重建软组织-骨免疫修复环境骨膜-骨复合体及制备方法

摘要

本发明公开了一种重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法。经切割打样、去离子水反复漂洗、液氮冻融、超声脱钙、含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液、含Triton X‑100的PBS缓冲液、含SLES的PBS缓冲液、含DNaseⅠ的PBS缓冲液和Tris‑HCl缓冲液处理，获得无细胞的骨膜‑骨复合体材料。该复合体保留了骨膜‑骨的良好空间结构及细胞外活性成分，并提供“软骨膜‑硬骨质”双相界面，有效阻挡软组织来源的过度炎症浸润，参与软组织‑骨损伤早期免疫重塑，结合其自有的成骨、成血管优势，形成良性免疫‑修复微环境，为生物材料促进骨组织再生修复提供新思路。

权利要求

1.重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：(1)取宰杀12h以内的猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨切割打样，分割成10mm*8mm片状；

(2)取一定量的片状骨，置于4℃摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗

3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

(3)将上述预处理的片状骨置于乙二胺四乙基二钠溶液中超声脱钙12天；

(4)将脱钙处理后的片状骨用液氮冻融3个循环，温度范围为‑80℃/22℃；

(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，置于4℃摇床100rpm震荡12‑36小时；

(6)在含十二烷基醚硫酸钠磺酸的PBS缓冲液中，置于4℃摇床100rpm震荡1‑4小时；

(7)用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分；

(8)再次在含SLES的PBS缓冲液中，置于4℃摇床100rpm震荡12‑36小时；

(9)在含DNase I酶的PBS缓冲液中，37℃摇床100rpm震荡12‑24小时；

(10)在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，置于4℃摇床100rpm震荡6‑24小时；

(11)在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，置于4℃摇床100rpm震荡6‑24小时；

(12)上述步骤(10)、(11)重复3次，得到天然组织来源的骨膜‑骨复合体材料。

2.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：步骤(5)‑(9)中，每个步骤完成后均用双蒸水冲洗3‑6小时。

3.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：所述的乙二胺四乙基二钠溶液中EDTA‑Na2质量浓度为5％‑20％。

4.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：所述的含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中蛋白酶抑制剂浓度为10‑50KIU/ml。

5.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：所述的含Triton X的PBS缓冲液为质量浓度0.01％‑5％的Triton X‑100PBS缓冲液。

6.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：含SLES的PBS缓冲液为质量浓度0.01％‑5％的SLES的PBS缓冲液。

7.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：所述的含DNaseⅠ的PBS缓冲液为质量浓度为1‑2mg/mL的PBS缓冲液。

8.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：所述的含Tris‑HCl缓冲液,Tris‑HCl浓度为5‑20mM。

9.根据权利要求1所述的重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法，其特征在于：混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为20U/ml，20μg/ml；青霉素和链霉素的比例为1:1，加入的混合抗菌液与原溶液体积比为5:1。

说明书

重建软组织‑骨免疫修复环境骨膜‑骨复合体及制备方法

技术领域

[0001] 本发明主要涉及用于骨组织再生修复的生物领域，具体是一种旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法，该材料关注骨缺损伴随的软组织损伤及其对骨修复的影响，合理运用空间复合模式支架的优势促进骨再生修复。

背景技术

[0002] 由创伤、肿瘤和感染等原因引起的骨缺损是临床常见病，影响人类的健康，特别是多发的复杂性骨缺损，往往需要反复治疗，对个人造成沉重的心理压力及经济负担，对社会稳定产生潜在的影响，是临床骨科亟待解决的难题。

[0003] 近年，生物材料的替代治疗逐渐受到人们重视，其中，高刚度的单相骨替代品(如生物陶瓷、生物玻璃)由于与骨的矿物组成相似而得到广泛应用。骨愈合作为一个复杂的生理过程，包括了早期炎症调节、血管生成、成骨分化和生物矿化，这些替代材料无疑有助于成骨，但在免疫调节、血管生成方面的优势有限。通过加入化学分子、增加表面涂层等方式可以改善对局部免疫微环境的调节，但这些人工合成或局部添加的方式与生理条件仍有很大差异，而且在化学分子的用量、释放过程等多环节中存在控制难点。另外，严重的骨缺损通常也会伴随相邻软组织的损害，严重的肌肉创伤会加剧巨噬细胞向损伤部位的募集，从而损害骨愈合。因此，寻求更加合理的骨修复替代品仍然有重要意义。

