用于急性缺血性脑卒中预后或复发预警评估的生物标志物及其应用

摘要

本发明公开了用于急性缺血性脑卒中预后或复发预警评估的生物标志物及其应用。根据本发明所提供的生物标志物，通过制备用于检测所述生物标志物的ELISA试剂和RT‑qPCR试剂，并利用其对受试者的血浆蛋白或血浆外泌体蛋白中的相应生物标志物进行表达量的检测，实现对急性缺血性脑卒中的分析或检测，不仅能够预测受试者患急性缺血性脑卒中的风险，还能监测患者或受试者急性缺血性脑卒中的发生。本发明提供用于急性缺血性脑卒中预后或复发预警评估的生物标志物，有助于更好地了解急性缺血性脑卒中的病理生理机制。

权利要求

1.ALOX12作为急性缺血性脑卒中生物标志物在制备急性缺血性脑卒中分析试剂或试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物还包括COL1A2、hsa‑miR‑

423‑3p和hsa‑miR‑24‑3p中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物还包括以下任一种或多种蛋白：LTF、CSK、ITGAM、SAA1。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述生物标志物来自血浆蛋白或血浆外泌体蛋白。

说明书

用于急性缺血性脑卒中预后或复发预警评估的生物标志物及

其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物标志物技术领域，尤其涉及用于急性缺血性脑卒中预后或复 发预警评估的生物标志物。

背景技术

[0002] 脑血管疾病(Cerebralvascular disease,CVD)包括短暂性缺血发作(Transientischemic attack,TIA)和脑卒中(Stroke)。AIS又称急性脑梗死，是各种原因导致的 脑组织血液供应障碍，并由此产生的缺血缺氧性坏死，进而出现神经功能障碍的 一组临床综合征。AIS是最常见的卒中类型，约占全部卒中的60％‑80％。然而， AIS的治疗却十分有限，目前临床上证明有效的急性期治疗方案为静脉阿替普酶 (tPA)溶栓或血管内取栓实现缺血
区域的血管再通。但是由于治疗时间窗窄，以 及脑水肿、出血转化等并发症风险增加，血管内取栓需要复杂的技术的专业团队 保障，临床上仅15％患者可以获益。

[0003] AIS病人血脑屏障的完整性破坏，但是外周血脑损伤释放的蛋白质和其他物 质的出现时间点，含量以及是否能反映脑损伤的情况以及病人的预后，是脑卒中 领域悬而未决的问题，具有重要的临床应用前景。目前国际、国内市场上没有用 于AIS的预后和复发预警生物标志物，无法满足临床需求。因此，寻找预测AIS 预后和复发的生物标志物已成为脑卒中管理的一个主要挑战。

[0004] 单一组学数据分析通常用来解释某种特征性的生化指标与某些疾病之间的关 联，但无法说明其中复杂的因果关系。技术的进步催生了“组学时代”，这使得我们 能够在不同的分子水平上收集和整合数据和信息。这些多组学数据的整合意味着 可以同时研究成千上万的蛋白质(蛋白质组学)、基因(基因组学)、RNA(转 录组学)和代谢物(代谢组学)。
人工智能将提供对复杂生物系统的新见解，并 揭示所有分子水平之间的相互作用网络。这种方法将多个分子水平的实验数据与 计算模型相结合，并将系统作为一个整体进行处理，以利于进行诊断、预后或治 疗价值的数据识别。

[0005] 生物标志物可提示AIS病理生理过程，对AIS的早期卒中复发风险具有预测 价值，为临床诊断及治疗提供依据。但是至今尚无公认的对AIS预后预测价值高 的生物标志物，无法满足临床需求。因此，寻找快速准确的AIS预后的生物学标 志物具有重要的临床应用前景。与此同时，通过组学技术获得的数据信息与临床 信息整合将有助于更好地了解AIS病理机制、并发现新的生物标志物，从而改善 AIS患者的管理。

发明内容

[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供用于急性缺血性脑卒 中预后或复发预警评估的生物标志物及其具体应用。

