一种等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法

摘要

本发明公开了一种等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法，包括以下步骤：S1、制备金纳米棒‑荧光分子混合液；S2、制备金纳米棒‑荧光分子薄膜；S3、组装声波振动检测纳米器件：附有金纳米棒‑荧光分子薄膜的石英晶体音叉；S4、设计模拟声波振动源；S5、激发收集分子荧光信号；S6、检测提取声波振动信号。本发明首次利用等离激元增强单分子荧光实现了在室温环境下对局域声波振动的探测，检测灵敏度可达10pm/Hz1/2，检测带宽可达40GHz，同时具备很高的时间与空间分辨能力，打破了背景技术的复杂性与局限性。

权利要求

1.一种等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备金纳米棒‑荧光分子混合液；

S2、制备金纳米棒‑荧光分子薄膜；

S3、组装声波振动检测纳米器件：附有金纳米棒‑荧光分子薄膜的石英晶体音叉；

S4、设计模拟声波振动源，利用信号发生器施加与音叉共振频率相同的频率，驱动音叉两电极产生周期性的振动，使得金纳米棒‑荧光分子的距离发生改变，导致金纳米棒对荧光分子的荧光增强程度改变，从而引起分子的荧光强度发生改变；

S5、激发收集分子荧光信号，采用荧光检测装置激发荧光分子产生荧光，并收集这种因金纳米棒‑荧光分子距离改变而引起的分子荧光强度变化；

S6、检测提取声波振动信号，根据S5中收集得到的荧光强度随时间变化数据，进行快速傅里叶变换，即提取到声波振动信号的频率与振幅；

其中，S1用PMMA/DMSO溶液分别稀释结晶紫/DMSO与金纳米棒/DMSO溶液，分别配制得到结晶紫溶液与金纳米棒溶液，然后将配制好的结晶紫溶液与金纳米棒溶液等体积比混合，得金纳米棒‑荧光分子混合液；

S2取金纳米棒‑荧光分子混合液旋涂于盖玻片上，然后在加热板上退火，制备得到均匀的固相薄膜；

S3取石英晶体音叉，将金纳米棒‑荧光分子薄膜从盖玻片上剥离，粘附于石英晶体音叉的两个电极上，得到附有薄膜的石英晶体音叉。

2.根据权利要求1所述的等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法，其特征在于：S5中，所述荧光检测装置包括激光器（1）、带通滤光片（2）、二向色镜（3）、空气物镜（4）、长通滤光片（5）、聚光透镜（6）、分束镜（7）、单光子计数器（8）及成像相机（9），所述激光器（1）产生激光，经过带通滤光片（2）由45°放置的二向色镜（3）反射至空气物镜（4），通过空气物镜（4）聚焦于样品薄膜上，激发产生荧光，分子荧光信号由该空气物镜反射回，透过二向色镜（3），经过长通滤光片（5）去除激光，经过聚光透镜（6），再由分束镜（7）分束至成像相机（9）和单光子计数器（8）收集。

说明书

一种等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及声波探测技术领域，尤其是涉及一种等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法。

背景技术

[0002] 机械波，尤其是声波由于可以在介质中高效地传播，因此在我们日常生活中扮演着十分重要角色，并且促进了许多先进技术的发展，例如：声纳、地震学与超声波医学成像。高灵敏与高空间分辨是声波振动信号检测的基础与核心。然而，目前报道的声学振动或位移检测技术，如微电机系统、纳电机系统、光镍技术、原子力显微镜纳米悬臂梁、纳米机械质谱、量子光机械器件与表面波共振腔等，尽管灵敏度可达飞米甚至阿米水平，但是这些技术的空间分辨率相对较低。除此之外，这些技术的检测带宽至多可达兆赫兹水平，且要么局限于超低温条件，要么实验装置复杂、要求极低的外界扰动，因此具有一定的局限性。因此，同时实现声波振动或者位移的高灵敏与高空间分检测是目前亟待解决的问题，有望应用于高分辨超声成像、材料缺陷的精准定位和声源的高灵敏追踪等领域。

