交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用

摘要

本发明提供了交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用，所述交链格孢JTF001的发酵液包含3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇，和/或2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮。本发明首次公开了交链格孢JTF001的发酵液中3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇和2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮抑制瓜列当种子萌发的作用，这两种化合物可直接用于防治瓜列当，对瓜列当的抑制作用显著。

权利要求

1.交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当(Orabanche aegyptaica)种子萌发中的应用，其特征在于，所述交链格孢JTF001的发酵液包含3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑

2‑醇，和2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮；

所述交链格孢JTF001于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo.61964。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述交链格孢JTF001的发酵液的获得方法包括以下步骤：（1）将交链格孢JTF001进行固体发酵，得到固体发酵物；

（2）使用乙酸乙酯浸泡，得到提取液，将所述提取液进行减压蒸馏后，得到粗提物浸膏；

（3）将所述粗提物浸膏溶解进行硅胶柱层析分离，得到所述交链格孢JTF001的发酵液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，将交链格孢JTF001在大米固体培养基中进行固体发酵，所述发酵的条件包括：在温度25 30℃、黑暗静置培养10 25d。

~ ~

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，使用乙酸乙酯浸泡15 30h，然~后超声提取0.5 1.5h。

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5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述硅胶柱层析色谱分离时，使用石油醚和乙酸乙酯洗脱液，及甲醇和乙酸乙酯洗脱液，得到所述粗提物；

所述石油醚和乙酸乙酯洗脱液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为0 1：0 1；

~ ~

所述甲醇和乙酸乙酯洗脱液中甲醇和乙酸乙酯的体积比为0.01 1：0 0.99。

~ ~

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述粗提物经高效液相色谱分离得到活性成分，所述活性成分为3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇，和2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，将所述活性成分使用质谱与核磁共振波谱进行分析。

8.2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮在抑制瓜列当种子萌发中的应用。

说明书

交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及应用农业微生物与生物防治技术领域，具体涉及交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用。

背景技术

[0002] 瓜列当(Orabanche aegyptaica)是全寄生性高等植物，广泛地分布在地中海地区、亚洲西部和欧洲东部，对当地的农作物生产造成巨大的影响，被认为是世界范围内危害最严重的寄生性杂草。我国瓜列当主要分布于新疆、吉林、甘肃、黑龙江、河北、山东、山西、陕西、辽宁、青海、内蒙古、四川等多个省份。我国新疆是瓜列当分布和危害严重的地区，其对甜瓜、西瓜和番茄可造成半成以上的减产。由于瓜列当根寄生的特性，它对寄主的危害主要发生在出苗之前的地下生长时期，因此常见的人力拔除(伤害寄主根系)和农药等除草方式几乎不起作用，造成在新疆当地无法有效防除而严重影响农业生产。

[0003] 微生物源除草剂是利用微生物产生的代谢产物进行杂草防治的一种新型生物除草剂。通常大多数微生物如细菌、放线菌、腐生类微生物、植物病原真菌以及藻类等都含有除草活性化合物，是开发除草剂的天然宝库。近几年利用天然化合物防治瓜列当已经成为研究的热点之一。利用微生物代谢产物，以及这些代谢产物的人工模拟化合物研究开发具有高活性﹑高选择性﹑高安全性天然除草剂将会是新型除草剂发展的重要方向之一。

[0004] 我们的先前研究发现交链格孢的粗提物具有防治瓜列当种子萌发的作用，但是其发酵液中的成分很多，具体是哪种物质成分发挥作用尚不明确。因此，有必要从交链格孢的粗提物中获得活性单体化合物，从而提供一种有效防治瓜列当的微生物菌株及其活性次级代谢产物。

发明内容

[0005] 为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用，所述交链格孢JTF001的发酵液包含3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇，和/或2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮，为防治瓜列当提供了一个新的路径。

[0006] 本发明所采用的技术方案如下：

[0007] 根据本申请的一个方面，提供了一种交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用，所述交链格孢JTF001的发酵液包含3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇，和/或2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮。

