细胞组织样品的低温保护剂加载设备及方法

摘要

本发明公开了一种细胞组织样品的低温保护剂加载装置及方法，包括外壳，所述外壳的内部通过隔板分隔成样品加载腔和安装腔；所述外壳的其中一侧有密封门、总开关、温湿度控制面板和压力控制面板，外壳的另一侧与加湿组件连接，外壳的顶部设置有储存箱，所述储存箱上设置有控制按钮以及样品添加孔，外壳上还设置有多个散热孔。同时本发明还提供了一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载方法，将含有低温保护剂的细胞组织样品的液滴置于不同环境条件下，使含有细胞组织样品低温保护剂的液滴通过水分蒸发的方式实现低温保护剂浓度的梯度加载。

权利要求

1.一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载的设备，其特征在于，包括外壳，所述外壳的内部通过隔板分隔成样品加载腔(4)和安装腔；

所述外壳的其中一侧有密封门、总开关(15)、温湿度控制面板(16)和压力控制面板(17)，外壳的另一侧与加湿组件连接，外壳的顶部设置有储存箱(8)，所述储存箱(8)上设置有控制按钮(18)以及用于加入细胞组织样品的孔样品添加孔(20)，外壳上还设置有多个散热孔(19)；

所述加湿组件包括加湿瓶(3)，所述加湿瓶(3)的内部设置有超声雾化装置，加湿瓶(3)的顶部与加湿管的一端连接，加湿管的另一端贯穿外壳和保温层(11)延伸至样品加载腔(4)的内部；

所述样品加载腔(4)的内壁上设置有保温层(11)，所述保温层(11)上设置有压力传感器(6)和温湿度传感器(7)，保温层(11)靠近密封门的一侧还设置有密封圈(12)和视窗(13)，样品加载腔(4)的内部还设置有滑轨(10)，所述滑轨(10)的两端均与保温层(11)固定连接，滑轨(10)上设置有液滴产生器(9)，所述液滴产生器(9)的顶部与液滴管的一端连接，所述液滴管贯穿保温层(11)和外壳与储存箱(8)连接；

所述安装腔内设置有数据控制面板(5)，真空泵(1)和压缩机(2)，所述数据控制面板(5)与压力传感器(6)以及温湿度传感器(7)电性连接，所述真空泵(1)的输出端与真空连接管的一端连接，真空连接管的另一端贯穿隔板和保温层(11)延伸至样品加载腔(4)的内部，所述压缩机(2)的输出端与压缩连接管的一端连接，压缩连接管的另一端贯穿隔板和保温层(11)延伸至样品加载腔(4)的内部。

2.一种基于权利要求1所述的用于细胞组织样品的低温保护剂加载的设备的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:将含有细胞组织样品的低温保护剂溶液加入储存箱(8)中；

S2:启动压缩机(2)，使样品加载腔(4)的温度降低到预定值，接着启动超声雾化装置，使样品加载腔(4)内的湿度达到预定值，将含有细胞组织样品的低温保护剂液滴添加到样品加载腔(4)内放置的铝板(14)上；

S3:启动真空泵(1)，将样品加载腔(4)内的空气抽出，使样品加载腔(4)内到达所需要的压力，并设定时间，在低温、真空的环境中能够促进低温保护剂滴液的蒸发，进而提高低温保护剂的浓度，能够快速有效的完成细胞组织样品低温保护剂的加载，缩短低温保护剂的加载时间，降低低温保护剂加载过程中对细胞组织样品的毒性损伤，从而提高细胞的存活率；

S4:等待时间结束，然后将细胞组织样品取出放置在液氮内进行低温保存。

说明书

细胞组织样品的低温保护剂加载设备及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及低温生物医学技术领域，尤其涉及到细胞组织样品的低温保护剂加载设备及方法。