[0007] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

[0008] 第一方面，本发明提供了COL1A2、ALOX12、hsa‑miR‑423‑3p和hsa‑miR‑24‑3p 中的一种或多种作为急性缺血性脑卒中生物标志物在制备急性缺血性脑卒中分析 (预测、诊断或监测)试剂或试剂盒中的应用。

[0009] 进一步地，所述生物标志物还包括以下任一种或多种蛋白和/或micro RNA：

[0010] 蛋白：F11R，TUBA8，ESD，YWHAZ，VCP，HRNR，CALML5，BST1， BPIFB1，SPINK5，ARSA，GM2A，HBB，TUBA4A，HBD，HBA2，FGC，ABCB9， APTB；

[0011] micro RNA：hsa‑miR‑378a‑3p，hsa‑let‑7d‑5p，hsa‑miR‑10a‑5p，hsa‑let‑7d‑3p， hsa‑miR‑151a‑5p，hsa‑miR‑486‑5p，hsa‑miR‑93‑5p，hsa‑miR‑1‑3p，hsa‑miR‑590‑3p。

[0012] 更进一步地，所述生物标志物还包括以下任一种或多种蛋白和/或micro RNA：

[0013] 蛋白：Flotillin1，PRDX1，LTF，FKBP，CD31，ADAMTS13，Gelsolin，CAPN1， AK1，GSTO1，PARK7，SELP，ENO1，GSTP1，SELENOP，APOA4，PON1，AHSG，MMP2，VTN，PROS1，MMP9，CSK，ITGAM(CD11b)，SAA1，PRDX5， UNC13D，PNP；

[0014] micro RNA：hsa‑miR‑222‑3p，hsa‑miR‑21‑5p，hsa‑miR‑34a‑5p，hsa‑miR‑27a‑3p， hsa‑let‑7c‑5p，hsa‑miR‑126‑5p，hsa‑miR‑10b‑5p，hsa‑miR‑532‑5p，hsa‑miR‑425‑5p， hsa‑miR‑20a‑5p，hsa‑miR‑18a‑5p。

[0015] 所述“一种或多种”的含义为：可选自前述蛋白中的一种、两种、三种、或更多 种，和/或前述micro RNA中的一种、两种、三种、或更多种。在本发明所列的蛋 白及micro RNA范围内，选取任意数量的任意蛋白进行排列组合均属于本发明的保 护范围。

[0016] 更为优选，本发明所述的生物标志物来自血浆蛋白或血浆外泌体蛋白。

[0017] 第二方面，本发明提供了一种急性缺血性脑卒中分析(预测、诊断或监测) 试剂，所述试剂包括检测受试者血浆蛋白或血浆外泌体蛋白。中COL1A2、 ALOX12、hsa‑miR‑423‑3p和hsa‑miR‑24‑3p中任一种或多种蛋白和/或micro RNA表 达量的试剂。

[0018] 进一步地，所述试剂还包括检测受试者血浆蛋白或血浆外泌体蛋白。中以下 任一种或多种蛋白和/或micro RNA表达量的试剂；

[0019] 蛋白：F11R，TUBA8，ESD，YWHAZ，VCP，HRNR，CALML5，BST1， BPIFB1，SPINK5，ARSA，GM2A，HBB，TUBA4A，HBD，HBA2，FGC，ABCB9， APTB；

[0020] micro RNA：hsa‑miR‑378a‑3p，hsa‑let‑7d‑5p，hsa‑miR‑10a‑5p，hsa‑let‑7d‑3p， hsa‑miR‑151a‑5p，hsa‑miR‑486‑5p，hsa‑miR‑93‑5p，hsa‑miR‑1‑3p，hsa‑miR‑590‑3p。

[0021] 更进一步地，所述试剂还包括检测受试者血浆蛋白或血浆外泌体蛋白中以下 任一种或多种蛋白和/或micro RNA表达量的试剂；

[0022] 所述蛋白包括：Flotillin1，PRDX1，LTF，FKBP，CD31，ADAMTS13，Gelsolin， CAPN1，AK1，GSTO1，PARK7，SELP，ENO1，GSTP1，SELENOP，APOA4， PON1，AHSG，MMP2，VTN，PROS1，MMP9，CSK，ITGAM(CD11b)，SAA1， PRDX5，UNC13D，PNP中的任意一种或多种；

