据权利要求1所述的麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，所述麦芽酚铁的粒径不超过550nm。

3.根据权利要求1所述的麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，所杀灭的菌为耐药革兰氏阳性菌。

4.根据权利要求3所述的麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，所述耐药革兰氏阳性菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

5.根据权利要求4所述的麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，所述pH＝5.0。

6.根据权利要求1～5任一项所述的麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，按照如下方法制备杀菌剂：将麦芽酚铁配制成麦芽酚铁水溶液A，向所述水溶液A中加入pH＝2.0～6.0的PBS缓冲液得到混合液B，向所述混合液B中加入双氧水得到所述杀菌剂；所述杀菌剂中所述麦芽酚铁的浓度为200～500μg/mL，H2O2的浓度为100μmol/L。

7.根据权利要求6所述的麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，所述杀菌剂中所述麦芽酚铁的浓度为500μg/mL。

8.根据权利要求6所述的麦芽酚铁在制备杀菌剂中的应用，其特征在于，所述PBS缓冲液的pH＝5.0。

说明书

麦芽酚铁过氧化物模拟酶在杀菌中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医疗卫生技术领域，尤其涉及抗菌纳米技术领域，具体涉及麦芽酚铁作为过氧化物模拟酶在杀菌中的应用。

背景技术

[0002] 天然酶因其高特异性和突出的底物效率而具有广泛的应用前景，但其固有的不稳定性、资源的有限性和工艺的高成本性阻碍了其广泛应用。纳米模拟酶，又称纳米酶，是是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶；与天然蛋白酶相比，具有成本低、抗生物降解能力强、容易大量制备的优点，因此越来越受到人们的关注。

[0003] 双氧水作为常用的伤口消毒剂，是由于它能分解产生具有强氧化性的羟基自由基，从而破坏细菌的活性组分。但这种靠过氧化氢自身产生羟基自由基的效率较低，为了达到有效的抗菌效果，往往会使用高浓度的双氧水，这又容易引发免疫原性和炎症，甚至会延缓伤口的愈合。具有过氧化物酶样活性的纳米酶可以催化过氧化氢产生活性氧(ROS)以对抗细菌入侵，因此被认为是抗生素的首选替代品。

[0004] 中国专利申请CN108420803A中公开了一种纳米酶创可贴、制备方法及使用方法，其中还公开了具有过氧化物模拟酶的纳米材料为碳化氮与金纳米颗粒复合物，其制备方法包括：将氯金酸和谷氨酸加入到乙二醇中，然后加入碳化氮纳米片并室温搅拌，得到碳化氮与金纳米颗粒复合物；其中碳化氮纳米片的尺寸为200‑300nm，厚度为1‑3nm；所述的氯金酸的体积(μL)：谷氨酸的质量(mg)：碳化氮纳米片的质量(mg)为100：50：30；所述的氯金酸的浓度为18‑25mg/mL。所述纳米酶创可贴中纳米酶水溶液的浓度为0.2～2mg/mL。该专利中，在纳米酶的催化下，过氧化氢抗菌所需的浓度下降了两个数量级。

[0005] 中国专利申请CN111122486A中公开了一种铂单原子纳米酶的过氧化氢快速检测方法及杀菌应用，将铂单原子纳米酶、过氧化氢溶液和革兰氏阴性菌大肠杆菌一起放到醋酸缓冲液中，0～40℃孵化超过6h；将反应后的溶液离心，涂平板，观察细菌的生长情况，平板上细菌的数量越少，说明杀菌情况越好。

[0006] 以上现有技术中均未研究过纳米酶催化过氧化氢对耐药细菌的杀菌能力，至于麦芽酚铁纳米酶的研究则更是未见有报道。

发明内容

[0007] 本发明针对使用抗生素治疗细菌疾病导致的细菌产生耐药性而难以杀灭的问题，以及传统高浓度双氧水(H2O2质量分数为0.5～3％)对生理组织造成损伤的问题，研究开发出麦芽酚铁过氧化物纳米模拟酶的活性，并将其用于催化过氧化氢以达到使用非常低的浓度的双氧水能高效杀菌的效果。

