一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒及方法

摘要

本发明属于激素检测技术领域，涉及一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒及方法。针对现有技术中FT3和FT4检测时所需样本体积大、样品需要衍生化处理、检测耗时长、检测精确度不高，且操作复杂、特异性低、批间差异大、灵敏度低、动态范围窄的技术问题，本申请提供一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，包括超滤装置、缓冲液、FT3和FT4混合校准品、FT3和FT4混合质控品、FT3和FT4混合稳定同位素内标液，本方案操作简便、特异性高、批间差异小、灵敏度高、动态范围宽，可满足临床对FT3和FT4检测。本申请还提供了一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，无需衍生化处理，使检测步骤简化。

权利要求

1.一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，其特征在于：使用试剂盒，包括如下步骤：在血清标本中加入缓冲液，得血清标本缓冲液混合液；

使用超滤装置将所述血清标本缓冲液混合液中的FT3和FT4，与结合型三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素分离，得超滤液；

在所述超滤液中加入FT3和FT4混合稳定同位素内标液，离心，取上清液进行高效液相色谱串联质谱测定，得到FT3和FT4的含量；

所述试剂盒包括以下组分：超滤装置，缓冲液，FT3和FT4混合校准品，FT3和FT4混合质控品，FT3和FT4混合稳定同位素内标液；

所述超滤条件为：在100μL血清标本中加入100μL缓冲液，于25℃、1800g离心1h，得超滤液；取100μL所述超滤液，加入100μL所述FT3和FT4混合稳定同位素内标液，涡旋振荡3min；4℃、12000rpm离心10min；

所述高效液相色谱条件为：

所述流动相A：0.1％甲酸水溶液；

所述流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液；

色谱柱：反相色谱柱；柱温：30～60℃；流速：0.3～0.8mL/min；

所述质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测MRM模式。

2.根据权利要求1所述的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，其特征在于：所述FT3和FT4的含量计算方法为：以FT3和FT4混合校准品的浓度为横坐标，以FT3和FT4混合校准品与对应内标物测得峰面积的比值为纵坐标，建立校准曲线和回归方程；根据测得血清标本中FT3和FT4与内标物峰面积比值，代入线性回归方程，计算血清标本中FT3和FT4的浓度。

3.根据权利要求1所述的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，其特征在于：所述超滤装置的截留分子量≤50K。

4.根据权利要求1所述的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，其特征在于：所述缓冲液采用4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和氢氧化钠的缓冲体系。

5.根据权利要求4所述的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，其特征在于：所述缓冲体系还可添加氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、尿素、氯化钙中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，其特征在于：所述FT3和FT4混合校准品包括六个浓度梯度，FT3的浓度分别为40、20、10、4、2、1pg/mL，对应的FT4的浓度分别为160、80、40、16、8、4pg/mL；