[0004] 天然骨是由软质的骨膜覆盖的高度血管化的硬质组织，骨膜可以作为抵抗创伤环境中炎性细胞过度渗透的细胞屏障，也是阻隔肌肉、纤维组织等填塞缺损部位的物理屏障。而且，骨膜为皮质骨提供了充足的血供和营养，也为间充质干细胞分化成熟提供了支持性的微环境。另外，报道显示，骨膜细胞外基质来源的水凝胶可在骨损伤早期增强巨噬细胞的M2极化，发挥免疫调节功能。

[0005] 鉴于骨膜在物理阻隔、免疫调节和血管生成等方面的天然优势，结合皮质骨本身的成骨性能，本发明通过创新的细胞外基质制备技术来获得空间模式的骨膜‑骨复合体，证明其具备调节软组织‑骨损伤早期免疫微环境的性能，并协调后续成血管、成骨事件，促进骨愈合。目前，尚无有关骨膜‑骨复合体制备的报道。

发明内容

[0006] 本发明目的在于填补现有技术中，单相骨修复生物支架难以有效避免软组织来源炎症浸润，加重骨缺损修复早期免疫调节不足，因此提供一种旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的空间模式骨膜‑骨复合体及其制备方法。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，天然动物来源的空间模式骨膜‑骨复合体的制备方法，包括以下步骤：

[0008] (1)取宰杀12h以内的成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨切割打样，分割成10mm*8mm片状；

[0009] (2)取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0010] (3)将上述预处理的片状骨置于乙二胺四乙基二钠(EDTA‑Na2)溶液中超声脱钙12天；

[0011] (4)将脱钙处理后的片状骨用液氮冻融3个循环(‑80℃/22℃)；

[0012] (5)在含Triton X的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡12‑36小时；

[0013] (6)在含十二烷基醚硫酸钠磺酸(SLES)的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡1‑4小时；

[0014] (7)用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0015] (8)再次在含SLES的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡12‑36小时；

[0016] (9)在含DNase I酶的PBS缓冲液中，37℃摇床100rpm震荡12‑24小时；

[0017] (10)在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡6‑24小时；

[0018] (11)在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡6‑24小时；

[0019] (12)上述(10)、(11)步骤重复3次，得到天然组织来源的骨膜‑骨复合体材料。

[0020] 步骤(5)‑(9)中，每个步骤完成后均用双蒸水冲洗3‑6小时。

[0021] 另外，含EDTA‑Na2的脱钙液，EDTA‑Na2质量浓度为5％‑20％；

[0022] 含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，蛋白酶抑制剂浓度为10‑50K IU/ml；

[0023] 含Triton X的PBS缓冲液为质量浓度0.01％‑5％的Triton X‑100PBS缓冲液；

[0024] 含SLES的PBS缓冲液为质量浓度0.01％‑5％的SLES的PBS缓冲液；

[0025] 含DNaseⅠ的PBS缓冲液为浓度为1‑2mg/mL的PBS缓冲液；

[0026] 含Tris‑HCl缓冲液,Tris‑HCl浓度为5‑20mM；

[0027] 混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为20U/ml，20μg/ml；青霉素和链霉素的比例为1:1，加入的混合抗菌液与原溶液体积比为5:1。

[0028] 本发明针对目前用于临床软组织合并骨损伤替代品存在的问题，建立了一种天然异体组织来源的骨膜‑骨复合体支架的制备方法，该支架由成年大白猪股骨干切割打样、反复漂洗冻融、含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液、含Triton X‑100的PBS缓冲液、含SLES的PBS缓冲液、含DNaseⅠ的PBS缓冲液和Tris‑HCl缓冲液脱毒处理后获得。经由上述的制备方案可知，与现有技术相比，本发明公开具有以下主要优点：