[0023] 所述micro RNA包括：hsa‑miR‑222‑3p，hsa‑miR‑21‑5p，hsa‑miR‑34a‑5p， hsa‑miR‑27a‑3p，hsa‑let‑7c‑5p，hsa‑miR‑126‑5p，hsa‑miR‑10b‑5p，hsa‑miR‑532‑5p， hsa‑miR‑425‑5p，hsa‑miR‑20a‑5p，hsa‑miR‑18a‑5p。

[0024] 应当理解的是，含有本发明所述试剂的试剂盒或其他检测产品也同样属于本 发明的保护范围。

[0025] 第三方面，本发明提供一种急性缺血性脑卒中分析(预测、诊断或监测)系 统，包括：

[0026] (1)检测来自受试者生物测试样品中的生物标志物，包括前述分析试剂；

[0027] (2)将检测到的生物标志物的表达水平与所述生物标志物的正常或参照表达 水平进行对比。

[0028] 作为优选，所述生物测试样品为血浆蛋白或血浆外泌体蛋白。

[0029] 进一步地，根据所述系统的对比结果，可对受试者患急性缺血性脑卒中的风 险进行预测或对该疾病的发生进行监测。

[0030] 当生物标志物的表达水平相对于正常或参照表达水平存在差异，且差异表达 变化如表1所示时，表明受试者具有患急性缺血性脑卒中的风险。

[0031] 第四方面，本发明提供了以下任一种或多种蛋白作为急性缺血性脑卒中预后 评估生物标志物在制备急性缺血性脑卒中预后评估试剂或试剂盒中的应用，所述 蛋白选自：
SIRPA,ECM1,OLFM4,Flotillin1,PRDX1,SAA1,LTF,FKBP,Lectin, CD31,ADAMTS13,
Gelsolin,HPR,FAC,HBD,HBA2,THBS4,ABCB9。

[0032] 同时，本发明还提供了以下任一种或多种蛋白作为急性缺血性脑卒中复发预 警生物标志物在制备急性缺血性脑卒中复发预警试剂或试剂盒中的应用，所述蛋 白选自：
ATP2A2,ARL6IP5,MYL9,APTB,CA3,ZYX,ARPC4,TAGLN2,UBE2L3, CAPN1,TPI1,F11R,PNP,
AK1,GSTO1,TUBA8,ESD,PARK7,SELP,YWHAZ, PRDX5,VCP,ENO1,UNC13D,HRNR,CALML5,BST1,BPIFB1,SPINK5,ARSA, GM2A,GSTP1,SELENOP,APOA4,PON1。

[0033] 同时，本发明还提供了以下任一种或多种蛋白作为出血转化预测生物标志物 在制备出血转化预测试剂或试剂盒中的应用，所述蛋白选自：COL1A2,MMP2, MMP9,AHSG,VTN,PROS1,HBB,TUBA4A,FGC。

[0034] 最后，本发明还提供了SAA1和/或LTF作为急性缺血性脑卒中炎症及预后生物 标志物在制备急性缺血性脑卒中炎症检测及预后检测试剂或试剂盒中的应用。

[0035] 本发明的有益效果在于：

[0036] 本发明提供了用于急性缺血性脑卒中预后或复发预警评估的生物标志物及其 应用。凭借这些生物标志物，可制备用于急性缺血性脑卒中预测、诊断或监测的 试剂或试剂盒，以预测受试者患急性缺血性脑卒中的风险，或监测患者或受试者 急性缺血性脑卒中的发生。

[0037] 本发明提供的生物标志物组，有助于更好地了解急性缺血性脑卒中的病理生 理，将为诊断和预后提供新的机会，从而改善急性缺血性脑卒中患者的临床服务。

附图说明

[0038] 此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的 实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

