一种RNA荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及探针检测技术领域，尤其涉及一种RNA荧光探针及其制备方法和应用。本发明所述的RNA荧光探针是一种以噻吩类化合物为基础合成的新型探针，该探针可以凭借自身“V”型共轭结构和刚性平面之间以单键的形式相连的特点，通过氢键相互作用和嵌插作用等与RNA结合，嵌入RNA后探针单键的自由旋转受限产生扭转分子内电荷转移(TICT)机制效应从而能够通过荧光检测方法对RNA进行生物成像，尤其是可以实现细胞或者水环境中RNA的检测。根据实施例的记载，本发明所述的RNA荧光探针不仅具有高稳定性、低背景荧光和高灵敏度，而且具有跟踪和成像能力。

权利要求

1.一种RNA荧光探针，其特征在于，具有式Ⅰ所示结构：式Ⅰ。

2.权利要求1所述RNA荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将具有式Ⅱ所示结构的化合物、碘乙烷和有机溶剂进行第一混合后，进行亲核取代反应，得到所述RNA荧光探针；

式Ⅱ。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物和碘乙烷的摩尔比为1：（3.0 3.5）。

~

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物和第一有机溶剂的用量比为1mmol：（90 120）mL。

~

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一混合包括先将具有式Ⅱ所示结构的化合物与第一有机溶剂混合后，再滴加碘乙烷。

6.如权利要求2 5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述亲核取代反应在回流条件~

下进行；

所述亲核取代反应的温度为75 95℃，时间为70 75h。

~ ~

7.权利要求2 5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物~

的制备方法，包括以下步骤：将联噻吩双溴、碳酸钾、醋酸钯、三（邻甲基苯基）磷和第二有机溶剂进行第二混合后，滴加4‑乙烯基吡啶，进行偶联反应，得到所述具有式Ⅱ所示结构的化合物。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述联噻吩双溴和4‑乙烯基吡啶的摩尔比为（0.8 1.2）：4。

~

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应在保护气氛和回流的条件下进行；

所述偶联反应的温度为110 140℃，时间为65 80h。

~ ~

10.权利要求1所述的RNA荧光探针或权利要求2 9任一项所述的制备方法制备得到的~

RNA荧光探针在制备检测RNA探针中的应用。

说明书

一种RNA荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及探针检测技术领域，尤其涉及一种RNA荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 核糖核酸(RNA)不仅在活细胞中存在，而且分布在环境微生物中。因此，研究RNA在微生物和人体中的存在特性对于评价生态环境和人类健康具有重要意义。

[0003] 目前，商业化的RNA探针较少，使用比较普遍的是美国生产的SYTO RNASelect Green Fluorescent Cell Stain，但是该探针的光稳定性较差，检测效果并不好。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供了一种RNA荧光探针及其制备方法和应用，所述RNA荧光探针具有较高的光稳定性和较高的检测灵敏度。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种RNA荧光探针，具有式Ⅰ所示结构：

[0007]

[0008] 本发明还提供了上述技术方案所述RNA荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 将具有式Ⅱ所示结构的化合物、碘乙烷和有机溶剂进行第一混合后，进行亲核取代反应，得到所述RNA荧光探针；

[0010]

[0011] 优选的，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物和碘乙烷的摩尔比为1：(3.0～3.5)。

[0012] 优选的，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物和第一有机溶剂的用量比为1mmol：(90～120)mL。

[0013] 优选的，所述第一混合包括先将具有式Ⅱ所示结构的化合物与第一有机溶剂混合后，再滴加碘乙烷。

[0014] 优选的，所述亲核取代反应在回流条件下进行；

[0015] 所述亲核取代反应的温度为75～95℃，时间为70～75h。

[0016] 优选的，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物的制备方法，包括以下步骤：

[0017] 将联噻吩双溴、碳酸钾、醋酸钯、3‑邻甲苯基磷和第二有机溶剂进行第二混合后，滴加4‑乙烯基吡啶，进行偶联反应，得到所述具有式Ⅱ所示结构的化合物。

[0018] 优选的，所述联噻吩双溴和4‑乙烯基吡啶的摩尔比为(0.8～1.2)：4。

[0019] 优选的，所述偶联反应在保护气氛和回流的条件下进行；

[0020] 所述偶联反应的温度为110～140℃，时间为65～80h。

[0021] 本发明还提供了上述技术方案所述的RNA荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的RNA荧光探针在检测RNA中的应用。