[0029] (1)本发明所采用的骨膜‑骨支架是异体天然来源的，运用物理冻融、超声脱钙、联合脱细胞技术相结合的创新方法获得的空间模式的骨膜‑骨复合体。

[0030] (2)本发明材料通过Tris‑HCl缓冲液及无菌生理盐水反复漂洗进行脱毒，支架细胞毒性低，拥有良好的生物相容性和主要的生物活性成分，并具有难以复制的天然复杂结构。

[0031] (3)本发明所制备的材料在骨修复早期可作为免疫屏障参与巨噬细胞表型转化。

[0032] (4)本发明所制备的材料具有协调早期免疫调节和后续成骨‑血管生成事件，具备促进骨修复的性能。

附图说明

[0033] 图1是本发明材料大体图及CT扫描图；

[0034] 图2是本发明材料H&E染色、DAPI染色图和DNA定量检测图；

[0035] 图3是本发明材料天狼星红染色、偏正光观察，胶原和GAGs定量检测图；

[0036] 图4是本发明材料各个部分微观结构扫描电子显微镜图；

[0037] 图5是本发明材料原子力显微镜图、压力‑应变曲线图和刚度计算值；

[0038] 图6是本发明材料抑制巨噬细胞M1极化、抑制炎性相关基因表达图；

[0039] 图7是本发明材料促进巨噬细胞M2极化、促进抗炎性相关基因表达图；

[0040] 图8是本发明材料促进成骨相关标志物的表达；

[0041] 图9是本发明材料促进血管迁入图；

[0042] 图10是本发明材料促进骨修复的CT扫描图和组织学评估图。

具体实施方式

[0043] 下面结合附图及实施示例对本发明进行完整详细描述，但本发明的实施不仅限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0044] 实施例1：旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法[0045] (1)取材

[0046] 取宰杀12h以内健康成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨干分割成10mm*8mm片状；

[0047] (2)预处理

[0048] 取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0049] (3)脱钙

[0050] 将上述预处理的片状骨置于20％(w/v)EDTA‑2Na溶液中超声脱钙12天，超声参数为40kHZ，温度22℃；

[0051] (4)骨膜‑骨复合体获取

[0052] ①液氮冻融3个循环(‑80℃/37℃)；

[0053] ②在浓度为1％的Triton X‑100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0054] ③在浓度为1％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4小时；

[0055] ④用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0056] ⑤在浓度为1％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0057] ⑥在浓度为1mg/ml的含DNase I的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到骨膜骨支架。

[0058] (5)骨膜‑骨复合体脱毒

[0059] ①在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0060] ②在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0061] ③上述①、②两个步骤重复三次。