[0039] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例 或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普 通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其 他的附图。

[0040] 图1为本发明所述生物标志物(蛋白和micro RNA)在急性缺血性脑卒中病 人中和健康人中的差异表达结果；其中：A部分示出了外周血浆蛋白和外泌体蛋 白质组学鉴定出
32种上调蛋白和30种下调蛋白，B部分示出了外泌体micro RNA 组学鉴定出13种上调micro RNA和9种下调micro RNA。

[0041] 图2为实施例5中采用酶联免疫吸附测定筛选的差异表达蛋白。

[0042] 图3为实施例6中采用RT‑qPCR筛选的差异表达microRNA。

具体实施方式

[0043] 为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的 方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实 施例中的特征可以相互组合。

[0044] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可 以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明 的一部分实施例，而不是全部的实施例。

[0045] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以 下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。 本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各 种修改和替换。

[0046] 在本发明中，术语“急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke，AIS)”又称急 性脑梗死，是各种原因导致的脑组织血液供应障碍，并由此产生的缺血缺氧性坏 死，进而出现神经功能障碍的一组临床综合征。

[0047] 在本发明中，术语“生物标志物(Biomarker)”也被称为“生物标志物”，是指 可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变 的生化指标。其可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目 标人群中的安全性及有效性等用途。

[0048] 在本发明中，术语“诊断”和类似术语是指特定疾病的鉴定。

[0049] 在本发明中，受试者(例如患者)的“风险评估”、“风险分类”、“风险鉴定” 或“风险分级”是指评价包括生物标志物的因子以预测包括疾病发作或疾病进展的 未来事件发生的风险，以便可以在更加知情的基础上做出关于受试者的治疗决定。

[0050] 在本发明中，术语“预测”和相关术语是指特定病症(例如短暂性脑缺血发作) 的可能结果的描述。

[0051] 本发明的实施方式包括“监测”可能有患短暂性脑缺血发作风险的受试者。该受 试者可以是未被诊断为有短暂性脑缺血发作的患者，但由于各种临床或医学评估， 可能有患短暂性脑缺血发作的风险。

[0052] 在本发明中，“样品”、“生物样品”，“测试样品”、“样本”、“来自受试者的样 品”和“患者样品”可以互换使用，并且可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊 水、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品。以本文所 讨论的某种方式或本领域已知的其它方式可以用于直接从患者获得样品，或者可 以(例如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心，干扰组分的灭活和添加试剂等) 预处理样品以改变样品的特性。

[0053] 在本发明中，“标记”和“可检测标记”通常是指直接或间接连接到分析物结合分 子(例如其抗体或分析物反应性片段)或分析物以使分析物结合分子(例如其抗 体或分析物反应性片段、核酸探针等)与分析物之间发生反应的可检测部分，并 且如此标记的分析物结合分子(例如其抗体或分析物反应性片段)或分析物被称 为“可检测标记的”。标记可以(例如通过视觉或仪器手段)产生可检测的信号。在 一些方面，标记可以是任何产生信号的部分，并且有时在本文中称为报告基团。 如本文所用，标记(或信号产生部分)产生可测量的信号，该信号可通过外部手 段检测(例如通过测量电磁辐射)，并且依赖于所采用的系统，信号水平可以变 化到标记在固体支持物(例如电极、微粒或珠子)环境中的程度。

[0054] 在本发明中，检测生物标志物的水平的方法包括Western印迹分析，蛋白/肽 功能测定，免疫组织化学分析，ELISA分析，DNA芯片分析，或通过逆转录‑聚合 酶链反应(RT‑PCR)、竞争性RT‑PCR、实时RT‑PCR、数字PCR、RNA酶保护 测定(RPA)、下一代RNA测序和Northern印迹中的一种或多种的mRNA分析 中的一种或多种。示例性的，上述方法可以用于检测蛋白或microRNA。