所述FT3和FT4混合质控品包括两个浓度梯度，FT3的浓度为2或10pg/mL，对应的FT4的浓度为8或40pg/mL。

7.根据权利要求1所述的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，其特征在于：所述FT3

13 13 13

和FT4混合稳定同位素内标液中包含 C3‑FT3和 C3‑FT4，所述 C3‑FT3的浓度为5ng/mL，所

13

述 C3‑FT4的浓度为20ng/mL。

说明书

一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 甲状腺是一个内分泌腺体，分泌甲状腺激素，对机体产生广泛而强烈的生理作用。三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲状腺素(Thyroxine,T4)是两种主要的甲状腺激素，可以促进个体生长发育，增加机体基础代谢率，提高糖、脂肪、蛋白质的氧化分解，增大耗氧、增强产热效应，此外，甲状腺激素还对中枢神经系统、心血管系统、消化系统等具有重要的生理作用。血液中约10％的T3和T4来自甲状腺，其余约90％的T3是由T4在外周组织中脱碘代谢后产生。在血液循环中，T3和T4以结合态和游离态两种形式存在，其中，绝大部分可逆性的结合在血浆蛋白上(主要为甲状腺结合球蛋白(分子量约为54K)、甲状腺素结合前白蛋白(分子量约为55K)和白蛋白(分子量约为66K))，仅极微量的T3(约0.3％) 和T4(约0.03％)呈现游离状态。游离型T3(Free T3，FT3)和游离型T4(Free T4，FT4) 可以通过细胞膜进入靶组织细胞，与细胞内的受体结合，发挥其生物学作用，是甲状腺激素发生生理效应的真正活性部分，可以确切地反应人体真实的甲状腺功能状态，而且FT3和FT4 可以作用于垂体，反馈性地调节促甲状腺激素的分泌。而结合型的甲状腺激素没有生物学作用的。
此外，总T3和总T4的水平会随血浆蛋白的浓度或结合力的变化而发生改变，而FT3 和FT4的水平不受其影响，依然可以准确地反映机体甲状腺的功能状态。FT3和FT4分泌量的增加或减少均可导致甲状腺功能失调，引起内分泌代谢紊乱，因此，准确测定人体FT3和 FT4，对诊断治疗甲状腺疾病具有重要意义。

[0003] 目前，临床上多采用传统的放射免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光法测定血清中 FT3和FT4，如中国专利申请公布号CN110286237A，发明名称为“甲功五项化学发光检测试剂盒”，公开了一种甲功五项化学发光检测试剂盒，检测试剂盒包括包被的微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、校准品、发光底物液和清洗液；所述生物素标记物包括T4 抗原衍生物生物素标记物、T3抗原衍生物生物素标记物、TSH抗体生物素标记物、T4单克隆抗体生物素标记物和T3单克隆抗体生物素标记物；所述碱性磷酸酶标记物包括T4抗原衍生物碱性磷酸酶标记物、T3抗原衍生物碱性磷酸酶标记物、TSH配对抗体碱性磷酸酶标记物、 T4单克隆抗体碱性磷酸酶标记物和T3单克隆抗体碱性磷酸酶标记物；所述校准品包括总四碘甲状腺原氨酸校准品、总三碘甲状腺原氨酸校准品、TSH校准品、FT4校准品和FT3校准品，该方案能同时检测五项甲功指标。但操作复杂、特异性低、批间差异大、灵敏度低、动态范围窄，难以满足临床对FT3和FT4的检测要求。

[0004] 鉴于以上所述对血清中FT3和FT4提取、快速检测及检测精准和检测限更低的需求，需要一种操作简单方便、无需衍生化处理、样本前处理耗时短、所需样本体积小、灵敏度高、特异性好、准确度高的FT3和FT4检测方法。

发明内容

[0005] 1、要解决的问题

[0006] 针对现有技术中FT3和FT4检测时所需样本体积大、样品需要衍生化处理、检测耗时长、检测精确度不高，且操作复杂、特异性低、批间差异大、灵敏度低、动态范围窄的技术问题，本申请提供一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，包括超滤装置、缓冲液、FT3和FT4 混合校准品、FT3和FT4混合质控品、FT3和FT4混合稳定同位素内标液，本方案操作简便、特异性高、批间差异小、灵敏度高、动态范围宽，可满足临床对FT3和FT4检测。本申请还提供了一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、检测限低，使检测步骤简化。

[0007] 2、技术方案

[0008] 为达到上述目的，提供的技术方案为：

[0009] 本发明的一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：超滤装置，缓冲液，FT3和FT4混合校准品，FT3和FT4混合质控品，FT3和FT4混合稳定同位素内标液。

[0010] 进一步的，所述超滤装置的截留分子量≤50K。优选的，所述截留分子量为3K、5K、 10K或30K。当截留分子量为30K时，可以得到最短的超滤时间且可以最大限度避免结合蛋白质的漏出。

[0011] 进一步的，所述缓冲液采用4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和氢氧化钠的缓冲体系。

[0012] 进一步的，所述缓冲体系还可添加氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、尿素、氯化钙中的一种或几种。所选可添加的物质，可以进一步稳定血清样本pH值和离子强度，以提高超滤效果。

[0013] 进一步的，所述FT3和FT4混合校准品包括六个浓度梯度，FT3的浓度分别为40、20、 10、4、2、1pg/mL，对应的FT4的浓度分别为160、80、40、16、8、4pg/mL；

