一套具包容性且精准鉴定、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的方法

摘要

本发明公开了一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系。该技术体系根据该基因家族存在清晰的“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级分化而设置其两级检测标记。该技术体系可用于稻瘟病Pita抗病等位基因家族等位基因的鉴定、挖掘及克隆，具有系统而严谨的包容性及可比较性。可广泛应用于提高禾本科作物包括但不限于水稻种质资源利用的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的合理布局并延长其使用寿命。

权利要求

1.一套具包容性且精准鉴定、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的方法，其特征在于，该方法由“功能性单倍型‑抗病等位基因”两级检测标记组成并逐级推进，供试品种是否携带目标基因由其综合结果而决定；

具体地，所述方法包含：

(1)该基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序：

通过家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域；

设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于PCR技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性；只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种；在后续的检测中，非功能性品种可被排除；

(2)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑YM的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计1个功能特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pita‑YM基因携带者属于Pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且该功能特异性分子标记之基因型与Pita‑YM参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pita‑YM；

(3)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KT的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计1个特异性分子标记组合；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pita‑KT基因携带者属于Pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且该功能特异性分子标记组合之基因型与Pita‑KT参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pita‑KT；

(4)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑9311的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pita‑9311基因携带者属于Pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型都与Pita‑9311参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pita‑9311；

(5)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑Q15的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pita‑Q15基因携带者属于Pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型都与Pita‑Q15参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pita‑Q15；

(6)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KSL的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的SNP，并设计2个特异性分子标记；进行基于PCR技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；Pita‑KSL基因携带者属于Pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型都与Pita‑KSL参考品种的基因型相同的品种；反之，任一检测标记不符合本方法的检测结果都不是目标基因Pita‑KSL；

具体地，上述方法中：

G444C A527T

(1)中的单倍型特异性分子标记组合为Pita‑F/N 及Pita‑F/N ；其序列分别为SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示；

其中，标记说明：F/N，功能性functional/非功能性non‑functional；上标G444C，意为位于目标基因#444位置的特异性SNP，如此类推；

T3387C

(2)中的目标基因Pita‑YM特异性分子标记为Pita‑YM ；其序列为SEQ IDNO.5～6所示；

T3387C

(3)中的目标基因Pita‑KT特异性分子标记组合为上述Pita‑YM 以及Pita‑KT/G384C G4217TYM 及Pita‑KT/YM ；其序列为SEQ ID NO.5～6,SEQ ID NO.7～8,SEQ ID NO.9～10所示；

G17T

(4)中的目标基因Pita‑9311特异性分子标记组合为Pita‑9311/CO 及Pita‑T959C

9311 ；其序列为SEQ ID NO.11～12,SEQ ID NO.13～14所示；

A352G G4231A

(5)中的目标基因Pita‑Q15特异性分子标记组合为Pita‑Q15 及Pita‑Q15 ；其序列为SEQ ID NO.15～16,SEQ ID NO.17～18所示；

A984G C1991T

(6)中的目标基因Pita‑KSL特异性分子标记组合为Pita‑KSL 及Pita‑KSL ；其序列为SEQ ID NO.19～20,SEQ ID NO.21～23所示；

C1991T

特别地，Pita‑KSL 之PCR扩增由2条正向及1条反向引物组成。

2.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，应用于在复杂的稻瘟病Pita抗病基因家族中对新旧等位基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘如下5个目标基因：稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑YM，序列如GenBank AF207842.1所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KT，序列如GenBank OK169585所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑9311，序列如GenBank OK169579所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑Q15，序列如GenBank OK169583所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KSL，序列如GenBank OK169582所示。

3.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，应用于在未知目标基因的种质资源中，通过上述SEQ ID NO.1～23所示的11个标记基因型的综合结果，鉴定该基因家族的已知功能基因，以及挖掘新型的目标基因：稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因Pita‑CO，Pita‑ZS及Pita‑IR36；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑CO，序列如GenBank OK169580所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑ZS，序列如GenBank OK169584所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑IR36，序列如GenBank OK169581所示。

4.权利要求1所述方法的应用，其特征在于，应用于挖掘如下所述7个新型的抗病等位基因及其序列在植物抗病育种计划中的应用：稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KT，序列如GenBank OK169585所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑9311，序列如GenBank OK169579所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑Q15，序列如GenBank OK169583所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KSL，序列如GenBank OK169582所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑CO，序列如GenBank OK169580所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑ZS，序列如GenBank OK169584所示；

稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑IR36，序列如GenBank OK169581所示。

说明书

一套具包容性且精准鉴定、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因

家族等位基因的方法

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，更具体地，涉及一套具有包容性且精准鉴定、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系。

背景技术

[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，由稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是水稻生产最严重的限制因素之一，每年都造成大量的粮食损失。从环境保护及农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗病育种依赖于对育种材料抗性表型的直接鉴定、选择，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定、选择结果容易造成误差。特别地，抗病基因之间由于基因互作而发生抗谱重叠、覆盖等问题，同类目标基因聚合的表型直接选择效率很低甚或不可能。随着分子标记鉴定技术的发展，其准确、可靠且不受环境影响等优点使该技术已成为植物育种的主流技术，由此大大加快了育种工作的目的性及效率。

[0003] 一般地，在寄主植物抗病基因与病原菌无毒基因漫长的“军备竞赛”过程中，抗病基因以进化成本最低的“复等位基因家族”(multiple‑allele family)或“基因簇”(gene cluster)的形式，产生新的抗病特异性才能跟上无毒基因快速变异的步伐。也就是说，在病原菌长期而强烈的选择压力下，上述“基因家族”一般地产生功能性/非功能性的单倍型(haplotype)分化；如果是在育种计划中长期使用的广谱持久抗性“基因家族”，在功能性单倍型中会进一步分化为具有不同抗病特异性的等位基因(functional allele)(Zhai et al.2011,New Phytologist,189:321‑334)。

[0004] 在上述“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级进化历程中都存在明显而清晰的核苷酸多态性，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)以及多核苷酸多态性【即基因组分化区域(diverged genomic region)，以及插入/ 缺失，(Insertion/Deletion,InDel)】。在此，将功能基因内部的核苷酸多态性统称为功能特异性核苷酸多态性(简称功能特异性)。由此一方面，不同抗源品种鉴定到的抗病基因经常聚集于同一基因家族中，另一方面，广谱持久抗源品种通常在多个基因家族中同时存在功能性的抗病基因。以稻瘟病抗病基因为例，在目前报道的100余个主效基因中，据信至少40％是已知基因的等位基因甚或同一基因；这些基因主要聚集于水稻染色体1(Pi37家族)，2(Pita家族)，6(Pi2/Pi9家族)， 8(Pi36家族)，9(Pii家族)，11(Pik家族)以及12(Pita家族)等基因家族中 (Sharma et al.2012,Agricultural Research,1:37‑52；Liu and Wang 2016,National Science Review,3:295‑308)。