[0022] 本发明提供了一种RNA荧光探针，具有式Ⅰ所示结构：

[0023]

[0024] 本发明所述的RNA荧光探针是一种以噻吩类化合物为基础合成的新型探针，该探针可以凭借自身“V”型共轭结构和刚性平面之间以单键的形式相连的特点，通过氢键相互
作用和嵌插作用等与RNA结合，嵌入RNA后所述RNA荧光探针单键的自由旋转受限产生扭转
分子内电荷转移(TICT)机制效应从而能够通过荧光检测方法对RNA进行生物成像，尤其是
可以实现细胞或者水环境中RNA的检测。根据实施例的记载，本发明所述的RNA荧光探针不
仅具有高稳定性、低背景荧光和高灵敏度，而且具有跟踪和成像能力。因此，所述RNA荧光探
针可以实现细胞或者水环境中RNA的检测，通过所述RNA荧光探针对各类肿瘤细胞内RNA进
行成像，将为探索基因引发重大疾病的发病机制提供重要参考。

附图说明

[0025] 图1为实施例1制备得到的Bptp‑R1的核磁共振谱图；

[0026] 图2为实施例1制备得到的Bptp‑R1的高分辨质谱图；

[0027] 图3为实施例1制备得到的Bptp‑R1的溶剂化效应测试结果图；

[0028] 图4为实施例1所述Bptp‑R1在水相环境中不同RNA浓度条件下的荧光光谱图；

[0029] 图5为图4中不同RNA浓度条件下对应最高发射峰的变化趋势图；

[0030] 图6为实施例1所述Bptp‑R1在不同种类的细胞内的荧光成像图。

具体实施方式

[0031] 本发明提供了一种RNA荧光探针，具有式Ⅰ所示结构：

[0032]

[0033] 本发明还提供了上述技术方案所述RNA荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

[0034] 将具有式Ⅱ所示结构的化合物、碘乙烷和第一有机溶剂进行第一混合后，进行亲核取代反应，得到所述RNA荧光探针；

[0035]

[0036] 在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。

[0037] 在本发明中，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物的中文名称为5,5'‑二(2‑(4‑吡啶基)乙烯基)‑2,2'‑联噻吩，英文缩写为PPVB。

[0038] 在本发明中，所述具有式Ⅱ所示结构的化合物的制备方法，优选包括以下步骤：

[0039] 将联噻吩双溴、碳酸钾、醋酸钯、3‑邻甲苯基磷和第二有机溶剂进行第二混合后，滴加4‑乙烯基吡啶，进行偶联反应，得到所述具有式Ⅱ所示结构的化合物。

[0040] 在本发明中，所述联噻吩双溴、碳酸钾、醋酸钯和3‑邻甲苯基磷的摩尔比优选为3.1:10.0:0.3:0.9。

[0041] 在本发明中，所述第二有机溶剂优选为N,N‑二甲基甲酰胺；所述联噻吩双溴与所述第二有机溶剂的用量比优选为3.1mmol：30mL。

[0042] 在本发明中，所述第二混合优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的时间优选为0.5h；本发明对所述搅拌的转速没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进
行即可。

[0043] 在本发明中，所述4‑乙烯基吡啶的滴加方式优选为逐滴滴加。

[0044] 在本发明中，所述联噻吩双溴和4‑乙烯基吡啶的摩尔比优选为(0.8～1.2)：4，更优选为3.1:12。

[0045] 在本发明中，所述偶联反应优选在保护气氛和回流的条件下进行；所述保护气氛优选为氮气气氛。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为110～140℃，更优选为120～130
℃，最优选为120℃，时间优选为65～80h，更优选为68～75h，最优选为72h。