[0014] 所述FT3和FT4混合质控品包括两个浓度梯度，FT3的浓度为2或10pg/mL，对应的 FT4的浓度为8或40pg/mL。

[0015] 进一步的，所述FT3和FT4混合稳定同位素内标液中包含13C6‑FT3和13C6‑FT4，所述13 13
C6‑FT3的浓度为5ng/mL，所述 C6‑FT4的浓度为20ng/mL。

[0016] 一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，使用所述的试剂盒，包括如下步骤：

[0017] 在血清标本中加入缓冲液，得血清标本缓冲液混合液；

[0018] 使用超滤装置将所述血清标本缓冲液混合液中的FT3和FT4，与结合型三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素分离，得超滤液；

[0019] 在所述超滤液中加入FT3和FT4混合稳定同位素内标液，离心，取上清液进行高效液相色谱串联质谱测定，得到FT3和FT4的含量。

[0020] 进一步的，所述高效液相色谱条件为：

[0021]

[0022] 所述流动相A：0.1％甲酸水溶液；

[0023] 所述流动相B：含0.1％甲酸的甲醇溶液；

[0024] 色谱柱：反相色谱柱；柱温：30～60℃；流速：0.3～0.8mL/min；

[0025] 所述质谱条件为：

[0026]

[0027] 离子源：电喷雾离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测MRM模式。

[0028] 进一步的，所述FT3和FT4的含量计算方法为：

[0029] 以FT3和FT4混合校准品的浓度为横坐标，以FT3和FT4混合校准品与对应内标物测得峰面积的比值为纵坐标，建立校准曲线和回归方程；根据测得血清标本中FT3和FT4与内标物峰面积比值，代入线性回归方程，计算血清标本中FT3和FT4的浓度。

[0030] 3、有益效果

[0031] 采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：

[0032] (1)本发明的一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，样品不需要衍生化处理，所需的样品体积仅为100μL，使用超滤装置分离出游离的FT3和FT4，效率更好。前述步骤提取出的纯度高的FT3和FT4，经高效液相色谱串联质谱法分析，其特异性高，干扰低的特点可以来提高检测结果的灵敏度，从而使定量下限做的更低。本申请的试剂盒包括超滤装置、缓冲液、FT3和FT4混合校准品、FT3和FT4混合质控品、FT3和FT4混合稳定同位素内标液，本方案操作简便、特异性高、批间差异小、灵敏度高、动态范围宽，可满足临床对FT3 和FT4检测。

[0033] (2)本发明的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，采用一步超滤法将血中FT3和 FT4与结合型T3和T4分离，通过高效液相色谱串联质谱检测，计算血中FT3和FT4的浓度。相比现有技术，操作简单(一步处理)、特异性高、灵敏度好。可同时测定FT3和FT4，满足临床对血中FT3和FT4检测需求。本申请FT3和FT4的定量下限分别为1pg/mL和4pg/mL，其S/N≥10，CV≤20％，相对偏差在±20％之内。在线性范围内，FT3(1～40pg/mL)和FT4 (4～160pg/mL)的相关系数r≥0.99，最低点浓度校准品相对偏差在±20％之内，其余浓度点校准品的相对偏差在±15％之内。低值和高值混合质控品的日内和日间精密度CV≤15％。低值和高值混合质控品的日内和日间准确度(相对偏差)在±15％之间。低值和高值混合质控品的回收率在85～115％之间。

附图说明

[0034] 图1是FT3的校准曲线；

[0035] 图2是FT4的校准曲线；

[0036] 图3是校准品中典型的FT3和FT4 LC‑MS/MS色谱图。

具体实施方式

[0037] 为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。

[0038] 实施例1

[0039] 本实施例的一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，所述试剂盒包括以下组份：

[0040] 表1同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒的组份

[0041]

[0042]