[0008] 在本申请的具体实施方案中，所述交链格孢JTF001的发酵液的获得方法包括以下步骤：

[0009] (1)将交链格孢JTF001进行固体发酵，得到固体发酵物；

[0010] (2)使用乙酸乙酯浸泡，得到提取液，将所述提取液进行减压蒸馏后，得到粗提物浸膏；

[0011] (3)将所述粗提物浸膏溶解进行硅胶柱层析分离，得到所述交链格孢JTF001的发酵液。

[0012] 在本申请的具体实施方案中，步骤(1)中，将交链格孢JTF001在大米固体培养基中进行固体发酵，所述发酵的条件包括：在温度25～30℃、黑暗静置培养10～25d。

[0013] 在本申请的具体实施方案中，步骤(2)中，使用乙酸乙酯浸泡15～30h，然后超声提取0.5～1.5h。

[0014] 在本申请的具体实施方案中，步骤(3)中，所述硅胶柱层析色谱分离时，使用石油醚和乙酸乙酯洗脱液，及甲醇和乙酸乙酯洗脱液，得到所述粗提物；

[0015] 所述石油醚和乙酸乙酯洗脱液中石油醚和乙酸乙酯的体积比为0～1：0～1；

[0016] 所述甲醇和乙酸乙酯洗脱液中甲醇和乙酸乙酯的体积比为0.01～1：0～0.99。

[0017] 在本申请的具体实施方案中，步骤(3)中，所述粗提物经高效液相色谱分离得到活性成分，所述活性成分为3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇，或2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮。

[0018] 在本申请的具体实施方案中，步骤(4)中，将所述活性成分使用质谱与核磁共振波谱进行分析。

[0019] 根据本申请的另一个方面，还提供了3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇在抑制瓜列当种子萌发中的应用。

[0020] 根据本申请的另一个方面，还提供了2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮在抑制瓜列当种子萌发中的应用。

[0021] 本发明的有益效果包括但不限于：

[0022] (1)本发明首次公开了交链格孢JTF001的发酵液中3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇和2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮抑制瓜列当种子萌发的作用，这两种化合物可直接用于防治瓜列当，对瓜列当的抑制作用显著。

[0023] (2)本发明涉及的交链格孢JTF001的发酵液的获得方法，通过交链格孢JTF001粗提物中提取获得出防治瓜列当的活性物质，确定了交链格孢JTF001粗提物中的有效成分，得到天然活性物质，为防治瓜列当提供了一个新的路径。

[0024] (3)本发明涉及的交链格孢JTF001的发酵液的获得方法，首次提取得到化合物3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇和2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮，为这两种天然化合物的开发研究提供了一个新的思路。

附图说明

[0025] 图1为本发明实施例中的化合物LF6‑2的核磁共振氢谱图；

[0026] 图2为本发明实施例中的化合物LF6‑2的核磁共振碳谱图；

[0027] 图3为本发明实施例中的化合物LF6‑2的核磁共振HSQC图；

[0028] 图4为本发明实施例中的化合物LF6‑2的核磁共振HMBC图；

[0029] 图5为本发明实施例中的化合物LF6‑2的正离子源质谱数据图；

[0030] 图6为本发明实施例中的化合物LF12‑29‑3的核磁共振氢谱图；

[0031] 图7为本发明实施例中的化合物LF12‑29‑3的核磁共振碳谱图；

[0032] 图8为本发明实施例中的化合物LF12‑29‑3的核磁共振HSQC图；

[0033] 图9为本发明实施例中的化合物LF12‑29‑3的核磁共振HMBC图；

[0034] 图10为本发明实施例中的化合物LF12‑29‑3的正离子源质谱数据图。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。

[0036] 本发明中，如未指定，所采用原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

[0037] 实施例中所用的菌株交链格孢JTF001分离自新疆吉木萨尔县加工番茄田自然发病瓜列当植株茎基部，并于2021年10月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：中国广州市先烈中路100号，广东省微生物所，邮编：510070)，保藏号为GDMCC No.61964，提议的分类学名称：Alternaria alternata。