发明内容

[0003] 发明目的：为了克服背景技术的不足，本发明公开了一种等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法，利用金纳米棒‑荧光分子纳米体系作为室温环境下声波振动检测的探针，并利用石英晶体音叉作为声波振动源，将金纳米棒‑荧光分子纳米体系耦1/2
合至石英晶体音叉，成功提取到声波振动的频率与振幅，得到了实验检测灵敏度10pm/Hz与检测带宽40GHz，成功实现了室温环境下局域声波振动的高灵敏与高空间分辨检测。

[0004] 技术方案：本发明公开的等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法，包括以下步骤：

[0005] S1、制备金纳米棒‑荧光分子混合液；

[0006] S2、制备金纳米棒‑荧光分子薄膜；

[0007] S3、组装声波振动检测纳米器件：附有金纳米棒‑荧光分子薄膜的石英晶体音叉；

[0008] S4、设计模拟声波振动源，利用信号发生器施加与音叉共振频率相同的频率，驱动音叉两电极产生周期性的振动，使得金纳米棒‑荧光分子的距离发生改变，导致金纳米棒对荧光分子的荧光增强程度改变，从而引起分子的荧光强度发生改变；

[0009] S5、激发收集分子荧光信号，采用荧光检测装置激发荧光分子产生荧光，并收集这种因金纳米棒‑荧光分子距离改变而引起的分子荧光强度变化；

[0010] S6、检测提取声波振动信号，根据S5中收集得到的荧光强度随时间变化数据，进行快速傅里叶变换，即提取到声波振动信号的频率与振幅。

[0011] 进一步的，S1用PMMA/DMSO溶液分别稀释结晶紫/DMSO与金纳米棒/DMSO溶液，分别配制得到结晶紫溶液与金纳米棒溶液，然后将配制好的结晶紫溶液与金纳米棒溶液等体积比混合，得金纳米棒‑荧光分子混合液。

[0012] 进一步的，S2取金纳米棒‑荧光分子混合液旋涂于盖玻片上，然后在加热板上退火，制备得到均匀的固相薄膜。

[0013] 进一步的，S3取石英晶体音叉，将金纳米棒‑荧光分子薄膜从盖玻片上剥离，粘附于石英晶体音叉的两个电极上，得到附有薄膜的石英晶体音叉。

[0014] 进一步的，S5中，所述荧光检测装置包括激光器、带通滤光片、二向色镜、空气物镜、长通滤光片、聚光透镜、分束镜、单光子计数器及成像相机，所述激光器产生激光，经过带通滤光片由45°放置的二向色镜反射至空气物镜，通过空气物镜聚焦于样品薄膜上，激发产生荧光，分子荧光信号由该空气物镜反射回，透过二向色镜，经过长通滤光片去除激光，经过聚光透镜，再由分束镜分束至成像相机和单光子计数器收集。

[0015] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点为：首次利用等离激元增强单分子荧光1/2
实现了在室温环境下对局域声波振动的探测，检测灵敏度可达10pm/Hz ，检测带宽可达
40GHz，同时具备很高的时间与空间分辨能力，打破了背景技术的复杂性与局限性。

附图说明

[0016] 图1为本发明金纳米棒等离激元增强单分子荧光检测室温下的局域声波振动/位移/应力平台；

[0017] 图2为结晶紫(CV)分子在系综平均与单分子水平上的光谱与荧光动力学表征图；

[0018] (a)为CV分子嵌入至PMMA薄膜的吸收与荧光光谱；(b)为CV分子嵌入至PMMA薄膜的荧光强度随光照时间变化的动力学曲线；图(c)为单个CV分子的总亮态时间的统计分布；图(d)为单个CV分子的总暗态时间的统计分布；虚点线表示633nm作为激发光源，插图是CV分子的化学结构；

[0019] 图3为单分子/金纳米棒声波振动检测体系的表征图；

[0020] (a)为金纳米棒的长度分布，插图为金纳米棒的形貌(SEM)表征；(b)为金纳米棒的宽度分布；(c)为金纳米棒的长径比分布；(d)为金纳米棒的吸收光谱，CV分子在PMMA薄膜的吸收与荧光光谱；虚点线表示633nm作为激发光源，虚线表示CV分子的荧光峰位；