[0043] 本实施例中，其中，组份1的超滤装置的截留分子量为50K。

[0044] 组份2缓冲液配制包含：12.570g 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和0.900g氢氧化钠，溶解于1L 的纯化水中，摇晃、超声混匀；取15mL上述缓冲液装入干净棕色玻璃瓶中，用封口膜封闭。

[0045] 组份3～8为不同浓度FT3和FT4混合校准品，用于绘制校准曲线，其中，FT3校准品浓度为40、20、10、4、2、1pg/mL，FT4的校准品浓度为160、80、40、16、8、4pg/mL。

[0046] 组份9和10为FT3和FT4的混合低值和高值质控品，其中，FT3质控品浓度为2、10 pg/mL，FT4质控品浓度为8、40pg/mL。

[0047] 组份11为FT3和FT4混合稳定同位素内标液，采用稳定同位素13C6‑FT3和13C6‑FT4为13 13
内标，其中，C6‑FT3的浓度5ng/mL，C6‑FT4的浓度为20ng/mL。

[0048] 组份12为试剂盒说明书。

[0049] 本实施例的试剂盒，仅需100μL血清样本即可达到同时检测FT3和FT4浓度的目的，仅采用一步超滤法即可准确测定血中极低浓度(约1～300pg/mL)的FT3和FT4含量，与现有检测FT3和FT4技术相比，本实施例的试剂盒操作简单、灵敏准确、可同时测定FT3和 FT4，可用于临床血中FT3和FT4的常规检测。

[0050] 实施例2

[0051] 本实施例的一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，基本同实施例1，所不同的是，组分2中添加氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、尿素、氯化钙。

[0052] 具体配制包含：12.570g 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、5.265g氯化钠、0.224g磷酸二氢钾、0.275 g七水硫酸镁、0.300g尿素、0.275g二水氯化钙，溶解于1L的纯化水中，摇晃、超声混匀；取15mL上述缓冲液装入干净棕色玻璃瓶中，用封口膜封闭。

[0053] 本实施例增加额外的组分，增强了缓冲液的pH缓冲能力和离子强度，使不同临床血清标本超滤效果的平行性较实施例1增加5～10％，即不同临床血清标本在使用本试剂盒可以得到更稳定和更好的一致性结果。

[0054] 实施例3

[0055] 本实施例的一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，超滤装置的截留分子量为3K。

[0056] 实施例4

[0057] 本实施例的一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，超滤装置的截留分子量为30K。

[0058] 本实施例与实施例2和实施例3相比，超滤装置的截留分子量为30K，超滤1h可以得到100μL的超滤液，满足后续标本处理的检测量需求。

[0059] 相对应的，实施例2的超滤装置的截留分子量为50K，仅需超滤45min即可得到100μL 超滤液，但按照后续样本处理方法处理超滤液，得到溶液中的FT3和FT4的浓度高于超滤装置截留分子量为3、5、10、30K的标本的浓度。即存在结合蛋白漏出的风险，这是由于超滤装置的截留分子量为50K与主要的甲状腺激素结合蛋白分子量相近，如甲状腺结合球蛋白 (分子量约为54K)、甲状腺素结合前白蛋白(分子量约为55K)，白蛋白(分子量约为 66K)，在操作不当或者超滤装置的批间差异时，容易发生结合蛋白漏出，导致超滤液中除含有FT3和FT4外，还存在小部分的结合型T3和结合型T4，最终导致FT3和FT4的浓度增加。

[0060] 相对应的，实施例3的超滤装置的截留分子量为3K，超滤1h仅得到40μL的超滤液，如需得到100μL超滤液，则需要延长超滤时间，此外随着超滤过程，3K超滤装置的超滤面被多肽、蛋白或其他颗粒覆盖面积和厚度越来越大，导致超滤效率越来越低，甚至无法超滤出超滤液。

[0061] 因此，当截留分子量为30K时，可以得到最短的超滤时间且可以最大限度避免结合蛋白质的漏出。

[0062] 实施例5

[0063] 本实施例的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，使用实施例1～实施例4的试剂盒，包括如下步骤：

[0064] 1.样本前处理：

[0065] 1.1.上样：分别在100μL血清标本、100μL FT3和FT4混合校准品、100μL FT3和FT4 混合质控品中加入100μL缓冲液，静置5min，将上述液体加到超滤装置中。