[0038] 实施例1 活性物质的提取方法

[0039] (1)交链格孢JTF001的固体发酵

[0040] 将保藏的交链格孢菌菌株转接到PDA培养基上，28℃下培养5d。取菌饼加在装有半固体培养基(配方：蛋白胨10g、麦芽糖40g、酵母提取粉10g、琼脂4g和蒸馏水1000mL)的三角瓶中为半固体种子液，并在28℃、180r·min‑1下振荡培养48h。在大米固体培养基(配方：500mL的三角瓶中放入80g大米、1.2g酵母粉和蒸馏水120mL、浸泡过夜后在121℃灭菌
30min)中加入5mL半固体种子液，并在28℃培养15d。

[0041] (2)粗提物的提取

[0042] 将大米固体培养基进行机械搅拌，每瓶中加入240mL乙酸乙酯浸泡24h，超声1h、提取2次。将乙酸乙酯浸泡液进行旋转蒸发减压蒸馏后，得到所述粗提物浸膏17g。

[0043] (3)化合物的分离纯化

[0044] 将17g粗提物浸膏用20g 200～300目硅胶进行充分拌样、自然风干，用300～400目硅胶装柱，用石油醚‑乙酸乙酯‑甲醇溶剂体系进行硅胶柱减压洗脱，按照极性由小到大的顺序将粗提物分成17个馏分，命名为LF1～17。具体的：使用石油醚洗脱后，得到馏分LF1；体积比为99％:1％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF2；体积比为97％:3％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF3；体积比为95％:5％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF4；体积比为90％:10％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF5；体积比为85％:15％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF6；体积比为80％:20％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF7；体积比为75％:25％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF8；体积比为70％:30％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF9；体积比为60％:40％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF10；体积比为50％:50％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF11；体积比为30％:70％的石油醚和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF12；使用乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF13。使用体积比为1％:99％的甲醇和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF14；使用体积比为3％:97％的甲醇和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF15；使用体积比为5％:95％的甲醇和乙酸乙酯洗脱后，得到馏分LF16；使用甲醇洗脱后，得到馏分LF17。每个洗脱梯度体积为1L，分别测试LF1～17对瓜列当种子萌发的抑制活性，结果见表1，由表的结果，表明馏分LF6(石油醚：乙酸乙酯＝85％:15％)和LF12(石油醚：乙酸乙酯＝30％:70％)对瓜列当种子萌发有较好的抑制活性。

[0045] 表1 不同馏分对瓜列当种子萌发的抑制效果

[0046]

[0047]

[0048] 对馏分LF6进行HPLC半制备液相纯化，获得目标化合物LF6‑2。采用Agilent 1260型半制备高压液相色谱仪，HPLC检测方法与条件：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈。使用Kromasil 100‑5‑C18反相半制备色谱柱(10μm、10 x 250mm)进行分离，流速2.0mL/min，洗脱条件为梯度洗脱：0.00～30.00min，B相35％；30.00～30.50min，B相35％‑100％；30.50～35.50min，B相100％；35.50～36.00min，B相100％‑35％。得到20.12mg化合物LF6‑2(保留时间tR＝26.68～28.20min)。

[0049] 对馏分LF12进行HPLC半制备液相纯化，获得目标化合物LF12‑29‑3。采用Agilent 1260型半制备高压液相色谱仪，HPLC检测方法与条件：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈。
使用Kromasil 100‑5‑C18反相半制备色谱柱(10μm、10x 250mm)进行分离，流速2.0mL/min，洗脱条件为梯度洗脱：0.00～35.00min，B相35％；35.00～35.50min，B相35％‑100％；35.50～46.00min，B相100％；46.00～46.50min，B相100％‑35％。得到7.16mg化合物LF12‑29‑3(保留时间tR＝16.95～17.47min)。

[0050] 将充分干燥的化合物LF6‑2和LF12‑29‑3分别用600uL氘代丙酮和氘代甲醇完全溶1 13
解后转移至核磁管内密封，用于测试H‑NMR和 C‑NMR核磁共振波谱，核磁谱的测定由中国科学院微生物研究所代为完成测定。