[0005] 如上所述，位于染色体12着丝粒区域的Pita基因家族是在全球水稻抗病育种计划中应用最广泛的广谱持久抗源之一(Bryan et al.2000,The Plant Cell,12: 2033‑2045；Jia et al.2002,Crop Science,42:2145‑2149；Jia et al.2004, Phytopathology,94:
296‑301；Wang et al.2007,Plant Breeding,126:36‑42；Liu and Wang 2016,National Science Review,3:295‑308)。为了把上述广谱持久抗源基因利用于水稻抗病育种计划中，科研工作者先后开发了2套主要的分子标记【YL155/YL87,YL183/YL87(Jia et al.2002,Crop Science,42:2145‑2149；Jia et al. 2004,Phytopathology,94:296‑301；Wang et al.2007,Plant Breeding,126:36‑42；时克等，2009，植物遗传资源学报，10:21‑26；李进斌等，2012，中国水稻科学， 26:593‑599；Imam et al.2014,Euphytica,196:199‑211；Song et al.2014,Korean Journal of Plant Research,27:687‑700；Yadav et al.2019,Plos One,0211061)；Pita‑ID13,Pita‑ID04(Kitazawa et al.2019,Breeding Science,69:68‑
83)】，以提高其利用效率(下划线为所用标记)。

[0006] 由于Pita基因家族是继Pik抗病等位基因家族之后，在水稻抗病育种计划中又一被南北稻作区长期且广泛利用的抗源(时克等，2009，植物遗传资源学报， 10:21‑26；李进斌等，2012，中国水稻科学，26:593‑599)，在稻瘟病菌持续而强烈的选择压力下，在“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级进化层面都产生了复杂而多样的变异。但是，这些研究成果都没有形成具有可操作性的、能广泛应用于生产实践的技术体系。换言之，上述报道的2套分子标记都是针对特定基因的特定位点而零散开发的，彼此之间不具有清晰的可比性及逻辑性，更不具有包容性。而且只有一套标记(YL155/YL87,YL183/YL87)被广泛利用。对于复杂的基因组区域、复杂的基因家族而言，由此产生3个突出而现实的问题是：(1)任何没有基于其进化层次而设计的单一分子标记都难以鉴别在复杂的基因组区域、复杂的基因家族容易产生测序错误等问题；(2)任何没有基于其进化层次而设计的单一分子标记都难以避免因分子标记的技术局限性而产生标记假阳性或者标记假阴性的问题；(3)任何没有基于其进化层次而设计的单一分子标记都不可能构成一个具有包容性及可比性的技术体系而在复杂基因家族中不断地挖掘、鉴定并命名新基因，以及鉴别在复杂基因家族中容易产生的“同名异质基因”以及“真假目标基因”等问题。

发明内容

[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族功能等位基因的技术体系。该技术体系根据该基因家族存在清晰的“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级分化而设置其两级检测标记；其G444C功能性单倍型/非功能性单倍型检测的最优单倍型特异性分子标记组合为Pita‑F/N 及A527T
Pita‑F/N ；其功能性单倍型之抗病等位基因 Pita‑YM检测的最优目标基因特异性分子T3387C
标记为Pita‑YM ；其功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KT检测的最优目标基因特异性T3387C G384C G4217T
分子标记组合为 Pita‑YM ,Pita‑KT/YM ,Pita‑KT/YM ；其功能性单倍型之抗病G17T
等位基因Pita‑9311检测的最优目标基因特异性分子标记组合为Pita‑9311/CO , Pita‑T959C
9311 ；其功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑Q15检测的最优目标基因特异性分子标记A352G G4231A
组合为Pita‑Q15 ,Pita‑Q15 ；其功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KSL检测的最优A984G C1991T
目标基因特异性分子标记组合为Pita‑KSL , Pita‑KSL ；任一检测标记不符合本技术体系的鉴定结果都不是相应的目标基因而推断为该基因家族可能的新等位基因。

[0008] 本发明的第二目的是提供一种稻瘟病Pita抗病基因家族序列比较及其特异性序列的鉴定方法。

[0009] 本发明的第三目的是提供一种稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记及其鉴定方法。

[0010] 本发明的第四目的在于提供上述稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑YM的特异性分子标记及其鉴定方法。

[0011] 本发明的第五目的在于提供上述稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KT的特异性分子标记及其鉴定方法。

[0012] 本发明的第六目的在于提供上述稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑9311的特异性分子标记及其鉴定方法。

[0013] 本发明的第七目的在于提供上述稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑Q15的特异性分子标记及其鉴定方法。

[0014] 本发明的第八目的在于提供上述稻瘟病Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KSL的特异性分子标记及其鉴定方法。

[0015] 本发明的第九目的在于提供利用本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系之两级标记从参考品种中鉴别并挖掘其新型抗病等位基因Pita‑CO及Pita‑ZS的应用及实例。

[0016] 本发明的第十目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系从该基因家族中甄别真假基因特异性SNP以及真假目标基因Pita‑YM的应用及实例。

[0017] 本发明的第十一目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系从该基因家族中甄别真假基因特异性SNP以及真假目标基因Pita‑9311的应用及实例。

[0018] 本发明的第十二目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广东省稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的应用及实例。

[0019] 本发明的第十三目的在于提供利用本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力比较的实例。

[0020] 本发明的第十四目的在于提供利用本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系克隆并验证新型抗病等位基因Pita‑Q15抗性功能的实例。

[0021] 本发明实现上述目的的技术方案同权利要求书和具体实施例中所记载。

[0022] 本发明提供的技术体系可用于稻瘟病Pita抗病等位基因家族功能基因的鉴定、挖掘及克隆，具有系统而严谨的包容性及可比较性。可广泛应用于提高禾本科作物包括但不限于水稻种质资源利用的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的合理布局并延长其使用寿命。

附图说明

[0023] 图1.一套具有包容性且精准鉴定、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因之技术体系开发及应用的路线图。

[0024] 图2.Pita抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定。其中，

[0025] 已克隆的Pita‑YM【供体品种Yashiro Mochi(YM),Bryan et al.2000；在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因登录号为：AF207842】；为了便于序列比对分析，加入了14个推测为目标基因携带者的测序参考品种C101PKT,IR64,Shennong265,Tadukan,Katy(KT), Tetep,9311,C101A51,Zhenshan 97(ZS),Kasalath(KSL),CO39(CO),IR8,Shuhui 498，Q15；以及6个推测为非目标基因携带者的测序参考品种 Hitomebore,Nipponbare(NPB),Suijing 18,MInghui 63,Tsuyuake,Koshihikari相应的基因组序列；

[0026] 所有已经验证的单倍型及等位基因的特异性SNP都已经编号(按标记使用顺序)并绿色标注(详见图2～8)。

[0027] 特别地，由于上述21条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图3～8全面地了解Pita抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

[0028] 图3.Pita抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用[0029] 3a:2个单倍型特异性的最优SNP；

[0030] 3b:2个最优的单倍型特异性标记【#1,Pita‑F/NG444C(上带，非功能性单倍型；下带，A527T功能性单倍型)；#2,Pita‑F/N (上带，功能性单倍型；下带，非功能性单倍型)】对14个第一套参考品种的鉴定实例；其中，