[0021] 图4为声波振动的实验检测图；

[0022] (a)为实验检测器件的组装示意图，插图为附近金纳米棒增强的单个CV分子的荧光成像；(b)为单分子荧光强度追踪的快速傅里叶变换(FFT)，积分时间为200s，数据点大小为5μs，中心共振频率为32.715kHz；(c)为FFT幅值随驱动电压的变化，红色的虚线是对应于散点图的线性拟合；对于不同的驱动电压，单分子荧光强度始终保持在26,000counts/s，单个CV分子的尺寸大小为2nm；

[0023] 图5为音叉电极的振动位移随驱动电压变化的表征图；

[0024] (a)为音叉一端电极不施加驱动电压时的宽场透射成像；(b)为音叉一端电极施加15V驱动电压产生共振时的宽场透射成像；(c)为施加15V驱动电压时垂直于音叉一端电极边缘的横截面的振动位移大小；(d)为施加驱动电压在音叉共振频率下的音叉一端电极的振动位移随驱动电压的变化；红色实线对应于实验数据散点的线性拟合，拟合的斜率为
200nm/V；

[0025] 图6为不同积分时间下的FFT信号随数据点大小的变化图；

[0026] (a)为积分时间：1s；(b)为积分时间：0.1s；施加的驱动电压为1V，音叉的共振频率为32.715kHz。

具体实施方式

[0027] 下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的说明。

[0028] 一种等离激元增强单分子荧光体系探测局域声波振动的方法，包括以下步骤：

[0029] S1、制备金纳米棒‑荧光分子混合液；

[0030] 用PMMA/DMSO溶液分别稀释结晶紫/DMSO与金纳米棒/DMSO溶液，分别配制得到结晶紫溶液与金纳米棒溶液，然后将配制好的结晶紫溶液与金纳米棒溶液等体积比混合，得金纳米棒‑荧光分子混合液。

[0031] S2、制备金纳米棒‑荧光分子薄膜；

[0032] 取金纳米棒‑荧光分子混合液旋涂于盖玻片上，然后在加热板上退火，制备得到均匀的固相薄膜。

[0033] S3、组装声波振动检测纳米器件：附有金纳米棒‑荧光分子薄膜的石英晶体音叉；

[0034] 取石英晶体音叉，将金纳米棒‑荧光分子薄膜从盖玻片上剥离，粘附于石英晶体音叉的两个电极上，得到附有薄膜的石英晶体音叉。

[0035] S4、设计模拟声波振动源，利用信号发生器施加与音叉共振频率相同的频率，驱动音叉两电极产生周期性的振动，使得金纳米棒‑荧光分子的距离发生改变，导致金纳米棒对荧光分子的荧光增强程度改变，从而引起分子的荧光强度发生改变；

[0036] S5、激发收集分子荧光信号，采用荧光检测装置激发荧光分子产生荧光，并收集这种因金纳米棒‑荧光分子距离改变而引起的分子荧光强度变化；

[0037] 如图1所示，所述荧光检测装置包括激光器1、带通滤光片2、二向色镜3、空气物镜4、长通滤光片5、聚光透镜6、分束镜7、单光子计数器8及成像相机9，所述激光器1产生激光，经过带通滤光片2由45°放置的二向色镜3反射至空气物镜4，通过空气物镜4聚焦于样品薄膜上，激发产生荧光，分子荧光信号由该空气物镜反射回，透过二向色镜3，经过长通滤光片
5去除激光，经过聚光透镜6，再由分束镜7分束至成像相机9和单光子计数器8收集。

[0038] S6、检测提取声波振动信号，根据S5中收集得到的荧光强度随时间变化数据，进行快速傅里叶变换，即提取到声波振动信号的频率与振幅。

[0039] 聚二甲基亚砜(DMSO，分析纯)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，分子量：996,000g/mol)与结晶紫(CV)均购买于Sigma‑Aldrich公司；金纳米棒的DMSO溶液购买于北京中科雷鸣科技有限公司，平均尺寸为35±5nm×16±1nm。

[0040] 配制浓度为1.0×10‑5mol/L的CV/DMSO原液和40mg/mL PMMA/DMSO基质聚合物原液。利用40mg/mL PMMA将CV原液稀释100倍，以达到近似单分子浓度。利用40mg/mL PMMA将浓度为2.0×10‑10mol/L(0.1mg/mL)的金纳米棒原液稀释5倍。将稀释的CV溶液和金纳米棒溶液以体积比为1:1进行混合。