[0055] 在本发明中，通过外周血浆蛋白和外泌体蛋白质组学鉴定出的，可以用于诊 断急性缺血性脑卒中的32种上调蛋白和30种下调蛋白都是现有技术中已知的蛋 白。

[0056] 在本发明中，可以用于诊断急性缺血性脑卒中的32种上调蛋白和30种下调 蛋白都是现有技术中已知的蛋白(具体信息见表1)，均可以通过现有技术中已知 的检测蛋白的方法，例如通过制备相应的抗体，进而进行检测。

[0057] 表1

[0058]

[0059]

[0060] 在本发明中，术语“微小RNA”或“miRNA”描述小的非编码RNA分子，长度 通常为约15至约50个核苷酸，优选17‑23个核苷酸，其可通过例如称为RNA干 扰(RNAi)的过程在调节基因表达中发挥作用。RNAi描述了通过与靶基因信使 RNA(mRNA)中的序列互补或反义的
RNA序列的存在导致靶基因表达的抑制的 现象。miRNA是由约70个或更多个核苷酸的发夹前体(pre‑miRNA)处理而成， 该前体通过RNA酶Ⅲ的顺序切割衍生自初级转录物(pri‑
miRNA)。miRNA的具 体含义，可以通过miRBase进行查询。miRBase是一个综合性的微小RNA数据库， 位于www.miRBase.org。通常，miRNA基因被转录成前体或pre miRNA，然后被 加工成成熟miRNA。pre‑miRNA通常以发夹形式出现，其中该发夹包含5′臂(或 侧)，该5′臂(或侧)连接到环，然后连接到3′臂(或侧)。前体miRNA的加工 可导致miRNA的两种成熟形式的形成，该形式包括衍生自前体miRNA环的5′侧 或臂的5p形式以及衍生自前体miRNA发夹的
3′侧或臂的3p形式。

[0061] 在本发明中，可以用于诊断急性缺血性脑卒中的13种上调micro RNA和9种 下调micro RNA都是现有技术中已知的micro RNA(具体信息见表2)，均可以通 过现有技术中已知的检测方法对其表达量进行检测。

[0062] 表2

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067] 在本发明中，术语“非编码RNA”(ncRNA)通常是指在细胞中不翻译成蛋白 质的内源性RNA分子。ncRNA的示例性类型包括转移RNA(tRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scRNA 和长ncRNA(诸如Xist和HOTAIR)。

[0068] 本文公开的方法、试剂盒和系统可包括特异性地检测、谱分析或量化生物样 品内的RNA。在一些情况下，可以从生物样品分离RNA(例如miRNA、ncRNA)。 在一些情况下，可以从无细胞来源分离RNA(例如miRNA、ncRNA)。

[0069] 通常通过检测衍生自miRNA或其他类型的ncRNA的cDNA水平来测量表达 谱。还可以在RNA水平上测量表达谱；例如，通过RNA杂交或直接RNA测序。

[0070] 在一些情况下，表达水平由所谓的“实时扩增”方法(也称为定量PCR(qPCR) 或Taqman)确定。该方法的基础是使用对待检测模板区域具有特异性的寡核苷酸 探针/寡核苷酸监测在使用模板的PCR反应期间形成的扩增产物的形成。在一些实 施方案中，在对分离的RNA(例如，miRNA、ncRNA)执行逆转录酶反应后立即 使用qPCR或Taqman，并且其可用于量化RNA的水平，和/或评估RNA(例如， miRNA、ncRNA)的差异表达水平。

[0071] 在其他方法中，通过测序，诸如通过RNA测序或通过DNA测序(例如，从 样品中的逆转录RNA、ncRNA或miRNA生成的cDNA的测序)确定表达水平。 测序也可以是一般性的(例如，使用部分/完全简并的寡核苷酸引物进行扩增)或 靶向性的(例如，使用针对待在后续步骤中进行分析的特定RNA(例如，miRNA、 ncRNA)的寡核苷酸引物进行扩增)。测序可通过任何可用的方法或技术进行。

[0072] 在其他方法中，通过基于杂交的方法，诸如Northern印迹、Southern印迹或 微阵列杂交来确定生物标志物RNA(例如，miRNA、ncRNA)的表达水平。