[0046] 所述偶联反应完成后，本发明还优选包括将得到的产物体系与冰水混合物进行混合后依次进行过滤、萃取和柱层析分离。在本发明中，将得到的产物体系与冰水混合物进行
混合的目的是使得到的产物体系的温度迅速降低，体系中洗出溶解性差的杂质。本发明对
所述过滤的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程进行即可。在本发
明中，所述萃取采用的萃取剂优选为体积比为1:5的二氯甲烷和水的混合液。所述萃取完成
后，本发明优选将得到的有机相进行柱层析分离。在本发明中，所述柱层析分离采用的试剂
优选为体积比为50:1的二氯乙烷和甲醇的混合液。

[0047] 在本发明中，所述第一有机溶剂优选为乙腈和/或乙醇，当所述第一有机溶剂为乙腈和乙醇时，本发明对所述乙腈和乙醇的配比没有任何特殊的限定，按任意配比进行混合
即可。

[0048] 在本发明中，所述PPVB和碘乙烷的摩尔比优选为1：(3.0～3.5)，更优选为1：(3.1～3.4)，最优选为1：(3.2～3.3)。

[0049] 在本发明中，所述PPVB和第一有机溶剂的用量比优选为1mmol：(90～120)mL，更优选为1mmol：(100～110)mL。

[0050] 在本发明中，所述第一混合优选包括先将具有式Ⅱ所示结构的化合物与第一有机溶剂混合后，再滴加碘乙烷。

[0051] 在本发明中，所述亲核取代反应优选在回流条件下进行；所述亲核取代反应的温度优选为75～95℃，更优选为80～90℃，最优选为85℃；时间优选为70～75h，更优选为75h。
在本发明中，所述亲核取代反应的起始时间优选以碘乙烷滴加完毕的时间计。

[0052] 所述亲核取代反应完成后，本发明还优选包括依次进行的真空蒸馏和柱层析分离；本发明对所述真空蒸馏的过程没有任何特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的过程
进行即可。在本发明中，所述柱层析分离采用的试剂优选为体积比为10:1的二氯乙烷和甲
醇的混合液。

[0053] 本发明还提供了上述技术方案所述的RNA荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的RNA荧光探针在检测RNA中的应用。在本发明中，所述应用优选为检测水环境
或检测成像不同种类癌细胞中的内源性RNA。

[0054] 下面结合实施例对本发明提供的RNA荧光探针及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0055] 实施例1

[0056] 将联噻吩双溴(1.0g，3.1mmol)、K2CO3(1.38g，10.0mmol)、醋酸钯(0.07g，0.3mmol)和3‑邻甲苯基磷(0.9mmol)溶于N,N‑二甲基甲酰胺(DMF，30mL)中，搅拌混合0.5h，向所得混
合物中逐滴加入4‑乙烯基吡啶(1.3g，12.0mmol)，滴加完毕后，在氮气保护条件下于120℃
回流反应72h，反应体系由淡黄色变为黑色；反应结束后，将所得产物体系与冰水混合物(0
℃)混合，以将产物体系的温度迅速降低，体系中析出溶解性差的杂质，过滤后采用二氯甲
烷和水将所得滤液进行萃取，其中，萃取所用二氯甲烷和水的体积比为1：5；将萃取所得有
机相进行柱层析分离，按体积比计，柱层析分离所用试剂为二氯乙烷：甲醇＝50：1，最终得
到的黄色固体为化合物PPVB，收率为35％；

[0057] 将所述PPVB(0.372g，1.0mmol)溶于乙腈(MeCN，100mL)中，搅拌混合，在得到的混合物中逐滴滴加碘乙烷(0.468g，3.0mmol)，滴加完毕后，85℃回流反应75h，反应体系由黄
色变为黑色，反应结束后，将得到的产物体系进行真空蒸干，以体积比为10:1的二氯乙烷和
甲醇的混合液作为分离试剂进行柱层析分离，得到RNA荧光探针(记为Bptp‑R1)，收率为
35％；

[0058] 将所述Bptp‑R1进行核磁共振测试，测试结果如图1所示；将所述Bptp‑R1进行高分辨质谱测试，测试结果如图2所示，由图1～2可知，利用上述制备方法制备得到的产物为
Bptp‑R1。