[0041] 取30μL上述准备好的混合溶液滴于盖玻片上，并以820rad/min的速度旋涂30s。然后在70℃的加热板上退火约25min以完全去除残留的溶剂。用注射器的针头将PMMA薄膜从盖玻片上剥离，然后用502胶将PMMA薄膜粘附与石英晶体音叉两个电极上，利用信号发生器施加与音叉共振相同频率来驱动音叉产生周期性振动，以此模拟声波振动源，然后利用单光子计数器收集光子。所有样品制备均在室温环境条件下进行。

[0042] 声波振动信号的光学检测是基于自搭建的宽场单分子荧光显微系统平台实现的，该平台具有很高的时间与空间分辨，可以同时实现荧光成像、动力学、光谱与寿命测量。

[0043] 在本次实验中采用的激发光源是633nm的半导体连续激光器

[0044] (MRL‑III‑633‑200mW，长春新产业光电技术有限公司)，激光经过激发纯色片(LL01‑633,Semrock)后通过空气物镜(Olympus LUCPlanFI 40×,NA＝0.6)聚焦到样品薄‑5 2膜的上表面，形成的激发区域面积为7.5×10 cm。分子的荧光信号也通过该物镜收集，通过655nm长通滤光片(ET655lp,Chroma)去除激光的散射信号后，经过分束镜(大恒光电，中国)后分别被EMCCD相机(Ultra 888,Andor)与单光子计数器(TCSPC,Picoharp 300)收集。
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633nm激发功率为50W/cm 和EMCCD曝光时间为100ms。实验中，使用信号发生器(DG4202,RIGOL)调制附有PMMA薄膜的音叉的驱动频率，并通过示波器(MDO3034,Tektronix)观测正弦函数的振幅变化来寻找音叉的共振频率。当音叉的调制频率处于其共振频率时，音叉会发生周期性的伸长与压缩，导致单个分子与单个金棒之间的距离发生周期性的改变。

[0045] (1)等离激元‑荧光分子纳米检测器的组装

[0046] 良好的光稳定性是荧光分子作为探针的前提条件，是得到室温下纳米尺度上的具有稳定、可靠和灵敏的微弱声波振动/位移/应力信号的基础与核心。申请人通过大量文献调研和不断尝试，发现结晶紫(CV)染料分子具有优异的光稳定性。如图2(a)所示，根据CV分子在PMMA薄膜的吸收与荧光光谱，选择633nm作为激发光源来研究CV分子的荧光动力学。如图2(b)所示，在室温条件下，申请人发现CV分子在PMMA薄膜的荧光强度随时间变化呈现增强效应，并且保持光持续激发10分钟不衰减，表明CV分子在PMMA薄膜中具有很好的光稳定性。除此之外，申请人也表征了单分子水平下的CV分子的光稳定性如图2(c‑d)所示，发现尽管有一部分分子的总亮态时间比较短(总暗态时间比较长)，但是仍有一部分分子能够保持10分钟一直发光而不发生漂白，也进一步说明光稳定性较好。因此，CV分子作为单分子是合适、可行的。

[0047] 单分子声波检测器是由单个CV分子靠近于单个金纳米棒构建得到的。如图3(a)插图所示，购买得到的金纳米棒的形貌是通过SEM表征的。如图3(a‑c)所示，它们的平均长度为35±5nm，宽度为16±1nm和长径比为2.2±0.4。除了CV分子在PMMA薄膜中具有很好的光稳定性之外，其在PMMA薄膜的绝对量子产率测得为0.5％，荧光强度可被等离激元显著增强。这是因为低的荧光量子产率的分子可以实现大的荧光增强效应，与背景形成鲜明的对比。因此，CV分子可作为理想的微弱声波振动信号检测的单分子荧光探针。如图3(d)所示，金纳米棒的吸收光谱(长轴共振峰640nm)和CV分子在PMMA薄膜的吸收与荧光光谱呈现显著的光谱重叠，可保证显著的荧光增强作用。至于金纳米棒吸收光谱中的520nm峰位，是来自于样品合成中的小部分金纳米球的贡献。本工作中采用633nm作为激发光源来激发单个金纳米棒的长轴共振峰，使得金纳米球对实验的影响最小化。在声波振动检测实验中，分子/金纳米棒体系被嵌入至PMMA介质薄膜，然后PMMA薄膜固定在石英晶体音叉的两个电极上(图4(a))。声波振动传播介质应具备适当的刚性以便很好地传播声波，而且介质容易被声波诱导发生周期性形变。除此之外，选择的介质应当对光透明，并且能够很好地从盖玻片基质中分离。因此，通过大量实验研究了不同的聚合物，主要包括PMMA、PS、PDMS和PVA，在测试中发现PMMA是最合适的声波传播介质。