背景技术

[0002] 细胞组织样品的低温保存是指将细胞组织样品放置于低温条件下,并长期保存。细胞组织样品的低温保存被广泛应用于生殖医学、器官储运、细胞治疗、样本库建设等领域。对于经典的低温保存方法主要包括五个步骤:低温保护剂加载过程、降温过程、长期保存过程、复温过程、低温保护剂去除过程。除了极简单的微生物、病毒和细菌等外,一般而言低温保护剂的加载是必需的。

[0003] 低温保护剂虽能在低温下对细胞组织样品起保护作用,但低温保护剂对细胞组织样品来说是外来物质,对其有一定的毒性。这种毒性与低温保护剂的种类、浓度、处理温度和时间等因素密切相关,浓度越大、处理温度越高、处理时间越长,则毒性损伤越严重。因此在低温保护剂加载过程中,为了使细胞组织样品能够达到玻璃化，并且减小低温保护剂对细胞组织样品的损伤，通常在低温条件下采用不同浓度的低温保护剂对细胞组织样品进行梯度加载。传统的低温保护剂加载方法需要将不同浓度梯度低温保护剂对细胞组织样品依次加载，加载过程耗时长、步骤繁琐；同时高浓度低温保护剂加载时间过长会对细胞造成较大损伤；对于组织样品，低温保护剂渗透进入样本内部的速度太慢，从而导致处理时间太长，而时间的增长同时会增加低温保护剂对细胞组织样品的毒性损伤。

[0004] 因此简化低温保护剂加载操作步骤，缩短低温保护剂的加载时间，并且降低低温保护剂加载过程中对细胞组织样品的毒性损伤对于低温保存过程至关重要。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供细胞组织样品的低温保护剂加载设备及方法，用于解决传统的低温保护剂加载方法需要将不同浓度梯度低温保护剂对细胞组织样品依次加载，加载过程耗时长、步骤繁琐；同时高浓度低温保护剂加载时间过长会对细胞造成较大损伤；对于组织样品，低温保护剂渗透进入样本内部的速度太慢，从而导致处理时间太长，而时间的增长同时会增加低温保护剂对细胞组织样品的毒性损伤的问题。

[0006] 本发明的上述技术目的是用过以下技术方案实现的：

[0007] 一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载设备的控制系统，包括：

[0008] PLC控制器、制冷系统、负压系统、加湿系统、滴液产生系统、温湿度传感系统和压力传感系统；

[0009] 所述PLC控制器与所述制冷系统、负压系统、加湿系统、滴液产生系统、温湿度传感系统和压力传感系统电性连接，用于温湿度传感系统和压力传感系统发出的检查信号，并对制冷系统、负压系统、加湿系统和滴液产生系统发出控制信号；

[0010] 所述制冷系统用于改变加载装置内部的温度；

[0011] 所述负压系统用于改变加载装置内部的压力；

[0012] 所述加湿系统用于改变加载装置内部的湿度；

[0013] 所述滴液产生系统用于添加含有细胞组织样品的低温保护剂滴液；

[0014] 所述温湿度传感系统用于检测加载装置内部的温湿度，并发送检测信号至PLC控制器；

[0015] 所述压力传感系统用于检测加载装置内部的压力，并发送检测信号至PLC控制器。

[0016] 一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载的设备，包括外壳，所述外壳的内部通过隔板分隔成样品加载腔和安装腔；

[0017] 所述外壳的其中一侧有密封门、总开关、温湿度控制面板和压力控制面板，外壳的另一侧与加湿组件连接，外壳的顶部设置有储存箱，所述储存箱上设置有控制按钮以及样品添加孔，外壳上还设置有多个散热孔；

[0018] 所述加湿组件包括加湿瓶，所述加湿瓶的内部设置有超声雾化装置，加湿瓶的顶部与加湿管的一端连接，加湿管的另一端贯穿外壳和保温层延伸至样品加载腔的内部；

[0019] 所述样品加载腔的内壁上设置有保温层，所述保温层上设置有压力传感器和温湿度传感器，保温层靠近密封门的一侧还设置有密封圈和视窗，样品加载腔的内部还设置有滑轨，所述滑轨的两端均与保温层固定连接，滑轨上设置有液滴产生器，所述液滴产生器的顶部与液滴管的一端连接，所述液滴管贯穿保温层和外壳与储存箱连接；