[0073] 本发明中采用的分子生物学方法，均可以参见“最新分子生物学实验方法汇编 (Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南 
(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中 记载的相应方法。

[0074] 实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获 得。

[0075] 实施例1：急性缺血性脑卒中病人及健康对照组的临床资料收集

[0076] 本研究纳入自2018年10月至2019年11月首都医科大学附属北京天坛医院 住院患者以及多中心的中国国家卒中登记研究‑Ⅲ(CNSR‑3)中的患者。急性缺血 性脑卒中患者入组标准：(1)发病年龄位于18‑80之间；(2)根据患者临床及影 像学资料明确诊断为急性脑梗死患者；(3)本次发病病因为大动脉粥样硬化性；(4)存在有症状的颅内或颅外动脉狭窄(动脉腔直径缩小≥50％)。纳入临床信 息包括：患者一般基本信息及临床特点，大动脉粥样硬化性高危因素(高血压、 糖尿病、冠心病、高血脂等)，急性期治疗方案。随访资料包括：
发病时、发病 后3月、6月、1年NIHSS及MRS评分，复发时间，血常规及生化指标，以及影 像学资料，临床终点疾病复发或死亡。

[0077] 实施例2：急性缺血性脑卒中病人及健康对照组的样本收集和储存

[0078] 1、血浆的收集

[0079] 将外周血收集于含抗凝剂EDTA或肝素的紫色管中，样本采集后30min内离 心，3000rpm 10min，2‑8℃。收集上层血浆，分批储存于‑80℃。样本避免反复冻 融。注意：样本应充分离心，避免溶血或颗粒存在。

[0080] 2、外周血浆中外泌体的提取

[0081] 采用血清和血浆的ExoQuick细胞外囊泡分离试剂盒(货号： EQULTRA‑20A‑1)进行。

[0082] 2.1提取

[0083] 1)取出样本，3000g，15min离心取上清。

[0084] 2)若仍有细胞碎片残留，将上清再次以位12，000g，10min离心，将上清转 移到新的离心管中。

[0085] 3)取得250ul样本加入67ul Exoquick，上下颠倒或轻弹混匀，静置30min。

[0086] 4)3000g，10min离心，室温或4℃均可，离心后管底部米色或白色沉淀为细 胞外囊泡(EVs)。

[0087] 5)小心弃掉上清，留取底部沉淀。

[0088] 6)加入200ul B液重悬，测量并且记录蛋白浓度。

[0089] 2.2纯化

[0090] 1)加入200ul A液重悬Evs。

[0091] 2)取出纯化柱，松开螺帽，去底部封盖，将纯化柱放入收集管中，1,000g,30s 离心除去储存液。

[0092] 3)取出液体后将柱子重新放入收集管中。

[0093] 4)取下盖子，加入500ul B液洗涤柱子，1000g，30s离心去掉液体，重复洗 涤一次。

[0094] 5)将底部封盖复位，加入100ul B液。

[0095] 6)将步骤1中的所有内容物后加入到柱子中，并将螺帽复位，在室温旋转摇 床旋转摇匀≤5min。

[0096] 2.3样品洗脱

[0097] 1)松开螺帽并卸掉底部封盖，立即转移至2mleppendorf管中。

[0098] 2)1000g，30seconds离心得到Evs，弃掉柱子。

[0099] 2.4外泌体定量

[0100] 1)NTA颗粒示踪(Nanosight)。

[0101] 2)TEM电镜观测形貌。

[0102] 3)Western blot检测外泌体特异性蛋白。

[0103] 3、外泌体RNA的提取

[0104] 1)向外泌体重悬液中加入700μL QIAzol，漩涡震荡10s，简短离心后在室温 下孵育5min。

[0105] 2)加入140μL氯仿/异戊醇(24：1)，剧烈上下颠倒15s，在室温下孵育2～3min。

[0106] 3)4℃下12,000×g离心8min。吸取上清到新的管中，加入两倍上清体积的无 水乙醇，混匀。

[0107] 4)将混合液全部过柱纯化。

[0108] 5)加入700μL RWT缓冲液洗一次，加入500μL RPE缓冲液洗两次，12,000×g 离心2min以甩干膜，弃去收集管。

[0109] 6)将纯化柱移至新的收集管，加入20μL RNA‑Free water。室温孵育1min， 12,000×g离心2min以洗脱RNA。得到约15μL洗脱产物。

