一种拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177-189及其应用

摘要

本发明公开了一种拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189及其应用，其分子式为C80H126N26O15S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。本发明的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189对常见病原菌具有显著的抗菌效果，此外，对正常拟穴青蟹血细胞、正常哺乳动物细胞如小鼠肝实质细胞和人正常肝细胞无细胞毒性，其源于甲壳动物，可用于水产饲料添加剂和抗菌药物等，具有广泛的应用前景。

权利要求

1.一种拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189，其特征在于：其分子式为C80H126N26O15S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。

2.权利要求1所述的一种拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：该抗菌药物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、解藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和河流弧菌具有抑制和杀灭作用。

3.一种抗菌药物，其特征在于：其有效成分包括如权利要求1所述的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189。

4.如权利要求3所述的抗菌药物，其特征在于：其有效成分为如权利要求1所述的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189。

5.权利要求1所述的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189在制备水产饲料添加剂中的应用，其特征在于：该水产饲料添加剂对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、解藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和河流弧菌具有抑制和杀灭作用。

6.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括如权利要求1所述的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189。

7.如权利要求6所述的水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分为如权利要求1所述的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189。

说明书

一种拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹新型抗菌多肽 Spgillcin177‑189及其应用。

背景技术

[0002] 由于缺乏适应性免疫系统，无脊椎动物仅依赖先天性免疫系统抵抗外源入侵的病原体。抗菌肽属于先天性免疫系统的重要组成部分，被认为在保护宿主免受病原微生物的侵害中起着关键作用。抗菌肽具有多重生物学功能，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫以及调节机体免疫反应等。目前，已有3257条抗菌肽记录于抗菌肽数据库 (https：//wangapd3.com/main.php)中。

[0003] Alexander Flemig在1922年发现了溶菌酶(lysozyme)后，直到1981年，Boman等从惜古比天蚕蛾(Hyalophora cecropia)中分离获得的天蚕素(Cecropin)，被认为是第一个真正意义上的抗菌肽。随后，越来越多的抗菌肽在不同的物种体内被发现，并进行深入研究。 1996年，甲壳动物的第一个抗菌肽被发现，它是来自于普通滨蟹(Carcinus maenas)的血淋巴细胞，序列中富含脯氨酸，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均有抗菌活性。目前，已有诸多来源于拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)的抗菌肽被报道，如富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽Crustins，具有保守LPS结合结构域的抗脂多糖因子(Anti‑1ipopolysaccharide factors，ALFs)，具有生殖免疫保护功能的阴离子抗菌肽Scygonadin等。

[0004] 如今，抗菌肽及其相关产品已在食品领域、医药领域、禽畜养殖和水产养殖等方面均有应用，青蟹新型抗菌肽的研发，将为水产养殖疾病的防治以及抗菌药物的筛选提供了新思路。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189。

[0006] 本发明的另一目的在于提供上述拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189的应用。

[0007] 本发明的技术方案之一如下：

[0008] 拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189，其分子式为C80H126N26O15S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。

[0009] 本发明的技术方案之二如下：

[0010] 上述拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189在制备抗菌药物中的应用，该抗菌药物对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、解藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和河流弧菌具有抑制和杀灭作用。

[0011] 本发明的技术方案之三如下：

[0012] 一种抗菌药物，其有效成分包括上述拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189。

[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹新型抗菌多肽 Spgillcin177‑189。

[0014] 本发明的技术方案之四如下：

[0015] 上述拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189在制备水产饲料添加剂中的应用，该水产饲料添加剂对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、解藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌和河流弧菌具有抑制和杀灭作用。

[0016] 本发明的技术方案之五如下：

[0017] 一种水产饲料添加剂，其有效成分包括上述拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189。

[0018] 在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹新型抗菌多肽 Spgillcin177‑189。