[0020] 所述安装腔内设置有数据控制面板，真空泵和压缩机，所述数据控制面板与压力传感器以及温湿度传感器电性连接，所述真空泵的输出端与真空连接管的一端连接，真空连接管的另一端贯穿隔板和保温层延伸至样品加载腔的内部，所述压缩机的输出端与压缩连接管的一端连接，压缩连接管的另一端贯穿隔板和保温层延伸至样品加载腔的内部；

[0021] 一种基于用于细胞组织样品的低温保护剂加载的设备的方法，包括以下步骤：

[0022] S1:将含有细胞组织样品的低温保护剂溶液加入储存箱中；

[0023] S2:启动压缩机，使样品加载腔的温度降低到预定值，接着启动超声雾化装置，使样品加载腔内的湿度达到预定值，将含有细胞组织样品的低温保护剂液滴添加到样品加载腔内放置的铝板上；

[0024] S3:启动真空泵，将样品加载腔内的空气抽出，使样品加载腔内到达所需要的压力，并设定时间；通过水分蒸发的方式提高低温保护剂的浓度，快速有效的完成细胞组织样品低温保护剂的浓度连续加载，通过低温负压条件缩短低温保护剂的加载时间，降低低温保护剂加载过程中对细胞组织样品的毒性损伤，从而提高细胞的存活率；

[0025] S4:等待时间结束，然后将细胞组织样品取出放置在液氮内进行低温保存。

[0026] 本发明的进一步设置为：通过设置样品加载腔内的温度、湿度、压力等条件来促进含低温保护剂的液滴内水分蒸发进而使液滴内部低温保护剂的浓度逐渐增加，以实现低温保护剂浓度的连续加载的目的。

[0027] 本发明的进一步设置为：可以通过改变样品加载腔内的压力、温度控制低温保护剂的加载速度。

[0028] 本发明的进一步设置为：采用不同体积低温保护剂液滴。

[0029] 本发明的进一步设置为：采用蒸发方式增加滴液内部浓度。

[0030] 综上所述，本发明具有以下有益效果：

[0031] 1、本发明所述用于细胞组织样品的低温保护剂加载的控制系统集合了制冷系统，负压系统，加湿系统以及控制系统，可同时产生低温干燥负压的条件；并且可以实现低温保护剂液滴的自动产生，对于细胞组织样品的处理具有较高自动化。

[0032] 2、本发明提供的方法通过设置样品加载腔内的温度、湿度、压力等条件来促进含低温保护剂的液滴内水分蒸发、进而使液滴内部低温保护剂的浓度逐渐增加，以此替代传统的低温保护剂浓度梯度加载；并且可以通过负压进一步加快低温保护剂的加载。