[0008] 为了实现上述目的，本发明使用麦芽酚铁作为过氧化物模拟酶在酸性条件下催化过氧化物用于杀菌。

[0009] 优选的，所述过氧化物为过氧化氢。

[0010] 发明人在实验研究中发现，纳米麦芽酚铁与双氧水混合后会发生反应，反应生成的产物能够使TMB(3,3',5,5'‑四甲基联苯胺)呈现蓝色，因此推断出纳米麦芽酚铁能够作为模拟酶催化H2O2分解得到活性氧用于杀菌。这一推断在后续的实验中已被进一步证实，麦芽酚铁作为纳米模拟酶催化H2O2分解得到的活性氧不仅能够杀灭常见细菌、真菌，还能够杀灭一些超级细菌。

[0011] 优选的，所述酸性条件为pH＝2.0～6.0。

[0012] 优选的，所述麦芽酚铁的粒径不超过550nm。

[0013] 优选的，所杀灭的菌为耐药革兰氏阳性菌。

[0014] 进一步优选的，所述耐药革兰氏阳性菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

[0015] 进一步优选的，所述酸性条件为pH＝5.0。

[0016] 优选的，按照如下方法制备杀菌剂：

[0017] 将麦芽酚铁配制成麦芽酚铁水溶液A，向所述水溶液A中加入pH＝2.0～6.0的PBS缓冲液得到混合液B，向所述混合液B中加入双氧水得到所述杀菌剂；所述杀菌剂中所述麦芽酚铁的浓度为200～500μg/mL，H2O2的浓度为100μmol/L。

[0018] 进一步优选的，所述杀菌剂中所述麦芽酚铁的浓度为500μg/mL。

[0019] 进一步优选的，所述PBS缓冲液的pH＝5.0。

[0020] 进一步优选的，将所述杀菌剂涂抹于需要杀菌的生理组织或将所述杀菌剂用于制备具有杀菌功能的产品中。

[0021] 发明人通过进一步的实验研究，证实纳米麦芽酚铁能够作为模拟酶催化H2O2分解，·‑ ·‑并且得到的活性氧(ROS)种类为O2 。O2 相对于H2O2具有更高水平的氧化能力，会破坏细菌细胞膜的完整性，与细胞内脂质、核酸之类的生物大分子相互作用，使多种蛋白质失活，引发细菌形态的剧烈变化并导致细菌死亡。发明人在后续的实验研究中还相继证实了纳米麦芽酚铁在pH值为5.0、粒径不超过550nm时能够非常高效地催化分解H2O2得到活性氧，除了能够杀灭一般常见的细菌，还能够有效地杀灭耐药革兰氏阳性菌，例如，当麦芽酚铁纳米模拟酶的浓度为500μg/mL，H2O2浓度为100μmol/L时，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率>
99％。

[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0023] (1)麦芽酚铁作为纳米模拟酶能够高效地催化H2O2分解得到具有强氧化性的活性·‑氧O2 ，极大程度地提高了H2O2的杀菌性能和降低了双氧水的使用浓度，避免了传统高浓度双氧水的毒副作用；

[0024] (2)麦芽酚铁作为纳米模拟酶催化H2O2分解得到具有强氧化性的活性氧O2·‑由于具有非选择细胞毒性，其抗菌能力具有广谱性，不仅能够杀灭一般常见细菌，还能有效地杀·‑灭耐药菌，例如，当麦芽酚铁纳米模拟酶的浓度为500μg/mL，H2O2浓度为100μmol/L时，O2对超级细菌“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌”的杀菌率>99％；