[0019] 本发明的有益效果是：

[0020] 1、本发明的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189由13个氨基酸组成，分子式为 C80H126N26O15S1，分子量约为1.7kDa，其中含有5个带正电的氨基酸残基，根据预测该抗菌肽等电点为11.01，亲水性平均系数为‑0.554，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

[0021] 2、本发明的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189对常见病原菌具有显著的抗菌效果，此外，Spgillcin177‑189对正常拟穴青蟹血细胞、正常哺乳动物细胞如小鼠肝实质细胞和人正常肝细胞不具有细胞毒性作用。

[0022] 3、本发明的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189的抗菌活性不受高温高盐离子浓度的影响。

[0023] 4、本发明的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189具有抑制生物膜形成活性。

[0024] 5、本发明的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189源于甲壳动物，既可用于水产饲料添加剂，也可研制成抗菌药物等，具有广泛的应用前景。

附图说明

[0025] 图1为本发明实施例3中拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌杀菌动力学图；其中，横坐标为时间(min)，纵坐标为杀菌指数(％)。

[0026] 图2为本发明实施例4中拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌抗菌活性热稳定性图；其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为 OD600值。

[0027] 图3为本发明实施例5中拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌抗菌活性离子耐受性图；其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为OD600值。

[0028] 图4为本发明实施例6中拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜形成抑制实验图；其中，横坐标为Spgillcin177‑189的终浓度，纵坐标为生物膜形成率。

[0029] 图5为本发明实施例7中拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189与金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌透射电镜观察图；Control为无菌超纯水与目的菌株共孵1h，实验组为终浓度12μM的Spgillcin177‑189与目的菌株共孵1h(bar＝500nm)。

[0030] 图6为本发明实施例8中MTS‑PMS法检测拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189细胞毒性实验图；其中，横坐标为Spgillcin177‑189蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。

具体实施方式

[0031] 以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

[0032] 实施例1拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189的制备

[0033] 所述拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189的氨基酸序列为：

[0034] Lys‑Lys‑Arg‑Arg‑Cys‑Phe‑Phe‑Arg‑His‑Ile‑Tyr‑Val‑Ala(SEQ ID NO：01)[0035] 采用化学固相合成的方法即可得到纯度达95％以上拟穴青蟹新型抗菌多肽 Spgillcin177‑189。本实施例中的拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189委托南京金斯瑞生物科技有限公司以固相合成方法合成获得，并提供多肽分子量、HPLC、溶解报告书等检测信息。

[0036] Spgillcin177‑189的理化参数如表1所示。

[0037] 表1新型抗菌多肽Spgillcin177‑189的理化参数

[0038]

[0039] 由表1可知，Spgillcin177‑189分子量小，疏水性强，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

[0040] 实施例2拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189最小抑菌浓度(MIC：Minimum Inhibition Concentration)和最小杀菌浓度(MBC：Minimum BactericidalConcentration)的测定

[0041] 本实施例中所涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、解藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。

[0042] 具体实施方法如下：

[0043] 1、将保种的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌涂布于营养肉汤平板上，在各适宜温度下倒置培养过夜；解藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌涂布于 2216平板上，于28℃倒置培养过夜。待菌落生长起来后，挑取2‑3个细菌单克隆接种至对应的斜面培养基上继续培养12‑16h。

[0044] 2、用无菌10mM磷酸钠缓冲液将待测菌从斜面上冲下，调整菌悬液浓度。用MH 液体5
培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释细菌，使得菌体的最终浓度为5×10cfu/mL。

[0045] 3、将合成肽粉末用无菌Milli‑Q Water溶解后，经过0.22μm滤膜过滤后，倍比稀释蛋白浓度至3、6、12、24、48、96μM，置于冰上或4℃备用。

[0046] 4、在无菌96孔细胞培养板中进行抗菌活性测定，分别设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：

[0047] ①空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基

[0048] ②阴性对照组：50μL无菌Milli‑Q Water和50μL菌悬液

[0049] ③待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液

[0050] 5、将96孔细胞培养板置于适宜温度的培养箱中，培养18‑24h，观察待测实验组中 MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度倒置培养1‑2d，观察MBC结果。