[0033] 3、通过改变样品加载腔内压力、温度、湿度控制低温保护剂的加载速度，同时，降低低温保护剂对细胞组织样品的毒性。

[0034] 4、采用不同体积低温保护剂液滴，可适用于不同尺寸细胞组织样品加载过程。

[0035] 5、采用蒸发方式增加液滴内部浓度可简化细胞组织样品的低温保护剂加载过程。

[0036] 6、集合制冷系统、加湿系统、负压系统、液滴产生系统共同调节样品加载腔内环境条件，并实现在样品加载腔内自动添加含有细胞组织样品的低温保护剂液滴。

[0037] 7、设置有保温层，能够维持样品加载腔内的温度。

附图说明

[0038] 图1是本发明所述用于细胞组织样品的低温保护剂加载设备的侧剖视图。

[0039] 图2是本发明所述用于细胞组织样品的低温保护剂加载设备的正视图。

[0040] 图3是本发明所述用于细胞组织样品的低温保护剂加载设备的俯视图。

[0041] 图4是本发明所述进行低温保护剂加载的铝板的结构示意图。

[0042] 图5是本发明所述用于细胞组织样品低温保护剂加载设备的控制系统框图。

[0043] 图6为本发明实施例1中，实施例与比较例和新鲜组的细胞存活率的柱状图。

[0044] 图7为本发明实施例1中，实施例与比较例培养48h后，细胞活力的柱状图。

[0045] 图8为本发明实施例2中，实施例与比较例和新鲜组的细胞存活率的柱状图。

[0046] 图9为本发明实施例2中，实施例与比较例培养48h后，细胞活力的柱状图。

[0047] 图10为本发明实施例1‑2中，各个实施例加载过程中低温保护剂液滴的体积变化情况的折线图。

[0048] 图11为本发明实施例1‑2中，各个实施例低温保护剂加载过程中低温保护剂液滴的浓度变化情况的折线图。

[0049] 图中标号：1‑真空泵2‑压缩机3‑加湿瓶4‑样品加载腔5‑数据控制面板6‑压力传感器7‑温湿度传感器8‑储存箱9‑液滴产生器10‑滑轨11‑保温层12‑密封圈13‑视窗14‑铝板15‑总开关16‑温湿度控制面板17‑压力控制面板18‑控制按钮19‑散热孔20‑样品添加孔具体实施方式

[0050] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合图示与具体实施例，进一步阐述本发明。

[0051] 如图1至图3所示，本发明提出的一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载设备的控制系统包括：

[0052] 一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载设备的控制系统，包括： PLC控制器、制冷系统、负压系统、加湿系统、滴液产生系统、温湿度传感系统和压力传感系统所述PLC控制器与所述制冷系统、负压系统、加湿系统、滴液产生系统、温湿度传感系统和压力传感系统电性连接，用于温湿度传感系统和压力传感系统发出的检查信号，并对制冷系统、负压系统、加湿系统和滴液产生系统发出控制信号；所述制冷系统用于改变加载装置内部的温度；所述负压系统用于改变加载装置内部的压力；所述加湿系统用于改变加载装置内部的湿度；所述滴液产生系统用于添加含有细胞组织样品的低温保护剂滴液；所述温湿度传感系统用于检测加载装置内部的温湿度，并发送检测信号至PLC控制器；所述压力传感系统用于检测加载装置内部的压力，并发送检测信号至PLC控制器。

[0053] 一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载设备，包括外壳，所述外壳的内部通过隔板分隔成样品加载腔4和安装腔；

[0054] 所述外壳的其中一侧有密封门、总开关15、温湿度控制面板16和压力控制面板17，外壳的另一侧与加湿组件连接，用于改变装置内的湿度，外壳的顶部设置有储存箱8，所述储存箱8上设置有控制按钮18以及样品添加孔20，通过控制按钮18控制滴液的开关，样品添加孔20用于加入细胞组织样品，外壳上还设置有多个散热孔19，散热孔19用于装置内部的散热，以及气体的交换；

[0055] 所述加湿组件包括加湿瓶3，所述加湿瓶3的内部设置有超声雾化装置，加湿瓶3的顶部与加湿管的一端连接，加湿管3的另一端贯穿外壳和保温层11延伸至样品加载腔4的内部；

[0056] 所述样品加载腔4的内壁上设置有保温层11，所述保温层11上设置有压力传感器6和温湿度传感器7，保温层11靠近密封门的一侧还设置有密封圈12和视窗13，样品加载腔4的内部还设置有滑轨10，所述滑轨10的两端均与保温层11固定连接，滑轨10上设置有液滴产生器9，所述液滴产生器9的顶部与液滴管的一端连接，所述液滴管贯穿保温层11和外壳与储存箱8连接；

[0057] 所述安装腔内设置有数据控制面板5，真空泵1和压缩机2，所述数据控制面板5与压力传感器6以及温湿度传感器7电性连接，所述真空泵1的输出端与真空连接管的一端连接，真空连接管的另一端贯穿隔板和保温层11延伸至样品加载腔4的内部，真空连接管上设置有阀门，所述压缩机3的输出端与压缩连接管的一端连接，压缩连接管的另一端贯穿隔板和保温层11延伸至样品加载腔4的内部。