[0031] 功能性单倍型品种：CK1(Yashiro Mochi；Pita‑YM)；CK2(Katy；Pita‑KT)； CK3(C101PKT；Pita‑KT)；CK4(IR8；Pita‑9311)；CK5(93‑11；Pita‑9311)；CK6 (Q15；Pita‑Q15)；CK7(Kasalath；Pita‑KSL)；CK8(CO39；Pita‑CO39)；CK9 (C101A51；Pita‑ZS)；CK10(ZS97；
Pita‑ZS)；

[0032] 非功能性单倍型品种：CK11(Nipponbare；Pita‑NonF)；CK12(MH63； Pita‑NonF)；CK13(Tsuyuake；Pita‑NonF)；CK14(Koshihikari；Pita‑NonF)；M, DL‑500；

[0033] 供试品种说明：14个第一套参考品种之信息如上所述，如非必要，以下恕不赘述。

[0034] 标记说明：#1及#2，为标记的编号；基因符号为斜体，表示功能基因；基因符号为正体，表示标记；F/N，功能性(functional)/非功能性(non‑functional)；上标G444C，意为位于目标基因#444位置的特异性SNP，如此类推。

[0035] 图4.Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑YM功能特异性分子标记的开发及应用

[0036] 4a:1个Pita‑YM功能特异性的最优SNP；

[0037] 4b:1个Pita‑YM功能特异性标记【#3,Pita‑YMT3387C(上带，非目标基因；

[0038] 下带，目标基因)】对14个第一套参考品种的鉴定实例，其中，

[0039] 目标基因品种：CK1(Yashiro Mochi；Pita‑YM)；

[0040] 非目标基因品种：其余13个第一套参考品种。

[0041] 图5.Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KT功能特异性分子标记的开发及应用

[0042] 5a:1个Pita‑YM功能特异性的最优SNP；

[0043] 5b～c:2个Pita‑KT/YM共享的最优SNP；

[0044] 5d:3个Pita‑KT/YM功能特异性标记组合【#3,Pita‑YMT3387C(上带，非目标基因；下G384C带，目标基因)；#4,Pita‑KT/YM (上带，非目标基因；下带，目标基因)；#5,Pita‑KT/G4217T
YM (上带，非目标基因；下带，目标基因)】对14个第一套参考品种的鉴定实例，其中，[0045] 目标基因品种：CK2(Katy；Pita‑KT)；CK3(C101PKT；Pita‑KT)；

[0046] 非目标基因品种：其余12个第一套参考品种。

[0047] 图6.Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑9311功能特异性分子标记的开发及应用

[0048] 6a:1个Pita‑9311/CO共享的最优SNP；

[0049] 6b:1个Pita‑9311功能特异性的最优SNP；

[0050] 6c:2个Pita‑9311功能特异性标记组合【#6,Pita‑9311/COG17T(上带，非目标基因；T959C
下带，目标基因)；#7,Pita‑9311 (上带，非目标基因；下带，目标基因)】对14个第一套参考品种的鉴定实例，其中，

[0051] 目标基因品种：CK4(IR8；Pita‑9311)；CK5(93‑11；Pita‑9311)；

[0052] 非目标基因品种：其余12个第一套参考品种。

[0053] 图7.Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑Q15功能特异性分子标记的开发及应用

[0054] 7a～b:2个Pita‑Q15功能特异性的最优SNP；

[0055] 7c:2个Pita‑Q15功能特异性标记组合【#8,Pita‑Q15A352G(上带，非目标基因；下带，G4231A目标基因)；#9,Pita‑Q15 (上带，非目标基因；下带，目标基因)】对 14个第一套参考品种的鉴定实例，其中，

[0056] 目标基因品种：CK6(Q15；Pita‑Q15)；

[0057] 非目标基因品种：其余13个第一套参考品种。

[0058] 图8.Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KSL功能特异性分子标记的开发及应用

[0059] 8a～b:2个Pita‑KSL功能特异性的最优SNP；

[0060] 8c:2个Pita‑KSL功能特异性标记组合【#10,Pita‑KSLA984G(上带，目标基因；下带，C1991T非目标基因)；#11,Pita‑KSL (上带，非目标基因；下带，目标基因)】对14个第一套参考品种的鉴定实例，其中，

[0061] 目标基因品种：CK7(Kasalath；Pita‑KSL)；

[0062] 非目标基因品种：其余13个第一套参考品种。

[0063] 图9.利用本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系之两级标记从参考品种中鉴别并挖掘其新型抗病等位基因Pita‑CO及Pita‑ZS的应用及实例

[0064] 9a:基于一级标记对14个第一套参考品种的单倍型鉴定，结果表明， CK1～10为功能性单倍型品种；CK11～14为非功能性单倍型品种；

[0065] 9b:基于二级标记对14个第一套参考品种的等位基因鉴定，其中，

[0066] b‑1:基于1个Pita‑YM特异性标记的等位基因鉴定，结果表明，CK1为 Pita‑YM携带者(红色)；

[0067] b‑2:基于3个Pita‑KT特异性标记组合的等位基因鉴定，结果表明，CK2～3 为Pita‑KT携带者(蓝色)；

[0068] b‑3:基于2个Pita‑9311特异性标记的等位基因鉴定，结果表明，CK4～5为 Pita‑9311携带者(绿色)；

[0069] b‑4:基于2个Pita‑Q15特异性标记的等位基因鉴定，结果表明，CK6为 Pita‑Q15携带者(浅红色)；

[0070] b‑5:基于2个Pita‑KSL特异性标记的等位基因鉴定，结果表明，CK7为 Pita‑KSL携带者(浅蓝色)；

[0071] 综合上述结果分析，CK8为Pita‑CO携带者(浅绿色)，CK9～10为Pita‑ZS 携带者(深黄色；二者于#6标记的基因型不同)。

[0072] 图10.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系甄别真假特异性基因组序列及目标基因 (Pita‑YM)的应用及实例[0073] 10a1:1个Pita‑YM特异性的最优SNP，此区域参考序列的结果显示， Yashiro Mochi(CK1)与其他13个参考品种之间存在1个SNP；

[0074] 10a2:由上述SNP开发的Pita‑YM特异性标记对14个第一套参考品种的鉴定实例，结果显示，CK1与其他13个参考品种的基因型确实不一致，由此推测该SNP是真实的，CK1就是Pita‑YM的携带者；

[0075] 10b1:4个Yashiro Mochi(CK1)的特异性SNP，此区域参考序列的结果显示，Yashiro Mochi(CK1)似乎与其他13个参考品种之间存在4个SNP；

[0076] 10b2:由上述4个SNP开发的4个附加标记(SEQ ID NO.24～SEQ ID NO.32) 对14个第一套参考品种的鉴定实例，结果显示，所有14个参考品种的基因型都一致，由此推断，上述4个Yashiro Mochi(CK1)的特异性SNP都是错误而不真实的；

[0077] 结论：Yashiro Mochi(CK1)序列虽然存在错误，但仍是Pita‑YM的携带者；

[0078] 特别地，C1149T由于位于富含A,T碱基区域而难以清晰地被检测，但是仍可判断该SNP是不真实的。

[0079] 图11.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系甄别真假特异性基因组序列及目标基因 (Pita‑9311)的应用及实例，其中，