[0025] (3)麦芽酚铁是经欧洲药品管理局和美国食品药品管理局都批准上市的新型补铁药物，相比于现有技术中其他的过氧化物模拟酶具有更好的生物安全性和稳定性。

附图说明

[0026] 图1为麦芽酚铁纳米模拟酶在杀菌中的应用及其杀灭细菌的原理示意图；

[0027] 图2为麦芽酚铁纳米模拟酶的透射电镜图；

[0028] 图3为麦芽酚铁纳米模拟酶在有无H2O2存在下、有H2O2存在下氧化TMB以及H2O2单独氧化TMB的光谱扫描曲线；

[0029] 图4为麦芽酚铁纳米模拟酶在不同pH值和温度下催化H2O2氧化TMB的吸光度相对活性强度(％)折线图；

[0030] 图5为麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌作用效果图，其中，H2O2(‑)表示不加双氧水，H2O2(+)表示加了双氧水；

[0031] 图6为麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀菌作用的细菌存活率百分比(％)柱状图；

[0032] 图7为麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌作用扫描电镜图；

[0033] 图8为麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2产生ROS的种类验证图。

具体实施方式

[0034] 以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

[0035] 实施例1

[0036] 1、麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2的活性测定

[0037] 按照如下方法进行麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2的活性测定：

[0038] 对照组(H2O2+TMB)：取20μL 1mmol/L的双氧水溶液和20μL 20mmol/L的TMB溶液，共同置于pH＝5的醋酸盐缓冲液中，使总体系的体积为200μL；

[0039] 无H2O2组(FM+TMB)：将粒径为100～550nm的麦芽酚铁(FM)配制成水溶液，取20μL 200μg/mL的麦芽酚铁水溶液，加入20μL 20mmol/L的TMB溶液，再加入pH＝5的醋酸盐缓冲液中，使总体系的体积为200μL；

[0040] 有H2O2组(FM+H2O2+TMB)：将粒径为100～550nm的麦芽酚铁(FM)配制成水溶液，取20μL 200μg/mL的麦芽酚铁水溶液，加入20μL 1mmol/L的双氧水溶液，再将该混合液加入到pH＝5的醋酸盐缓冲液中，配制成麦芽酚铁浓度为20μg/mL、H2O2浓度为100μmol/L的水溶液，继续加入20μL 20mmol/L的TMB溶液，总体系的体积为200μL。实验中所使用的麦芽酚铁采购自北京谨明生物科技有限公司，如图2所示，通过透射电子显微镜可以观察到其粒径在100～550nm之间。发明人在实验过程中发现，麦芽酚铁的粒径越小，其作为过氧化物模拟酶的催化活性越高。

[0041] 将上述三组实验溶液分别静置孵育10min后使用酶标仪(型号：奥地利Tecan Austria GmbH)测定每组实验溶液每孔中反应体系在400～800nm处的吸光度。按照上述有H2O2组同样的配制方法配制pH值分别为2、3、4、6、7、8的实验溶液，分别静置孵育10min后使用酶标仪(型号：奥地利Tecan Austria GmbH)测定每个pH体系实验溶液每孔中反应体系在400～800nm处的吸光度。测定结果如图3和图4所示。静置孵育过程中肉眼可见有H2O2组的显色底物3,3',5,5'‑四甲基联苯胺呈现蓝色，说明麦芽酚铁能够催化H2O2分解出活性氧。从图
3可知，麦芽酚铁纳米模拟酶可以催化H2O2进而氧化TMB发生反应，在652nm处产生明显吸收峰。

[0042] 将50μL 200μg/mL的麦芽酚铁纳米模拟酶和50μL 1mmol/L的双氧水加入到20mmol/L的醋酸盐缓冲液(pH＝5)中，向其中加入50μL 20mmol/L的TMB，混合液用pH＝5的醋酸盐缓冲液定容至500μL。将该混合液置于金属加热器中，在20‑60℃范围内、温度梯度为
5℃的条件下分别加热浴孵育反应10min，使用酶标仪测量各个温度下混合液在652nm处的吸光度值。所有测定均平行进行三次。测定结果见图4。