[0062] 经过实例1中各个步骤处理，最终获得无细胞毒性、低免疫原性、良好组织活性成分和空间复合结构的骨膜‑骨复合体。

[0063] 1.实例1中，骨膜‑骨复合体支架的大体观及脱细胞评估

[0064] 骨膜‑骨复合体支架的大体外观图及CT扫描图，如图1。

[0065] 2.实例1中，骨膜‑骨复合体支架的脱细胞评估

[0066] H&E染色显示无细胞及无细胞核成分残留，DNA定量检测几乎不含有DNA成分，如图2。

[0067] 3.实例1中，骨膜‑骨复合体支架的微观结构评估

[0068] 扫描电子显微镜观察本发明的胶原排布、骨结晶结构以及骨膜‑骨交界面连接结构，如图3。

[0069] 4.实例1中，骨膜‑骨复合体支架的表面形貌及机械评估

[0070] 原子力显微镜观察本发明微观表面形貌，如图4。

[0071] 机械力学测试评估记录压力‑应变曲线，计算空间模式骨膜骨支架骨膜相和骨相的刚度，如图5。

[0072] 5.实例1中，骨膜‑骨复合体支架的免疫调节功能验证

[0073] 骨膜‑骨复合体支架影响巨噬细胞表型，骨膜相抑制巨噬细胞向M1方向极化，抑制炎症相关基因表达；骨相无法避免地诱导巨噬细胞向M1方向极化，如图6；

[0074] 骨膜‑骨复合体支架骨膜相诱导巨噬细胞向M2方向极化，促进抗炎性相关基因表达，如图7。

[0075] 6.实例1中，骨膜‑骨复合体支架促进成骨性能验证

[0076] 骨膜‑骨复合体支架促进成骨相关基因(Runx2,ALP,Col 1a1,OPN,OCN)表达，如图8。

[0077] 7.实例1中，骨膜‑骨复合体支架促进成血管性能验证

[0078] 骨膜‑骨复合体支架促进血管形成及迁入，如图9。

[0079] 8.实例1中，骨膜‑骨复合体支架促进骨修复的评估

[0080] 将骨缺损大鼠分为四组，分别为单纯缺损组、软化的脱细胞骨治疗组、骨膜‑骨复合体治疗组。分别于骨缺损处填充相应支架。治疗4周及8周后可发现，骨膜‑骨复合体治疗组效果显著优于其余三组。如图10。

[0081] 实施例2：旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法[0082] (1)取材

[0083] 取宰杀12h以内健康成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨干分割成10mm*8mm片状；

[0084] (2)预处理

[0085] 取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0086] (3)脱钙

[0087] 将上述预处理的片状骨置于20％(w/v)EDTA‑2Na溶液中超声脱钙12天，超声参数为40kHZ，温度22℃；

[0088] (4)骨膜‑骨复合体获取

[0089] ①液氮冻融3个循环(‑80℃/37℃)；

[0090] ②在浓度为2％的Triton X‑100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0091] ③在浓度为2％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4小时；

[0092] ④用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0093] ⑤在浓度为2％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0094] ⑥在浓度为1mg/ml的含DNase I的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到骨膜骨支架。

[0095] (5)骨膜‑骨复合体脱毒

[0096] ①在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0097] ②在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0098] ③上述①、②两个步骤重复三次。

[0099] 最终获得无细胞毒性、低免疫原性、良好组织活性成分和空间复合结构的骨膜‑骨复合体。

[0100] 实施例3：旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法[0101] (1)取材

[0102] 取宰杀12h以内健康成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨干分割成10mm*8mm片状；

[0103] (2)预处理

[0104] 取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0105] (3)脱钙

[0106] 将上述预处理的片状骨置于20％(w/v)EDTA‑2Na溶液中超声脱钙12天，超声参数为40kHZ，温度22℃；

[0107] (4)骨膜‑骨复合体获取

[0108] ①液氮冻融3个循环(‑80℃/37℃)；

[0109] ②在浓度为1％的Triton X‑100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0110] ③在浓度为0.5％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4小时；

[0111] ④用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0112] ⑤在浓度为0.5％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0113] ⑥在浓度为1mg/ml的含DNase I的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到骨膜骨支架。

[0114] (5)骨膜‑骨复合体脱毒

[0115] ①在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0116] ②在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0117] ③上述①、②两个步骤重复三次。

[0118] 最终获得无细胞毒性、低免疫原性、良好组织活性成分和空间复合结构的骨膜‑骨复合体。

[0119] 实施例4：旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法[0120] (1)取材

[0121] 取宰杀12h以内健康成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨干分割成10mm*8mm片状；

[0122] (2)预处理

[0123] 取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0124] (3)脱钙

[0125] 将上述预处理的片状骨置于20％(w/v)EDTA‑2Na溶液中超声脱钙12天，超声参数为40kHZ，温度22℃；

[0126] (4)骨膜‑骨复合体获取

[0127] ①液氮冻融3个循环(‑80℃/37℃)；

[0128] ②在浓度为2％的Triton X‑100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0129] ③在浓度为0.5％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4小时；

[0130] ④用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0131] ⑤在浓度为0.5％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0132] ⑥在浓度为1mg/ml的含DNase I的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到骨膜骨支架。

[0133] (5)骨膜‑骨复合体脱毒

[0134] ①在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0135] ②在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0136] ③上述①、②两个步骤重复三次。