[0080] 11a1:1个Pita‑9311特异性的最优SNP，参考序列的结果显示，9311(CK5) 与IR8(CK4),Shuhui 498(未参试)等2个参考品种的序列一致，而与其余18个参考品种的不一致；

[0081] 11a2:由上述SNP开发的Pita‑9311功能特异性标记对14个第一套参考品种的鉴定实例，结果显示，CK5与CK4的基因型一致，而与其余12个第一套参考品种的不一致，由此推测此SNP是真实的，二者都是Pita‑9311的携带者；

[0082] 11b1:1个Pita‑9311的特异性SNP，参考序列的结果显示，9311(CK5)似乎与IR8(CK4),Shuhui 498(未参试)等2个参考品种的序列完一致，而与其余 18个参考序列的不一致；

[0083] 11b2:由该SNP开发的附加标记(SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.34)对14个第一套参考品种的鉴定实例，结果显示，所有参考品种的基因型一致，由此推断，此SNP是错误而不真实的；

[0084] 结论：本发明的技术体系是在甄别了主要SNP的基础上构建的，具有强大的包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的能力；虽然第2个SNP是不真实的，但是仍可推断9311(CK5)与IR8(CK4)都是 Pita‑9311的携带者。

[0085] 图12.利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广东省稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例。其中，

[0086] 12a:2个Pita功能性单倍型特异性最优标记【#1，上带，非功能性单倍型(黑色)；下带，功能性单倍型(红色)；#2，上带，功能性单倍型(红色)；下带，非功能性单倍型(黑色)】对44个供试品种的鉴定，结果表明，仅CV10,CV18等 2个品种为非功能性单倍型品种，其余42个品种为功能性单倍型品种；

[0087] 12b:1个Pita‑YM功能特异性最优标记【#3上带，非目标基因；下带，目标基因(红色)】对44个供试品种的鉴定，结果表明，无Pita‑YM携带者；

[0088] 12b～c:1个Pita‑KT功能特异性最优标记组合【#3，上带，目标基因；下带，非目标基因；#4及#5，上带，非目标基因；下带，目标基因(蓝色)】对44个供试品种的鉴定，结果表明，CV3,CV8,CV14～15,CV19,CV23,CV25～26,CV29, CV34,CV37,CV44等12个品种为Pita‑KT携带者；

[0089] 12d:1个Pita‑9311功能特异性最优标记组合【#6及#7,上带，非目标基因；下带，目标基因(绿色)】对44个供试品种的鉴定，结果表明，CV11～12,CV22, CV24,CV27～28,CV30～33,CV38～43等16个品种为Pita‑9311携带者；

[0090] 12e:2个Pita‑Q15功能特异性最优标记【#8及#9,上带，非目标基因；下带，目标基因(浅红色)】对44个供试品种的鉴定，结果表明，仅CV1等1 个品种为Pita‑Q15携带者；

[0091] 12f:2个Pita‑KSL功能特异性最优标记【#10,上带，目标基因；下带，非目标基因；#11,上带，非目标基因；下带，目标基因(浅蓝色)】对44个供试品种的鉴定，结果表明，无Pita‑KSL携带者；

[0092] 12a～f:综合上述结果，CK6为功能性单倍型品种，而且其基因型与CK1～5 的不同，被推断为Pita‑CO携带者(浅绿色)；与之相同的CV16～17等2个品种也是Pita‑CO携带者；

[0093] 12a～f:综合上述结果，CK7为功能性单倍型品种，而且其基因型与CK1～6 的不同，被推断为Pita‑ZS携带者(深黄色)；与之相同的CV2,CV4～7,CV9, CV20～21,CV35～36等10个品种也是Pita‑ZS携带者；

[0094] 12a～f:综合上述结果，CV13为功能性单倍型品种，而且其基因型与CK1～7 的都不同，由此推断为新型Pita抗病等位基因的携带者(紫色)，Pita‑IR36；

[0095] 其中，8个第二套参考品种为，CK1(Yashiro Mochi,Pita‑YM)，红色标注； CK2(C101PKT,Pita‑KT)，蓝色标注；CK3(9311,Pita‑9311)，绿色标注；CK4(Q15, Pita‑Q15)，浅红色标注；CK5(Kasalath,Pita‑KSL)，浅蓝色标注；CK6(CO39, Pita‑CO)，浅绿色标注；CK7(Zhenshan 97,Pita‑ZS)，深黄色标注；CK8对照品种日本晴；可能携带新型基因，紫色标注；

[0096] 特别地，CV10及CV18为非功能性单倍型品种，虽然其基因型与CK7的相同，仍然被判断为非功能性单倍型品种。换言之，类似于CK7之Pita‑ZS携带者是离非功能性单倍型最近的功能性单倍型品种。

[0097] 图13.本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例

[0098] 13a～b:本发明之技术体系对14个第一套参考品种的鉴定，结果表明， CK1～10为功能性单倍型品种，其中，CK1为Pita‑YM携带者；CK2～3为 Pita‑KT携带者；CK4～5为Pita‑9311携带者；CK6为Pita‑Q15携带者；CK7 为Pita‑KSL携带者；CK8为Pita‑CO携带者；CK9～
10为Pita‑ZS携带者；

[0099] 13c1:他方标记技术I(Jia et al.2002,Crop Science,42:2145‑2149；Wang et al.2007,Plant Breeding,126:36‑42；刘华招等，2011,42(4):27‑31)对14个第一套参考品种的鉴定，结果表明，CK1～3携带功能性Pita基因；CK4～14则携带非功能性pita基因；

[0100] 13c2:他方标记技术II(Kitazawa et al.2019,69:68‑83)对14个第一套参考品种的鉴定，结果表明，CK1～3携带功能性Pita基因；CK4～14携带非功能性 pita基因；

[0101] 结论：由2组互为验证的他方标记技术都是顶多只能鉴定到CK1～3携带功能性Pita基因，由此产生“同名异质基因”(CK1～3之间)，以及“标记假阴性” (CK4～10)等问题；因此，本发明之技术体系具有无比的优越性。

[0102] 图14.Pita新型抗病等位基因Pita‑Q15的克隆及其功能验证。其中，

[0103] 14a:Pita主要抗病等位基因的结构图及其特异性SNP，以及Pita‑Q15的克隆示意图；

[0104] 14b:2个转基因T2/T3株系及其供体及受体品种接种鉴定的抗病反应型；

[0105] 14c:受体品种及其2个转基因T2/T3株系部分个体抗病表现型与基于转基因选择标记Hpt基因型的共分离分析(附加标记Hpt‑F/Hpt‑R如SEQ ID NO.35～SEQ ID NO.36)。

[0106] R,resistant,抗病性；S,susceptible,感病性。

具体实施方式

[0107] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步的阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，皆为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0108] 在实施例中所用的所有水稻品种：第一套参考品种CK1～14及第二套参考品种CK1～8(如上所述)；以及供试品种CV1～44皆为申请人实验室收集、保存，并在本研究领域中常用且已在包括但不限于上述文献中公开【Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321‑334,https://nph.onlinelibrary.wiley.com；Hua et al.2012, Theoretical and Applied Genetics 125:1047‑1055, https://www.springer.com/journal/122；叶雪梅，
2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)；附件图表可在各自杂志网站获得】。