[0048] (2)声波振动信号的表征与提取

[0049] 当信号发生器的驱动频率设置位于音叉的中心共振频率时，垂直于音叉两电极的PMMA薄膜便会发生周期性的压缩与伸长，导致CV分子与金纳米棒之间的距离发生周期性的改变，使得被金纳米棒增强的CV分子的荧光强度发生变化。实验中，选择具有高荧光强度的亮点进行声波检测，这是因为只有位于金纳米棒附近的分子才能被探测到。图4(a)展示了被金纳米棒显著增强的单个CV分子的荧光成像。当音叉在其共振频率驱动时，单个CV分子荧光强度通过时间相关单光子计数器采集得到，记录采集时间为200s。另外，由于低的荧光强度水平与小的数据点大小，因此对单分子荧光强度‑时间追踪曲线进行快速的傅里叶变换(FFT)得到了荧光强度变化信息如图4(b)所示。从图可以明显地观测到尖锐的FFT峰32.715kHz，对应于音叉的中心共振频率，而且此FFT峰随驱动电压呈线性变化趋势，如图4(c)所示。FFT振幅已经校准为pm单位，对应于分子与金纳米棒的距离变化。值得注意的是，此校准方法对不同的分子结果是不一样的。

[0050] (3)纳米检测器的实验检测灵敏度的计算

[0051] 实验上，通过估算可探测的最小振动幅值来表征和计算实验检测灵敏度。将不施加与施加15V的驱动电压的音叉成像于明场显微镜以此可视化音叉一端电极的形变，分别见如图5(a)和(b)所示。如图5(c)所示，音叉一端电极的位移可以直接表征出。当变换不同的驱动电压时，音叉电极的振动位移与驱动电压呈线性变化，如图5(d)所示，线性拟合的斜率为200nm/V。这样，根据可探测的最小振动幅值对应的驱动电压0.05V，可以计算得到振动位移的检测极限为10nm，那么PMMA薄膜相应地被音叉振动拉伸了20nm。根据音叉两电极的‑5间隙300μm，计算得到了PMMA的相对形变因子为7×10 。因此，当单个CV分子与单个金纳米
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棒的距离估算为10nm时，在200s的积分时间下的实验检测灵敏度为10pm/Hz 。特别地，每个分子的检测灵敏度都是不一样的，主要取决于分子‑金纳米棒之间的距离以及体系的取向。除此之外还估算了纳米检测器的声音分贝水平为‑90dB，比人耳灵敏度高出9个数量级。

[0052] (4)单分子纳米检测器的检测带宽

[0053] 检测带宽是纳米声波检测器的另一重要指标。由于单分子声波检测器是基于荧光强度的变化，而这种变化又是通过对荧光强度追踪进行傅里叶变化得到的，因此仪器的检测带宽主要受限于荧光强度追踪的时间分辨(数据点大小)。本工作中，荧光强度是通过具有4ps时间分辨率的时间相关单光子计数器(TCSPC,Picoquant)记录采集得到的。因此，4ps的数据点大小与尼奎斯特定律(每个振动周期至少6个数据点)决定了检测器的检测带宽约为40GHz。毫无疑问，数据点尺寸越小，数据容量越大，处理所消耗的时间与内存也越大。为了证明实验检测灵敏度并不会受数据点大小的影响，比较了相同的荧光强度追踪在不同的数据点大小处理时的FFT信号，如图6所示。当数据点尺寸大小降低至1ns(相应于0.2GHz的检测带宽)时，FFT信号的信噪比始终保持不变。因此，单分子声波纳米检测器的带宽可覆盖从DC至40GHz，并可以通过提高单光子计数器的时间分辨率来进一步提高仪器的检测带宽。