[0110] 7)洗脱RNA样本采用Agilent 2100进行检测。

[0111] 实施例3：基因、蛋白组学技术分析，筛选出差异表达蛋白，得到复发、预后评估 生物标志物的检测组合

[0112] 1、本项目采用下一代非标记定量蛋白质组学技术完成分析，在数据非依赖型 采集(Dataindependentacquisition，DIA)模式下，它能够提供无与伦比的蛋白质 组覆盖，同时实现每个样本大量蛋白质的精确、高度可重复的定量。DIA流程提 供一个理想的差异表达蛋白质组定性分析或海量样品的蛋白质组定量平台。DIA 流程基于三个必要步骤：

[0113] 1)构建谱图库：谱图库收集了样本所有可检测的非冗余的高质量肽段信息 (MS/MS谱图)，作为后续数据分析的肽段鉴定模板。其中包含描述肽段谱峰特 性的碎片离子强度和保留时间。谱图库利用对感兴趣的样品进行 datadependentacquisition(DDA)检测采集的数据构建。

[0114] 2)DIA模式下获取大量样本数据：Dataindependentacquisition(DIA，又称 SWATH)模式利用最新的高分辨质谱实现在质量数和保留时间上同时采集肽段离 子特性。
与传统的提取单一离子进行碎裂分析的方法相比，DIA模式下质谱被设 定为宽母离子窗口循环采集并同时碎裂多种肽段离子的分析方式。实现了将样品 中所有可检测的蛋白质谱峰信息完整采集，从而能够高重复性的分析大量样本。

[0115] 3)数据分析，在基于DIA的发现式的蛋白质组研究中，如何更好地进行蛋 白质检测和定量目前依然是个巨大的挑战。采集肽段的信息虽然十分完整，但发 现高度卷积。在这一步，我们用Spectronaut进行有效地去卷积，从而对数据进行 精确地鉴定和定量分析。

[0116] 2、筛选出的差异表达蛋白和micro RNA结果如下(表3)：

[0117] 表3急性缺血性脑卒中蛋白组和microRNA组

[0118]

[0119]

[0120] 在AIS中，外周血浆蛋白和外泌体蛋白质组学鉴定出32种上调蛋白和30种 下调蛋白，其倍数变化>2，P<0.05；外泌体质谱分析表明，大多数失调的蛋白质 都参与免疫调节、血管功能和中枢神经系统衍生的损伤反应，特别是补体和凝血 信号明显下调；上调的蛋白质参与急性缺血性脑卒中后的急性反应和免疫激活； CD31与BBB破坏相关；即使在脑缺血后的早期阶段，神经重塑和恢复信号也可 能起作用(图1A)。外泌体micro RNA组学鉴定出13种上调micro RNA和9种 下调micro RNA，其倍数变化>2，P<0.05(图1B)。

[0121] 实施例4：筛选出的差异表达蛋白进行质谱定量验证

[0122] 我们应用质谱的多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)技术这一 高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，替代传统的免疫分析如ELISA，用于 大样本目标蛋白的验证。

[0123] 从验证的结果来看，急性缺血性脑卒中病人相较于正常人，其通过外周血浆 蛋白和外泌体蛋白的蛋白质组学鉴定得到的上调/下调蛋白，以及通过外泌体micro RNA组学鉴定出的上调/下调micro RNA，和实施例3中得到的结果相同。