[0109] 本专利开发及应用的技术路线图如图1所示。

[0110] 实施例1:稻瘟病Pita抗病基因家族的序列比较及其特异性序列的鉴定(图2～8)[0111] 一、实验方法

[0112] 利用已克隆的Pita‑YM(供体品种Yashiro Mochi(YM)；GenBank AF207842) 的基因组序列(ATG～TGA)，从上述NCBI等公共数据库中检索并下载另外14个推测为目标基因携带者的测序参考品种C101PKT,IR64,Shennong265,Tadukan, Katy(KT),Tetep,9311,C101A51,Zhenshan 97(ZS),Kasalath(KSL),CO39(CO), IR8,Shuhui 498，Q15的基因组序列；为了便于序列比对分析，加入了6个推测为非目标基因携带者的测序参考品种Hitomebore,Nipponbare(NPB),Suijing 18,MInghui 63,Tsuyuake,Koshihikari相应的基因组序列。

[0113] 各个基因ATG～TAG的范围参考NCBI注释。

[0114] 通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。

[0115] 二、实验结果

[0116] 序列比较结果如图2～8所示，结果表明：

[0117] (1)Pita抗病基因家族的序列存在明显的功能性单倍型(上述15个抗病参考品种之参考序列)与非功能性单倍型(上述6个感病参考品种之参考序列)的基因组分化(典型位置如图3之标记#1及#2所示)；

[0118] (2)上述Pita抗病基因家族之等位基因之间则存在各自功能特异性SNP(典型位置如标记图4～8之标记#3～#11所示)；

[0119] 特别地，由于上述21条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图”中仅仅显示其第一张，以便结合图3～8全面地了解Pita抗病基因家族的特异性序列及其标记信息。

[0120] 实施例2：Pita抗病基因家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发及应用(图3)

[0121] 一、实验方法

[0122] 此实施例的实验方法主要参考申请人已发表的论文(Yuan et al.2011,Theor Appl Genet 122:1017‑1028；Zhai et al.2011,New Phytologist 189:321‑334；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics,125:1047‑1055)。

[0123] 【以下参考文献与上述的相同，恕不赘述】

[0124] 简述之：

[0125] (1)单倍型特异性分子标记的设计：根据上述Pita抗病基因家族序列的比对结果，针对功能性/非功能性单倍型分化清晰的2个单倍型特异性最优SNP，根据CAPS及dCAPS(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences；Neff et al.2002, Trends in Genetics 18:613‑615)标记的设计原理，先利用在线软件dCAPSFinder  2.0(http://
helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行CAPS及dCAPS标记的引物设计；然后利用引物设计软件Primer Primer 5.0进行标记设计的确认。

[0126] 【以下分子标记及引物设计程序与上述的相同，恕不赘述】

[0127] 为了叙述方便，分别命名为#1及#2标记(依次类推)；引物序列如下：

[0128] 对于#1标记(上带，非功能性单倍型；下带，功能性单倍型)：

[0129] SEQ ID NO.1(Pita‑F/NG444C‑F；5’‑3’)：

[0130] ACTGCTGGTGCCAAGAAGATGAT；

[0131] SEQ ID NO.2(Pita‑F/NG444C‑R；5’‑3’)：

[0132] CCGGCCATGCAGACGATAGAAT。

[0133] 对于#2标记(上带，功能性单倍型；下带，非功能性单倍型)：

[0134] SEQ ID NO.3(Pita‑F/NA527T‑F；5’‑3’)：

[0135] ACTGCTGGTGCCAAGAAGATGAT；

[0136] SEQ ID NO.4(Pita‑F/NA527T‑R；5’‑3’)：

[0137] CCGGCCATGCAGACGATAGAAT。

[0138] 标记说明如上所述。

[0139] (2)单倍型特异性分子标记的检测：利用上述2组引物对上述14个第一套参考品种进行PCR扩增。PCR扩增体系(20.0μL)如下：

[0140]

[0141] 【以下PCR扩增体系与上述的相同，恕不赘述】

[0142] PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行30～40个循环(一般为35循环，视检测对象可适当调整)的PCR扩增【94℃变性30sec，退火30sec(#1/62℃， #2/62℃)，72℃延伸25～30sec(视检测对象可适当调整)】，最后72℃延伸5min， PCR产物置于4℃冰箱保存备用。

[0143] 【除了退火温度之外，以下PCR扩增条件与上述的相同，恕不赘述】

[0144] (3)单倍型特异性分子标记的酶切：对于像#1及#2标记那样的CAPS或 dCAPS标记，先取出上述PCR产物，利用相应的限制性内切酶(#1,ApaI/25℃；#2, Sal I/37℃)进行酶切，反应体系(10.0μL)如下：

[0145]

[0146] 在37℃条件下酶切5小时后(除了ApaI/25℃外，其余皆为37℃)，向上述每管酶切产物中加入10μL 10x loading并混匀，待用。

[0147] 【以下PCR扩增产物酶切体系与上述的相同，恕不赘述】

[0148] (4)单倍型特异性分子标记的检测：

[0149] 分别取出上述酶切产物，按照如下程序检测；

[0150] 检测程序：利用微量进样器取1.5～2.0μL产物在10％～12％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(250V,20～120min；根据检测对象调整)，之后，按照常规的检测方法进行分子标记的拍照、记录。

[0151] 【以下分子标记检测程序与上述的相同，恕不赘述】

[0152] 二、实验结果

[0153] 各个分子标记的大小如图3所示，结果表明，14个第一套参考品种呈现清晰的基因型(单倍型)：

[0154] 功能性单倍型品种：CK1(Yashiro Mochi；Pita‑YM)；CK2(Katy；Pita‑KT)； CK3(C101PKT；Pita‑KT)；CK4(IR8；Pita‑9311)；CK5(93‑11；Pita‑9311)；CK6 (Q15；Pita‑Q15)；CK7(Kasalath；Pita‑KSL)；CK8(CO39；Pita‑CO39)；CK9 (C101A51；Pita‑ZS)；CK10(ZS97；
Pita‑ZS)；

[0155] 非功能性单倍型品种：CK11(Nipponbare；Pita‑NonF)；CK12(MH63； Pita‑NonF)；CK13(Tsuyuake；Pita‑NonF)；CK14(Koshihikari；Pita‑NonF)；M, DL‑500。

[0156] 供试品种说明：14个第一套参考品种之信息如上所述，如非必要，以下恕不赘述。

[0157] 实施例3：Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑YM功能特异性分子标记的开发及应用(图4)

[0158] 一、实验方法

[0159] (1)Pita‑YM功能特异性分子标记的设计：根据上述Pita抗病基因家族序列的比对T3387C结果，选择最优的1个SNP设计为Pita‑YM功能特异性分子标记 Pita‑YM (#3标记)；引物序列如下：

[0160] 对于#3标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0161] SEQ ID NO.5(Pita‑YMT3387C‑F；5’‑3’)：