[0043] 从图4可知，当环境pH值为5.0时，温度为37℃时，麦芽酚铁纳米模拟酶表现出良好的催化活性；虽然pH＝3.0时，相对活性接近100％，但是pH＝3.0的环境不利于细菌生长，在这种较强的酸性条件下，细菌本身比较难以存活，会影响对麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2杀菌性能的研究结果。

[0044] 2.耐药细菌培养及菌悬液制备

[0045] (1)耐药菌培养

[0046] 本实施例中使用采购自上海诺北生物科技有限公司的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300评价麦芽酚铁纳米模拟酶催化过氧化氢杀菌的性能。

[0047] 首先，采用平板划线法将细菌涂布在LB琼脂平板上，放入37℃的培养箱过夜培养，然后在培养好的平板上挑出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的单个菌落，接种在40mL LB肉汤中，并于37℃振荡温育12小时。所使用的LB肉汤为北京陆桥技术股份有限公司的CM158培养基LB肉汤。

[0048] (2)菌悬液的制备

[0049] 移取上述培养好细菌的LB肉汤6mL加入到无菌离心管中，在6000rpm、4℃条件下离心5min，弃去上清的肉汤，加入6mL pH＝5.0的PBS缓冲液后重悬，再次离心；得到的菌种用pH＝5.0的PBS缓冲液洗涤3次，最后用pH＝5.0的PBS缓冲液稀释，使得稀释后的悬浮液在OD＝600nm处的吸光值为0.5，所制备的悬浮液即为菌悬液；将所述菌悬液存放在4℃环境下备用。

[0050] (3)麦芽酚铁纳米酶催化H2O2的杀菌性能测定

[0051] 采用平板菌落计数法评价麦芽酚铁纳米酶催化H2O2的杀菌性能，具体操作如下：将8
50μL浓度为10 CFU/mL的菌悬液加入到350μL pH＝5.0的PBS缓冲液中，再加入50μL不同浓度的麦芽酚铁纳米模拟酶水溶液和50μL 1mmol/L双氧水溶液；得到的混合液中麦芽酚铁纳米模拟酶的浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL，H2O2浓度为100μmol/L，耐
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甲氧西林金黄色葡萄球菌浓度为1.0×10CFU/mL；将所述混合液在37℃下振荡孵育15min，然后采用平板涂布法将100μL所述混合液涂布于LB琼脂平板上，在37℃下培养18h，培养完成后菌落计数计算细菌存活率。按照同样的操作方法和单一变量原则设置对照组进行实验，测定的结果见图5和图6。

[0052] 将图5中第一排的五个LB琼脂平板从左至右分别编号为R11、R12、R13、R14、R15，第二排的五个LB琼脂平板从左至右分别编号为R21、R22、R23、R24、R25。图5中H2O2(‑)表示不向所述混合液A中加入双氧水，H2O2(+)表示所述混合液A中加了双氧水，即R11的LB琼脂平板上涂布的是由pH＝5.0的PBS缓冲液和菌悬液组成的混合液，R11的混合液中耐甲氧西林金黄7
色葡萄球菌浓度为1.0×10CFU/mL；R12～R15的LB琼脂平板上涂布的是由麦芽酚铁纳米模拟酶水溶液、pH＝5.0的PBS缓冲液和菌悬液组成的混合液，R12～R15的混合液中耐甲氧西
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林金黄色葡萄球菌浓度为1.0×10 CFU/mL，麦芽酚铁纳米模拟酶的浓度分别为50μg/mL、
100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL；R21的琼脂平板上涂布的是由双氧水、pH＝5.0的PBS缓冲液和菌悬液组成的混合液，R21的混合液中H2O2浓度为100μmol/L，耐甲氧西林金黄色葡萄球
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菌浓度为1.0×10CFU/mL；R22～R25的LB琼脂平板上涂布的是由双氧水、麦芽酚铁纳米模拟酶水溶液、pH＝5.0的PBS缓冲液和菌悬液组成的混合液，R22～R25的混合液中H2O2浓度为
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100μmol/L，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌浓度为1.0×10CFU/mL，麦芽酚铁纳米模拟酶的浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL。