[0051] Spgillcin177‑189的抗菌活性结果如表2所示，Spgillcin177‑189对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有显著抗菌活性。

[0052] 表2 Spgillcin177‑189的抗菌活性

[0053]

[0054] 注：MIC为最小抑菌浓度(μM)，用a‑b表示。a为肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b为肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度。MBC为最小杀菌浓度(μM)，表示能够杀死99.9％菌体的最低蛋白浓度。

[0055] 实施例3拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189杀菌动力学曲线

[0056] 选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌作为待测菌，对合成肽 Spgillcin177‑189的杀菌动力学进行测定。

[0057] 将1倍MBC(金黄色葡萄球菌12μM，铜绿假单胞菌12μM，嗜水气单胞菌24μM) 的Spgillcin177‑189与菌共孵一定的时间后，取5μL悬液稀释至500μLNaPB中，混匀后吸取50μL涂布于营养肉汤平板上，适宜温度下倒置培养18‑24h进行克隆计数。灭菌MillQ 水与菌悬液共孵0h的样品作为阳性对照，取5μL经同样稀释倍数涂布于营养肉汤平板上的克隆数定义为100％，杀菌指数用经一定时间孵育的实验组的克隆数相对于阳性对照克隆数的百分比表示(结果参见图1)。Spgillcin177‑189与金黄色葡萄球菌共孵育3min时，杀菌指数达到50％，共孵育45min时杀菌指数达到100％；与铜绿假单胞菌共孵育40min 时，杀菌指数达到
50％，共孵育120min时杀菌指数达到100％；与嗜水气单胞菌共孵10 min左右，杀菌指数达到50％，共孵180min，杀菌指数达到100％。

[0058] 实施例4拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189抗菌活性热稳定性

[0059] 选取金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性细菌代表，铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌为革兰氏阴性细菌代表，对Spgillcin177‑189抗菌活性热稳定性进行测定。具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整合成肽Spgillcin177‑189浓度至1倍MBC(金黄色葡萄球菌 12μM，铜绿假单胞菌12μM，嗜水气单胞菌24μM)，分别在100℃沸水中水浴10、20、 30min后置于冰上备用。将合成肽Spgillcin177‑189或者无菌Milli‑Q Water分别与待测菌共同孵育24h，在0、12、24h时用酶标仪测定OD600的值(结果参见图2)。结果显示， Spgillcin177‑189在100℃沸水中水浴10、20、30min后对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌仍有良好的抗菌活性。

[0060] 实施例5拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189抗菌活性离子耐受性[0061] 选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌对Spgillcin177‑189抗菌活性离子耐受性进行测定。调整合成肽Spgillcin177‑189浓度至1倍MBC(金黄色葡萄球菌12μM，铜绿假单胞菌12μM，嗜水气单胞菌24μM)，置于冰上备用。具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似，并在培养基中分别添加不同浓度的NaCl，使NaCl终浓度为0、 10、20、40、80、160mM。将Spgillcin177‑189或者无菌Milli‑Q Water分别与待测菌共同孵育24h，在0、12、24h时用酶标仪测定OD600的值(结果参见图3)。结果显示，Spgillcin177‑189在不同浓度的NaCl(0‑160mM)中均能抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌的生长，具有良好的离子耐受性。