[0162] AAGTGTATGCCTTCCATTGCAGATTAT；

[0163] SEQ ID NO.6(Pita‑YMT3387C‑R；5’‑3’)：

[0164] ATCTTCAGATATCTCAGTTGTAACAGTTTA。

[0165] (2)Pita‑YM功能特异性分子标记的检测：利用上述一对引物，按照上述PCR 扩增体系(退火温度：#3/62℃)，对14个第一套参考品种进行PCR扩增，然后按照上述酶切(#3/Mse I)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0166] 二、实验结果

[0167] 各个分子标记的大小如图4所示，结果表明，Pita‑YM功能特异性分子标记可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0168] 目标基因品种：CK1(Yashiro Mochi；Pita‑YM)；

[0169] 非目标基因品种：其余13个第一套参考品种；

[0170] 实施例4：Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KT功能特异性分子标记的开发及应用(图5)

[0171] 一、实验方法

[0172] (1)Pita‑KT功能特异性分子标记组合的设计：根据上述Pita抗病基因家族序列的比对结果，并没有发现其特异性的基因组序列。但是，优选的3个最优SNP 设计为Pita‑KT功T3387C G384C能特异性分子标记组合：Pita‑YM (上述#3标记)， Pita‑KT/YM (#4标记)，Pita‑KT/G4217T
YM (#5标记)；

[0173] 引物序列如下：

[0174] 对于#4标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0175] SEQ ID NO.7(Pita‑KT/YMG384C‑F；5’‑3’)：

[0176] TAACGACCCAGCTCCTCCACC；

[0177] SEQ ID NO.8(Pita‑KT/YMG384C‑R；5’‑3’)：

[0178] CGGTTAAGCTCCCCTCGAAG；

[0179] 对于#5标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0180] SEQ ID NO.9(Pita‑KT/YMG4217T‑F；5’‑3’)：

[0181] CTGCCGTGGCTTCTATCTTTACAT；

[0182] SEQ ID NO.10(Pita‑KT/YMG4217T‑R；5’‑3’)：

[0183] GTGAAGAGGATTCCGGTAGCATA。

[0184] (2)Pita‑KT功能特异性分子标记组合的检测(#3标记如上所述)：利用上述3 对引物，分别按照上述PCR扩增体系(退火温度：#4/62℃，#5/60℃)，对14个第一套参考品种进行PCR扩增，然后分别按照上述酶切(#4/Hha I,#5/Nla III)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0185] 二、实验结果

[0186] 各个分子标记的大小如图5所示，结果表明，Pita‑KT功能特异性分子标记组合可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0187] 目标基因品种：CK2(Katy；Pita‑KT)；CK3(C101PKT；Pita‑KT)；

[0188] 非目标基因品种：其余12个第一套参考品种。

[0189] 实施例5：Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑9311功能特异性分子标记的开发及应用(图6)

[0190] 一、实验方法

[0191] (1)Pita‑9311功能特异性分子标记的设计：根据上述Pita抗病基因家族序列的比G17T对结果，选择最优的2个SNP设计为Pita‑9311功能特异性分子标记组合： Pita‑9311/COT959C
(#6标记)及Pita‑9311 (#7标记)，引物序列如下：

[0192] 对于#6标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0193] SEQ ID NO.11(Pita‑9311/COG17T‑F；5’‑3’)：

[0194] CCATCCATGGCGCCGGCGCTCA；

[0195] SEQ ID NO.12(Pita‑9311/COG17T‑R；5’‑3’)：

[0196] GAGGAGGATCTTCTTCCTCTCCCCCTTCCG；

[0197] 对于#7标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0198] SEQ ID NO.13(Pita‑9311T959C‑F；5’‑3’)：

[0199] TGCAAGATAAAAGGTAATTCATGTCGA；

[0200] SEQ ID NO.14(Pita‑9311T959C‑R；5’‑3’)：

[0201] TAGAATGAGGTGGGTATAATAATTGTTTAG。

[0202] (2)Pita‑9311功能特异性分子标记的检测：利用上述2对引物，按照上述PCR 扩增体系(退火温度：#6/58℃，#7/55℃)，分别对14个第一套参考品种进行PCR 扩增，然后分别按照上述酶切(#6/DdeI,#7/EcoRV)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0203] 二、实验结果

[0204] 各个分子标记的大小如图6所示，结果表明，Pita‑9311功能特异性分子标记组合可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0205] 目标基因品种：CK4(IR8；Pita‑9311)；CK5(93‑11；Pita‑9311)；

[0206] 非目标基因品种：其余12个第一套参考品种。

[0207] 实施例6：Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑Q15功能特异性分子标记的开发及应用(图7)

[0208] 一、实验方法

[0209] (1)Pita‑Q15功能特异性分子标记的设计：根据上述Pita抗病基因家族序列的比A352G对结果，选择最优的2个SNP设计为Pita‑Q15功能特异性分子标记组合： Pita‑Q15 (#8标G4231A
记)及Pita‑Q15 (#9标记)，引物序列如下：

[0210] 对于#8标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0211] SEQ ID NO.15(Pita‑Q15A352G‑F；5’‑3’)：

[0212] CTACGACGTCGACGACTTCCTC；

[0213] SEQ ID NO.16(Pita‑Q15A352G‑R；5’‑3’)：

[0214] TCATGCTGCTGATCATCTTCTTGG；

[0215] 对于#9标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0216] SEQ ID NO.17(Pita‑Q15G4231A‑F；5’‑3’)：

[0217] CTATCTTTACCTTCTATGCATCTGCA；

[0218] SEQ ID NO.18(Pita‑Q15G4231A‑R；5’‑3’)：

[0219] CTGAAGACGTGAAGAGGATTCC。

[0220] (2)Pita‑Q15功能特异性分子标记的检测：利用上述2对引物，按照上述PCR 扩增体系(退火温度：#8/59℃，#9/55℃)，分别对14个第一套参考品种进行PCR 扩增，然后分别按照上述酶切(#8/BfaI,#9/Pst I)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0221] 二、实验结果

[0222] 各个分子标记的大小如图7所示，结果表明，Pita‑Q15功能特异性分子标记组合可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0223] 目标基因品种：CK6(Q15；Pita‑Q15)；

[0224] 非目标基因品种：其余13个第一套参考品种。

[0225] 实施例7：Pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因Pita‑KSL功能特异性分子标记的开发及应用(图8)

[0226] 一、实验方法

[0227] (1)Pita‑KSL功能特异性分子标记的设计：根据上述Pita抗病基因家族序列的比A984G对结果，选择最优的2个SNP设计为Pita‑KSL功能特异性分子标记组合： Pita‑KSL (#10C1991T
标记)及Pita‑KSL (#11标记)，引物序列如下：