[0053] 从图中R21显示的结果可以看出，只使用双氧水杀菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的数量相对于R11几乎没有减少；从R12～R15的结果可以看出，只使用麦芽酚铁纳米模拟酶杀菌时杀菌效果也很差；从R22～R25和图6都可以看出，随着麦芽酚铁纳米模拟酶浓度的增加，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌存活率显著降低。这说明麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2具有优异的抗菌活性。从图6中还可得知，菌种为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，麦芽酚铁纳米模拟酶浓度为200μg/mL，H2O2浓度为100μmol/L时，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率为78.5％；麦芽酚铁纳米模拟酶浓度为500μg/mL，H2O2浓度为100μmol/L时，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率>99％。

[0054] 图7为麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌作用扫描电镜图；从图中可以看出，对照组(R11)中未经任何处理的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的表面生物膜光滑完好，而在pH为5.0条件下经麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2处理相同条件的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其细菌细胞膜表面出现明显凹陷，细菌形态受到破坏，造成耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的死亡。

[0055] (4)活性氧种类确定

[0056] 将10mmol/L的2,2,6,6‑四甲基哌啶氧化物(TEMPO)、10％异丙醇(IPA)和10mmol/L·‑ 1 7的组氨酸(Histine)分别作为O2 、·OH和O2的清除剂。取350μL浓度为10CFU/mL(将制备的菌悬液预先用pH＝5.0的PBS缓冲液稀释得到)的MRSA菌悬液与50μL清除剂混合后一起孵育
3min，然后加入50μL 5mg/mL的麦芽酚铁纳米模拟酶和50μL1mmol/L的双氧水，得到三个样品体系分别记为M、N、P。

[0057] 取50μL浓度为108CFU/mL的MRSA菌悬液用450μL pH＝5.0的PBS缓冲液稀释后作为空白对照组。

[0058] 取50μL浓度为108CFU/mL的MRSA菌悬液与350μL pH＝5.0的PBS缓冲液混合后一起孵育3min，然后加入50μL 5mg/mL的麦芽酚铁纳米模拟酶和50μL 1mmol/L的双氧水，得到杀菌对照组。

[0059] 将M、N、P样品体系和空白对照组、杀菌对照组均用灭菌的pH＝5.0的PBS缓冲液各自分别稀释100倍和10000倍。最后，分别各自取100μL三个样品体系和两个对照组稀释后的细菌悬浮液涂布于LB琼脂平板上，在37℃下孵育18小时。稀释100倍后得到的细菌混悬液用于拍照定性，稀释10000倍后得到的细菌混悬液用于定量计算菌落数量。所有测定均平行进·‑行三次。测定结果如图8所示，从图中可以看出，在加入TEMPO作为O2 清除剂时，麦芽酚铁纳米模拟酶对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌效果与空白对照组无明显差别，而其他清除剂的加入并未有效抑制麦芽酚铁纳米模拟酶酶催化H2O2对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀·‑
菌效果，进而证实在催化过程中产生的有效活性氧为O2 。

[0060] 根据上述所有实验，发明人总结出麦芽酚铁纳米模拟酶催化H2O2杀菌的原理如图1·‑ ·‑所示，纳米麦芽酚铁能够作为模拟酶催化H2O2分解得到的活性氧O2 ，O2 相对于羟基自由基具有更高水平的氧化能力，会破坏细菌细胞膜的完整性，与细胞内脂质、核酸之类的生物大分子相互作用，使多种蛋白质失活，引发细菌形态的剧烈变化并导致细菌死亡。

[0061] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。