[0062] 实施例6拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189抑制细菌生物膜形成[0063] 选取金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为目标菌株，使用结晶紫染色法检测 Spgillcin177‑189抑制细菌生物膜形成。首先，调整目标菌悬液至OD600＝0.003，各取50μL 抗菌肽Spgillcin177‑189与菌悬液至96孔板中，使抗菌肽Spgillcin177‑189终浓度为6μM、3μM、 1.5μM和0.75μM，同时设置阴性对照组，37℃培养箱中静置培养24h。随后，用1×PBS 洗涤两次，用甲醛固定15min。清除甲醛，用0.1％(w/v)结晶紫染色15min，用超纯水洗去浮色后加入95％乙醇，室温震荡30min。最后，酶标仪测定OD600的值(结果参见图 4)。结果显示，金黄色葡萄球菌菌体附着至固体表面阶段时，Spgillcin177‑189的添加(0.75 μM、1.5μM、3μM、6μM)能够显著减少金黄色葡萄球菌的粘附量，具有浓度依赖性；而在铜绿假单胞菌生物膜形成过程中，只有较高浓度Spgillcin177‑189的处理(6μM)才能够显著减少铜绿假单胞菌的粘附量。由此可见，Spgillcin177‑189能抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生物膜形成，并且对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制效果更好。

[0064] 实施例7拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillcin177‑189与细菌作用后透射电子显微镜观察选取金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为待测菌株，透射电镜样品的制备步骤如下：

[0065] 1、挑取金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌单克隆于20mL营养肉汤液体培养基中， 37℃，200rpm，过夜培养。

[0066] 2、调整待测菌浓度为OD600＝1.0，离心，去除上清，加入1mL Spgillcin177‑189合成肽使其终浓度为12μM，室温共孵1h。

[0067] 3、5000g，5min离心，加入600μL 2.5％戊二醛重悬，4℃固定过夜。

[0068] 4、5000g，5min离心，1mL PBS重悬菌体，再次离心。

[0069] 5、吸除上清，并用15μL PBS重悬菌体，加入到已铸好的琼脂模型中。

[0070] 6、5000g，5min离心，吸去菌体液面水分，加入2％熔融琼脂溶液，冰上静置，直至固化。

[0071] 7、包含菌体的琼脂块切割至米粒大小，1mL PBS重悬琼脂块，吸除上清，并用600 μL 2.5％戊二醛重悬并固定琼脂块，4℃静置过夜。

[0072] 吸去上清，1mL PBS重悬清洗琼脂块2次，并经后续包埋、切片等步骤后进行透射电镜的观察(结果参见图5。结果显示，对照组中，金黄色葡萄球菌内部电子密度高，内外膜结构完整，外膜表面光滑，细胞形态未发生改变；经过1×MBC的Spgillcin177‑189处理后，菌体内部起泡，内外膜形态及界限模糊，有部分菌体直接破碎，内容物流出。同样，对照组中，铜绿假单胞菌内部电子密度高，内外膜结构完整且边界清晰；经过1×MBC的 Spgillcin177‑189处理后，菌体内外膜之间周质空间增大，细胞形态发生改变，有些菌体表面具有褶皱，内容物泄出。

[0073] 实施例8拟穴青蟹新型抗菌多肽Spgillein177‑189细胞毒性测定

[0074] 选取正常拟穴青蟹血淋巴细胞、人正常肝细胞(L02)和小鼠肝实质细胞(AML12)，对拟穴青蟹新型抗菌肽Spgillcin177‑189细胞毒性进行测定。具体实施步骤如下：

[0075] 1、收集生长状态良好的拟穴青蟹血淋巴细胞、人正常肝细胞和小鼠肝实质细胞，5
调整细胞浓度为1×10 个/mL，将细胞均匀吹散，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于适宜温度培养箱培养至80％以上细胞贴壁。

[0076] 2、小心吸出培养基，加入含有不同浓度(6μM、12μM、24μM、48μM、96μM) Spgillcin177‑189的培养基，置于适宜温度培养箱培养24h。

[0077] 3、加入20μL MTS‑PMS溶液后避光孵育2h后，使用酶标仪测得OD492值，评价 Spgillcin177‑189的细胞毒性(结果参见图6)。结果显示，不同浓度的Spgillcin177‑189与正常细胞共孵24h后，细胞活性并无显著性差异，证明Spgillcin177‑189对正常拟穴青蟹血细胞、小鼠肝实质细胞和人正常肝细胞都无细胞毒性。

[0078] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。