[0228] 对于#10标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：

[0229] SEQ ID NO.19(Pita‑KSLA984G‑F；5’‑3’)：

[0230] TGCAAGATAAAAGGTAATTCATGTCGA；

[0231] SEQ ID NO.20(Pita‑KSLA984G‑R；5’‑3’)：

[0232] TAGAATGAGGTGGGTATAATAATTGTTTAG；

[0233] 对于#11标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：

[0234] SEQ ID NO.21(Pita‑KSLC1991T‑F1；5’‑3’)：

[0235] ATGCCTTAGAACAGGTACAATAGCATG；

[0236] SEQ ID NO.22(Pita‑KSLC1991T‑F2；5’‑3’)：

[0237] ATGTCTAAGAACAGGTACAATAGCATG；

[0238] SEQ ID NO.23(Pita‑KSLC1991T‑R；5’‑3’)：

[0239] TGGTGAAGACATGTTCTATATCTTGTAAA。

[0240] 特别地，为了确保在基因组分化区域分子标记的检测，#11标记使用了多引物PCR策略(F1+F2 vs R)。

[0241] (2)Pita‑KSL功能特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述PCR 扩增体系(退火温度：#10/55℃，#11/50℃)，分别对14个第一套参考品种进行PCR 扩增，然后分别按照上述酶切(#10/BspHI,#11/SphI)及检测体系进行分子标记的检测、记录。

[0242] 二、实验结果

[0243] 各个分子标记的大小如图8所示，结果表明，Pita‑KSL功能特异性分子标记组合可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因，以及非功能基因：

[0244] 目标基因品种：CK7(Kasalath；Pita‑KSL)；

[0245] 非目标基因品种：其余13个第一套参考品种。

[0246] 实施例8：利用本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系之两级标记从参考品种中鉴别并挖掘其新型抗病等位基因Pita‑CO及Pita‑ZS的应用及实例(图9)

[0247] 有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于特定目标基因之特定基因组区域DNA多态性而进行的检测，本发明之技术体系由“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，而且开放性地包含了主要的功能特异性基因组区域及SNP，各个标记独立但具有严谨的逻辑性，由此实现了对整个基因家族具有包容性、扩展性的精准鉴别及挖掘。仅以14个第一套参考品种之CK8～10的基因型鉴定作为实例阐述之：

[0248] (1)基于一级标记(2个Pita功能性单倍型特异性最优标记)对14个第一套参考品种的鉴定结果表明，CK8～10也是功能性单倍型品种(图9a)；

[0249] (2)但是，基于二级标记【5个Pita抗病等位基因 (Pita‑YM,Pita‑KT,Pita‑9311,Pita‑Q15,Pita‑KSL)之9个功能特异性最优标记】对 14个第一套参考品种的鉴定结果表明，CK8～10都不是上述任一等位基因的携带者(图9b中b1～b5)；

[0250] (3)然而，综合上述结果则可以推断，CK8含有新型的Pita抗病等位基因， Pita‑CO；CK9～10含有新型的Pita抗病等位基因，Pita‑ZS(二者于#6标记的基因型不同)；

[0251] 特别地，CK8～10于一级标记体系中被判断为功能性单倍型品种；于二级标记体系(等位基因鉴定)中，除了#6标记，3个参考品种的基因型都与4个非功能性单倍型品种(CK11～14)的相同。由此说明，本发明之技术体系不仅可以鉴定上述功能较强的抗病等位基因，也可以鉴定功能较弱、与非功能性单倍型品种相近的抗病等位基因(Pita‑CO及Pita‑ZS)；

[0252] 本发明之技术体系的检测程序如上所述。

[0253] 实施例9：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系甄别真假特异性基因组序列及目标基因 (Pita‑YM)的应用及实例(图10)

[0254] 由于Pita抗病基因家族是位于水稻第12染色体之着丝粒区域，难免存在测序错误，特别是早期克隆的基因。具体之：

[0255] (1)如实施例3所述，依据#3标记可以清晰地鉴别Pita‑YM与其他Pita抗病基因家族等位基因的差异(图4；10a1～2)；

[0256] (2)可是，根据另外4个Pita‑YM之候选SNP开发的4个附加标记对14个第一套参考品种的鉴定结果显示，所有14个参考品种的基因型一致，由此推断，这些候选SNP都是错误而不真实的；

[0257] 结论：Yashiro Mochi(CK1)序列虽然存在错误，但仍然是Pita‑YM的携带者；

[0258] 特别地，由于附加标记不属于本发明专利保护范围，其引物序列仅在“序列表”中显示，以作参考(下同)；

[0259] 此外，C1149T由于位于富含A,T碱基区域而难以清晰地被检测，但是仍可判断该SNP是不真实的；

[0260] 综上所述，本发明之技术体系既对Pita‑YM之候选SNP进行了甄别、纠错，也对其进行了确认。

[0261] 实施例10：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系甄别真假特异性基因组序列及目标基因(Pita‑9311)的应用及实例(图11)

[0262] 同样地，Pita抗病基因家族是位于水稻第12染色体之着丝粒区域，难免存在测序错误。具体之：

[0263] (1)如实施例5所述，依据#6及#7标记组合可以准确地鉴别Pita‑9311与其他Pita抗病基因家族等位基因的差异(图6；10a1～2)；

[0264] (2)可是，根据另外1个Pita‑9311之候选SNP开发的1个附加标记对14个第一套参考品种的鉴定结果显示，所有14个参考品种的基因型一致，由此推断，该候选SNP是错误而不真实的；

[0265] 结论：9311(CK5)与IR8(CK4),Shuhui 498(未参试)序列虽然存在错误，但仍然是Pita‑9311的携带者；

[0266] 综上所述，本发明之技术体系既对Pita‑9311之候选SNP进行了甄别、纠错，也对其进行了确认。

[0267] 实施例11：利用上述一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系从目标基因未知的广东省稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧抗病等位基因的实例(图12)

[0268] 一、实验方法

[0269] (1)本发明之技术体系由“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级检测标记之 11个基本的特异性标记组成。其中，功能性/非功能性单倍型检测需优先推进，而后续的各个抗病等位基因的检测则没有先后顺序之分。整套技术体系的检测程序及方案如上所述(图3～9；实施例4～8)，恕不赘述。

[0270] 特别地，原则上非功能性单倍型供试品种可以排除于后续的抗病等位基因检测。在本案例中由于非功能性单倍型供试品种太少，为了保持检测效果的整齐可比性，供试品种群体整体保留而进行了抗病等位基因的检测。

[0271] (2)利用上述技术体系对44个随机选择的广东省稻种资源【CV1～44；Zhai et al.2011,New Phytologist,189:321‑334；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics,125:1047‑1055；叶雪梅，2021，华南农业大学硕士论文(未公开标记相关核心信息)】进行Pita抗病基因家族等位基因的鉴别及挖掘；

[0272] 上述8个目标基因确定的第二套参考品种作为对照也参加了试验。

[0273] (3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆技术(Zhai et al.2011,NewPhytologist,189:321‑334；Hua et al.2012,Theor Appl Genet 125:1047‑1055)，分离克隆新型的抗病等位基因、测序并登录GenBank；

[0274] 特别地，按照GenBank的规则，所有被登录的基因序列都进行了基因注释 (annotation)，以保证其完整性及可通读性，因而是功能性基因。

[0275] 二、实验结果

[0276] (1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，44个供试品种被分类为(图12a；红色标示，功能性单倍型；黑色标示，非功能性单倍型)：