[0124] 实施例5：筛选出的差异表达蛋白进行酶联免疫吸附测定

[0125] 我们应用具有高特异性、高灵敏度的酶联免疫吸附(ELISA)技术对上述目 标蛋白进行验证。

[0126] 从验证的结果来看，急性缺血性脑卒中患者血浆中SAA1、ITGAM、ALXO12 蛋白浓度显著高于健康对照血浆中蛋白浓度；急性缺血性脑卒中患者血浆中CSK 蛋白浓度显著低于健康对照血浆中蛋白浓度；

[0127] 急性缺血性脑卒中患者血浆外泌体中SAA1、LTF蛋白浓度显著高于健康对 照血浆外泌体中蛋白浓度；急性缺血性脑卒中患者血浆外泌体中COL1A2蛋白浓 度显著低于健康对照血浆外泌体中蛋白浓度，实施例3中得到的结果相同(图2)。

[0128] 其中SAA1与急性缺血性脑卒中患者外周血中hs‑CRP浓度成正相关，与急 性缺血性脑卒中患者NIHSS评分程正相关，起到促炎加重病情作用；LTF与急性 缺血性脑卒中患者NIHSS评分呈负相关，起到抗炎保护作用，两者可作为急性缺 血性脑卒中预后的生物标志物。ALOX12与急性缺血性脑卒中患者NIHSS评分程 正相关，与血小板聚集及黏附相关，可以作为急性缺血性脑卒中治疗靶点。ITGAM 与脑梗死后炎症相关，可作为急性缺血性脑卒中治疗靶点。

[0129] 急性缺血性脑卒中患者相较于正常健康对照血浆及血浆外泌体中ATP2A2, TAGLN2,ARPC4,TUBA8,ZYX,YWHAZ,PRDX5,Lectin,UBE2L3,F11R,SELP, APL6IP5,PARK7,
VCP,ENO1,MYL9,ESD,CD31,TPI1,CAPN1,APTB,PNP,CA3, GSTO1,FKBP,AK1,MMP9,MMP2,
GSTP1,UNC13D，BPIFB1，ARSA，SPINK5， HRNR，Gelsolin，BST1,GM2A，ADAMTS13，CALML5，SIRPA，AHSG，SELENOP， VTN，HPR，APOA4，PROS1，HBB，PON1，PRDX1，OLFM4，TUBA4A，FAC， HBD，HBA2，ABCB9，THBS4，FGC，Flotillin1，ECM1蛋白浓度并无显著变 化。

[0130] 实施例6：筛选出的差异表达microRNA进行RT‑qPCR验证

[0131] 我们应用具有高特异性、高灵敏度的RT‑qPCR技术对上述目标miRNA进行 验证。从验证的结果来看，急性缺血性脑卒中患者血浆外泌体中miR‑423‑3p相对 表达量显著高于健康对照血浆外泌体中的相对表达量，且具有显著性统计学意义； 可作为生物标志物监测急性缺血性脑卒中的发生，其监测效果良好。急性缺血性 脑卒中患者血浆外泌体中miR‑24‑3p相对表达量高于健康对照血浆外泌体中的相 对表达量，且具有显著性统计学意义；
可作为生物标志物监测急性缺血性脑卒中 的发生，其监测效果良好。实施例3中得到的结果相同(图3)。

[0132] 急性缺血性脑卒中患者相较于正常健康对照血浆及血浆外泌体中 hsa‑miR‑222‑3p，hsa‑miR‑21‑5p，hsa‑miR‑378a‑3p，hsa‑miR‑34a‑5p，hsa‑miR‑27a‑3p， hsa‑let‑7c‑
5p，hsa‑let‑7d‑5p，hsa‑miR‑10a‑5p，hsa‑miR‑126‑5p，hsa‑let‑7d‑3p， hsa‑miR‑10b‑5p，hsa‑miR‑151a‑5p，hsa‑miR‑532‑5p，hsa‑miR‑425‑5p， hsa‑miR‑486‑5p，hsa‑miR‑93‑5p，hsa‑miR‑1‑3p，hsa‑miR‑20a‑5p，hsa‑miR‑18a‑5p， hsa‑miR‑590‑3p含量无显著变化。

[0133] 以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本 发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文 中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例 中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本 文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。