[0059] 测试例1

[0060] 对所述Bptp‑R1的溶剂化效应进行测定，测试过程为：

[0061] 将所述Bptp‑R1溶解于N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)中，得到8mL浓度为1mM的Bptp‑R1母液；

[0062] 分别取25μL的Bptp‑R1母液加入5个相同的5mL容量瓶中，然后分别用DMF、乙腈、PBS缓冲液(pH值为7.2～7.4)、甲醇和纯水稀释定容，然后在激发波长488nm条件下进行荧
光检测。

[0063] 图3为所述Bptp‑R1的溶剂化效应测试结果图，其中，A为吸收光谱，B为荧光光谱；由图3可知，所述Bptp‑R1在有机相的最大发射峰和在水相中最大发射峰均出现在550nm左
右。

[0064] 测试例2

[0065] 将所述Bptp‑R1溶解于DMF中，得到8mL浓度为1mM的Bptp‑R1母液；

[0066] 将RNA溶解于Tris‑HCl缓冲溶液(10mM Tris‑HCl,100mM KCl,pH＝7.2)中，得到较高浓度的RNA母液；

[0067] 通过朗伯比尔定律测定浓度，然后稀释到不同的浓度(0～0.5mM)，分别取不同浓度的RNA稀释液1.99mL到20个相同的2mL容量瓶中，每个容量瓶中加入10μL Bptp‑R1母液，
得到一系列不同RNA浓度的待测液，将各待测液在激发波长550nm条件下进行荧光检测；

[0068] 图4为所述Bptp‑R1在水相环境中不同RNA浓度条件下的荧光光谱图，由图4可知，在635nm处出现发射峰，且随着待测液中RNA浓度增大，荧光强度逐渐增强，这说明本发明提
供的所述Bptp‑R1能够实现对水相环境中RNA的检测；

[0069] 图5为图4中不同RNA浓度条件下对应最高发射峰的变化趋势图，由图5可知，在激发波长为550nm条件下，在635nm处发射峰呈现逐渐增强直到平衡的趋势，这说明所述Bptp‑
R1与RNA会发生相互作用，使所述Bptp‑R1的荧光光谱发生变化，具体表现为随着RNA浓度的
增加，荧光强度逐渐增强。

[0070] 测试例3

[0071] 分析所述Bptp‑R1在活细胞中的成像应用，具体如下：

[0072] 将所述Bptp‑R1溶解于DMF中，得到10mL浓度为1mM的Bptp‑R1母液；

[0073] 采用培养基将HeLa、A549和HepG2细胞在培养皿中培养3天，细胞培养基组成分别为0.9DMEM和0.1胎牛血清。在细胞培养和培养过程中，将细胞培养皿和成像培养皿置于37
℃和5％二氧化碳的恒温培养箱中。这些细胞在无菌超净台上处理。

[0074] 在细胞消化实验中，用4％福尔马林固定溶液将细胞固定在成像皿表面，然后加入0.4wt％Triton X‑100穿孔细胞膜。用PBS洗涤细胞后，将每个细胞分别分为两组。一组用含
有RNase的PBS(30μg/mL)处理2h，另一组用干净的PBS作为对照。然后将所有细胞与探针
Bptp‑R1(10μM)孵育30min，PBS洗涤2次后用共聚焦激光显微镜进行荧光成像，激发波长为
488nm，发射为570～620nm。

[0075] 图6为所述Bptp‑R1在不同种类的细胞内的荧光成像图，其中，(A1，B1，C1)为探针分别在HeLa(A1)、HepG2(B1)和A549(C1)细胞中的RNase消化前后荧光成像对比图，(A2，B2，
C2)分别为消化前后HeLa(A2)、HepG2(B2)和A549(C2)细胞的细胞质和细胞核中的荧光强度
对比；由图6可知，本发明提供的所述Bptp‑R1在不同种类的细胞内能够实现对RNA的成像。

[0076] 由此可知，本发明提供的荧光探针不但能够在水相中检测RNA，而且能够在细胞中实现对RNA的检测；操作方法简单，具有广阔的应用前景。

[0077] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。