[0066] 1.2.超滤：于25℃、1800g离心1h，得超滤液。

[0067] 1.3.加内标：取100μL超滤液，加入100μL内标液。

[0068] 1.4.混匀：涡旋振荡3min。

[0069] 1.5.离心：4℃、12000rpm离心10min。

[0070] 1.6.检测：取150μL上清液于96孔进样板或进样小瓶，进行液相色谱串联质谱分析。

[0071] 2.高效液相色谱串联质谱检测：

[0072] 2.1.高效液相色谱条件:

[0073] 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)。

[0074] 柱温：30℃。

[0075] 流速：0.3mL/min。

[0076] 流动相A(水相)：0.1％甲酸水溶液。

[0077] 流动相B(有机相)：0.1％甲酸的甲醇溶液。

[0078] 采用梯度洗脱，梯度如下表：

[0079] 表2高效液相色谱参数

[0080]

[0081] 2.2质谱条件：

[0082] 离子源参数：正离子模式，毛细管电压：5500V，离子源温度：550℃，离子源雾化气： 50psi，离子源加热辅助器：50psi，气帘气：30psi

[0083] 扫描模式：多反应监测。

[0084] 具体参数如下表：

[0085] 表3质谱参数

[0086]

[0087] 注：*为定量离子。

[0088] 3.内标法计算：

[0089] 采用内标法定量，以系列混合校准品中FT3和FT4的浓度为横坐标(x)，以校准品与对应内标物测得峰面积的比值为纵坐标(y)，建立校准曲线和回归方程；根据测得血清标本中FT3和FT4与内标物峰面积比值，代入线性回归方程，计算血清标本中FT3和FT4的浓度。

[0090] 本实施例的方法检测结果如下：

[0091] 1.定量下限：FT3和FT4的定量下限分别为1pg/mL和4pg/mL，其S/N≥10，CV≤20％，相对偏差在±20％之内。

[0092] 2.校准曲线：在线性范围内，FT3(1～40pg/mL)和FT4(4～160pg/mL)的相关系数r≥0.99，最低点浓度校准品相对偏差在±20％之内，其余浓度点校准品的相对偏差在±15％之内。

[0093] 3.精密度试验：低值和高值混合质控品的日内和日间精密度CV≤15％。

[0094] 4.准确度：低值和高值混合质控品的日内和日间准确度(相对偏差)在±15％之间。

[0095] 5.加样回收率：低值和高值混合质控品的回收率在85～115％之间。

[0096] 实施例6

[0097] 本实施例的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，基本同实施例5，所不同的是，色谱条件中，柱温：60℃；流速：0.8mL/min。

[0098] 实施例7

[0099] 本实施例的一种同时测定血液中FT3和FT4的方法，基本同实施例5，所不同的是，色谱条件中，柱温：50℃；流速：0.4mL/min。

[0100] 本实施例与实施例5和实施例6相比，柱温为50℃、流速为0.4mL/min，以实施例4的试剂盒为例，得到FT3和FT4的保留时间分别为2.4min和2.5min，校准曲线如图1和2所示，LC‑MS/MS色谱图如图3所示。

[0101] 相对应的，实施例5的柱温为30℃，流速为0.3mL/min，可以得到类似实施例7的结果，但是FT3和FT4的保留时间延长0.8min，即相当于每一个标本的分析时间增加0.8min。即相对于实施例5，实施例7每天理论上可以增加额外的60个血清标本测试。

[0102] 相对应的，实施例6的柱温为60℃，流速为0.8mL/min，可以得到类似实施例7的结果，但是FT3和FT4的保留时间缩短1.3min，分析时间缩短导致通量增加。但是，因增加流速导致柱压增加明显，严重减少柱寿命，同时较短的出峰时间，会使更多的共流出物干扰FT3和 FT4的检测。即，相对于实施例6，实施例7可以得到更佳的色谱柱使用寿命，以及更少的检测干扰，进而得到更准确的测定结果。

[0103] 以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。