[0137] 最终获得无细胞毒性、低免疫原性、良好组织活性成分和空间复合结构的骨膜‑骨复合体。

[0138] 实施例5：旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法[0139] (1)取材

[0140] 取宰杀12h以内健康成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨干分割成10mm*8mm片状；

[0141] (2)预处理

[0142] 取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0143] (3)脱钙

[0144] 将上述预处理的片状骨置于20％(w/v)EDTA‑2Na溶液中超声脱钙12天，超声参数为40kHZ，温度22℃；

[0145] (4)骨膜‑骨复合体获取

[0146] ①液氮冻融3个循环(‑80℃/37℃)；

[0147] ②在浓度为0.5％的Triton X‑100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0148] ③在浓度为0.5％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4小时；

[0149] ④用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0150] ⑤在浓度为0.5％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0151] ⑥在浓度为1mg/ml的含DNase I的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到骨膜骨支架。

[0152] (5)骨膜‑骨复合体脱毒

[0153] ①在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0154] ②在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0155] ③上述①、②两个步骤重复三次。

[0156] 最终获得无细胞毒性、低免疫原性、良好组织活性成分和空间复合结构的骨膜‑骨复合体。

[0157] 实施例6：旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法[0158] (1)取材

[0159] 取宰杀12h以内健康成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨干分割成10mm*8mm片状；

[0160] (2)预处理

[0161] 取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0162] (3)脱钙

[0163] 将上述预处理的片状骨置于20％(w/v)EDTA‑2Na溶液中超声脱钙12天，超声参数为40kHZ，温度22℃；

[0164] (4)骨膜‑骨复合体获取

[0165] ①液氮冻融3个循环(‑80℃/37℃)；

[0166] ②在浓度为1％的Triton X‑100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0167] ③在浓度为1％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4小时；

[0168] ④用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0169] ⑤在浓度为1％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0170] ⑥在浓度为2mg/ml的含DNase I的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到骨膜骨支架。

[0171] (5)骨膜‑骨复合体脱毒

[0172] ①在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0173] ②在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0174] ③上述①、②两个步骤重复三次。

[0175] 最终获得无细胞毒性、低免疫原性、良好组织活性成分和空间复合结构的骨膜‑骨复合体。

[0176] 实施例7：旨在重建软组织‑骨免疫修复环境的骨膜‑骨复合体及其制备方法[0177] (1)取材

[0178] 取宰杀12h以内健康成年大白猪的股骨，分离干骺端，收集股骨干部分，去除内部骨髓腔，将股骨干分割成10mm*8mm片状；

[0179] (2)预处理

[0180] 取一定量的片状骨，置于低温(4℃)摇床100rpm震荡，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次10min，去除血液、贴附的脂肪碎片和其他杂质；

[0181] (3)脱钙

[0182] 将上述预处理的片状骨置于20％(w/v)EDTA‑2Na溶液中超声脱钙12天，超声参数为40kHZ，温度22℃；

[0183] (4)骨膜‑骨复合体获取

[0184] ①液氮冻融3个循环(‑80℃/37℃)；

[0185] ②在浓度为1％的Triton X‑100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；

[0186] ③在浓度为1％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡4小时；

[0187] ④用封口膜具包裹骨膜‑骨复合体的骨膜部分，使其尽可能不对外暴露；

[0188] ⑤在浓度为1％的含SLES的去离子水中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0189] ⑥在浓度为2mg/ml的含DNase I的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20U/ml，20μg/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到骨膜骨支架。

[0190] (5)骨膜‑骨复合体脱毒

[0191] ①在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris‑HCl)缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0192] ②在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；

[0193] ③上述①、②两个步骤重复三次。

[0194] 最终获得无细胞毒性、低免疫原性、良好组织活性成分和空间复合结构的骨膜‑骨复合体。

[0195] 实施例2‑7均能制备出脱细胞完全、活性成分保留完好和空间三维结构完整的骨膜‑骨复合体脱细胞材料，相应结果与实施例1基本一致。