[0277] 非功能性单倍型品种：CV10,CV18等2个品种

[0278] 功能性单倍型品种：除了上述2个非功能性单倍型品种以外的42个品种。

[0279] (2)在基于二级标记的抗病等位基因检测中，42个功能性单倍型供试品种被进一步鉴别为：

[0280] 目标基因Pita‑YM携带品种(图9b中b‑1；红色标示)：没有；

[0281] 目标基因Pita‑KT携带品种(图9b中b‑2；蓝色标示)：CV3,CV8,CV14～15, CV19,CV23,CV25～26,CV29,CV34,CV37,CV44等12个品种；

[0282] 目标基因Pita‑9311携带品种(图9b中b‑3；绿色标示)：CV11～12,CV22, CV24,CV27～28,CV30～33,CV38～43等16个品种；

[0283] 目标基因Pita‑Q15携带品种(图9b中b‑4；浅红色标示)：CV1等1个品种；

[0284] 目标基因Pita‑KSL携带品种(图9b中b‑5；浅蓝色标示)：没有；

[0285] 目标基因Pita‑CO携带品种(图9b中b‑6；浅绿色标示)：CV16～17等2个品种；

[0286] 目标基因Pita‑ZS携带品种(图9b中b‑7；深黄色标示)：CV2,CV4～7,CV9, CV20～21,CV35～36等10个品种；

[0287] 未知新型抗病等位基因Pita‑IR36携带品种：CV13等1个品种(基因型与上述所有7个等位基因的不同)。

[0288] 特别地，“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级标记检测的结果分别以独立的彩色体系标示之。

[0289] (3)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆方法，以CV13(IR36)为代表，分离克隆了Pita‑IR36(GenBank OK169581)等1个新型的抗病等位基因。

[0290] 该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可比性，因为在44个目标基因未知的广东省稻种资源群体中，首先鉴别出42个功能性单倍型品种；然后进一步鉴别了7个确定的目标基因Pita‑YM,Pita‑KT,Pita‑9311，Pita‑Q15，Pita‑KSL，Pita‑CO，Pita‑ZS，外加1个新型的抗病等位基因Pita‑IR36。

[0291] 实施12：本发明之一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族功能基因的技术体系与其他标记技术鉴别能力的比较实例(图13)

[0292] (1)虽然稻瘟病Pita抗病基因家族是在全球水稻抗病育种计划中应用最广泛的广谱持久抗源之一，但是，迄今开发、应用的只有2套抗/感基因互为验证的分子标记，而且都是仅仅针对第一个被分离克隆的Pita‑YM以及Pita‑KT(源于美国水稻骨干品种Katy)【YL155/YL87(Pita),YL183/YL87(pita)(Jia et al.2002, Crop Science,42:2145‑2149；时克等，2009，植物遗传资源学报，10:21‑26；李进斌等，2012，中国水稻科学，26:593‑599；
Imam et al.2014,Euphytica,196:199‑211；Yadav et al.2019,Plos One,0211061)；
Pita‑ID13(Pita),Pita‑ID04(pita)(Kitazawa et al.2019,Breeding Science,69:68‑
83)；下划线为标记】；

[0293] (2)从上述主要参考文献中，选择2套最具代表性的他方标记技术I 【YL155/YL87(Pita),YL183/YL87(pita)】(如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.40)，以及他方标记技术II【Pita‑ID13(Pita),Pita‑ID04(pita)】(如SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.46)，以上述14个第一套参考品种为检测对象进行鉴定比较(图13)。结果表明，本发明之技术体系与2套他方标记技术相比，具有如下突出而确切的创新性及有益效果：

[0294] (a)利用一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限(图13a)。在该实例中，在供试的14个第一套参考品种中，CK1～10被鉴定为功能性单倍型品种，CK11～14则为非功能性单倍型品种。这是2套他方标记技术所无法比拟的有益效果之一；

[0295] (b)在此基础上，利用二级标记进行抗病等位基因分析，为各个抗病等位基因的鉴别划出了清晰且可比对的等位基因界限(图13b)。在该实例中，遴选了9 个最优的抗病等位基因功能特异性标记，彼此相互独立却互为比对而构成一套严谨的鉴别体系。由此清晰地鉴别了7个抗病等位基因(Pita‑YM,Pita‑KT,Pita‑9311, Pita‑Q15,Pita‑KSL,Pita‑CO,Pita‑ZS)。这也是2套他方标记技术所无法比拟的有益效果之一。具体之：

[0296] 我方技术体系:如上所述，本发明之技术体系由一套“功能性单倍型‑抗病等位基因”等两级标记之11个最优的功能特异性标记组成，由此在清晰地鉴别功能性/非功能性单倍型的基础上，精准地鉴别上述7个抗病等位基因。

[0297] 他方标记技术I:通过2套抗/感基因互为验证的分子标记，只能推断CV1～3 是目标基因Pita‑YM的携带者(图13c1)。由此产生的问题是，(i)Pita‑YM与 Pita‑KT分不开，二者成为“同名异质基因”；(ii)CV4～10被判断为非功能性等位基因，由此产生“标记假阴性”的问题。因此，他方标记技术I不能形成具有包容性、逻辑性及可比性的技术体系而鉴别并挖掘更多的抗病等位基因。

[0298] 他方标记技术II:该标记技术的原理及效果与他方标记技术I的相似：只能推断CV1～3是目标基因Pita‑YM的携带者，且检测效果还没有上述的清晰(图 13c2)。

[0299] 特别地，由于他方标记不属于本发明专利保护范围，其引物序列仅在“序列表”中显示，以作参考；

[0300] 结论：本发明之技术体系具有他方标记技术所无法比拟的创新性及有益效果。

[0301] 实施13：Pita新型抗病等位基因Pita‑Q15的克隆及其功能验证的实例(图14)[0302] (1)利用常规的基于PCR技术的同源基因克隆技术(Zhai et al.2011,NewPhytologist,189:321‑334；Hua et al.2012,Theor Appl Genet 125:1047‑1055)，分离克隆Pita抗病等位基因家族上述所有8个等位基因(Pita‑YM,Pita‑KT,Pita‑9311, Pita‑Q15,Pita‑KSL,Pita‑CO,Pita‑ZS,Pita‑IR36)，测序并登录于GenBank；

[0303] (2)为了验证其抗性功能，选择其中Pita‑Q15之TA‑克隆，通过两端的内切酶Asc I位点将其整合于双元转化载体pCPAN‑MF中(图14a)；

[0304] (3)通过常规的基于农杆菌介导的遗传转化技术，将目标基因导入受体品种 Nipponbare中；

[0305] (4)通过常规的转基因后代表现型/基因型的共分离分析，利用其转基因稳定株系验证其抗性功能(Zhai et al.2011,New Phytologist,189:321‑334；Hua et al. 2012,Theor Appl Genet 125:1047‑1055)。结果表明，在2个T3株系中， Pita‑Q15‑7‑3为抗性纯合株系，而Pita‑Q15‑7‑5为抗性分离株系，且其表现型/ 基因型表现共分离(图14b～c)。

[0306] 结论：Pita抗病等位基因家族之新型等位基因Pita‑Q15确实是功能基因。

[0307] 上述实例从不同角度实证了本发明之技术体系具有包容性且精准鉴别并挖掘Pita抗病基因家族等位基因非凡的能力及效果。

[0308] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。