[0051] 实施例2 化合物LF6‑2和LF12‑29‑3结构鉴定

[0052] 化合物LF6‑2：淡黄色油状固体，易溶于甲醇和氘代丙酮。根据质谱显示化合物的‑[M‑H] 分子离子峰为197.00(图5)，推断其分子式为C10H15NO3，进一步通过其核磁共振氢谱
1 13
( H‑NMR)和碳谱( C‑NMR)与文献(T Rosett.1957,67:390‑400)报道的已知化合物
Tenuazonic acid进行对比分析，确定了其结构式如式Ⅰ所示，化学名称为3‑乙酰‑5‑仲丁基‑4‑羟基‑3‑吡咯啉‑2‑醇。

[0053]

[0054] 化合物LF12‑29‑3：淡黄色油状固体，易溶于甲醇和氘代丙酮。根据质谱显示化合物的[M+H]+分子离子分为292.00(图10)，推断其分子式为C15H16O6，进一步通过其核磁共振氢谱(1H‑NMR)和碳谱(13C‑NMR)与文献(R.W.Pero.1971,230,170‑179.)报道的已知化合物Altenuene进行对比分析，确定了其结构式如式Ⅱ所示，化学名称为2，3，4，5'‑四氢‑2,3,7‑三羟基‑9‑甲氧基‑4'‑甲基‑二苯并‑6‑吡喃酮(2,3,4,4a‑Tetrahydro‑2,3,7‑trihydroxy‑9‑methoxy‑4a‑methyl‑6H‑dibenzo[b,d]pyran‑6‑one)。

[0055]

[0056] 本发明制备的化合物LF6‑2和LF12‑29‑3氢谱(1H‑NMR)和碳谱(13C‑NMR)如图1‑4、6‑8所述，质谱数据图如图5、10所示，具体数据见表2、表3。

[0057] 表2 化合物LF6‑2的碳谱、氢谱NMR数据(acetone‑d6)

[0058]

[0059]

[0060] 表3 化合物LF12‑29‑3的碳谱、氢谱NMR数据(methanol‑d4)

[0061]

[0062] 综上，从交链格孢JTF001中提取并分离了天然化合物LF6‑2和LF12‑29‑3，经过进一步的纯化，结合高效液相色谱，质谱和核磁共振技术分析鉴定该化合物的结构特征。

[0063] 实施例3 天然化合物LF6‑2和LF12‑29‑3对瓜列当种子萌发抑制作用测定

[0064] a、瓜列当种子消毒：将瓜列当种子在75％的酒精中消毒1.5min后转至1％的次氯酸钠消毒12min，无菌滤纸上晾干备用。

[0065] b、溶液配制：将核磁管内溶液进行氮吹，吹干后测得LF6‑2和LF12‑29‑3的质量分别为20.00mg和7.00mg。分别加入100μL甲醇进行溶解，再分别加入无菌水配成8mM母液，再将其稀释成4mM、2mM和1mM。

[0066] c、瓜列当种子萌芽抑制测定：于24孔板中每孔加入40粒左右消毒干燥的瓜列当种子，处理组分别加入0.5mL独脚金内酯(GR24)和0.5mL的8mM、4mM、2mM和1mM的化合物溶液，处理组LF6‑2和LF12‑29‑3化合物的最终浓度为4mM、2mM、1mM和0.5mM，对照组为0.5mL独脚金内酯(GR24)和0.5mL无菌水，每处理3次重复。25℃，遮光培养5d后，体式显微镜下观察瓜列当种子萌芽数量并记录。计算不同浓度化合物对瓜列当种子萌发抑制效果，如表4所示。

[0067]

[0068] 表4 不同浓度化合物对瓜列当种子萌发的抑制效果

[0069]

[0070] 由表4的结果可知，上述化合物LF6‑2和LF12‑29‑3对瓜列当种子的萌发均有显著的抑制效果，且浓度越高，对瓜列当种子的萌发的抑制作用越好，LF6‑2和LF12‑29‑3的浓度在1mM以上时，对瓜列当种子的萌发的抑制率为1000％。

[0071] 以上对本发明所提供的交链格孢JTF001的发酵液在抑制瓜列当种子萌发中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和优化，这些改进和优化也落入本发明权利要求的保护范围内。