[0058] 在本发明的一些实施例中，

[0059] 所述的保温层11的材料为发泡苯乙烯，该材料具有较好的保温效果，而且可以循环利用。

[0060] 如图4所示所述的铝板为带有凹槽的铝板14，该铝板14可以将低温保护剂加载完成后的细胞组织样品，直接通过铝箔密封投入液氮。

[0061] 本发明还提出一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载方法：将含有低温保护剂的细胞组织样品的液滴置于不同环境条件下，使含有细胞组织样品低温保护剂的液滴通过水分蒸发的方式实现低温保护剂浓度的连续加载。包括以下步骤：

[0062] S1:将含有细胞组织样品的低温保护剂溶液加入储存箱8中；

[0063] S2:启动压缩机，使样品加载腔4的温度降低到预定值，接着启动超声雾化装置，使样品加载腔4内的湿度达到预定值，将含有细胞组织样品的低温保护剂液滴添加到样品加载腔4内放置的铝板14上；

[0064] S3:启动真空泵1，将样品加载腔4内的空气抽出，使样品加载腔4内到达所需要的压力，并设定时间；通过水分蒸发的方式提高低温保护剂的浓度，快速有效的完成细胞组织样品低温保护剂的浓度连续加载，通过低温负压条件缩短低温保护剂的加载时间，降低低温保护剂加载过程中对细胞组织样品的毒性损伤，从而提高细胞的存活率；

[0065] S4:等待时间结束，然后将细胞组织样品取出放置在液氮内进行低温保存。

[0066] 在一些实施例中，具体的操作步骤为：

[0067] 设定好装置的温度与湿度，待样品加载腔内温度和湿度达到稳定，关闭加湿装置阀门保持样品加载腔4密封；

[0068] 将含有细胞组织样品的低温保护剂加入液滴产生系统，通过液滴产生系统添加在样品加载腔4中的铝板14上，所述的低温保护剂原则上浓度较低（如常用的10%DMSO）；

[0069] 设置负压条件，启动负压装置，待样品加载腔4内达到所需的稳定条件，关闭负压装置；

[0070] 等待预定的处理时间结束，对样品加载腔4进行泄压，取出细胞组织样品，即可进行低温保存处理。

[0071] 为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的一种细胞组织样品冻存装置及方法进行具体地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0072] 实施例1

[0073] 一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载方法，包括如下步骤：

[0074] 1）将样品加载腔内温度条件设置为4℃，湿度条件设置为30%，待样品加载腔内温湿度条件达到设定值，并且稳定，关闭加湿系统，维持样品加载腔密封；

[0075] 2）选用细胞组织样品类型为：肺癌细胞（A549） ，保护剂类型为：10%DMSO+0.2mol海藻糖，将肺癌细胞（A549）与低温保护剂溶液混合；

[0076] 3）将含有肺癌细胞（A549）的低温保护剂溶液添加至铝板，液滴体积设置为1ul，置于样品加载腔内；

[0077] 4）设定压力条件为常压，加载时间为15分钟；

[0078] 5）加载时间结束后取出样品，浸入液氮，进行低温保存；

[0079] 6）待保存一段时间，取出冻存装置，放入37℃水浴锅进行水浴复温；

[0080] 7）去除样品中的低温保护剂，加入荧光染色试剂；

[0081] 8）在荧光显微镜下，统计细胞样品的存活率并与新鲜组，以及不用此方法（直接用10%DMSO+0.2mol海藻糖处理并冻存）的比较例1对比，如图6所示；

[0082] 9）将部分样品放入培养箱中继续培养48h，加入cck‑8溶液孵育处理1‑4h，用酶标仪检测吸光度；

[0083] 10）统计细胞样品的细胞活力并与不用此方法（直接用10%DMSO+0.2mol海藻糖处理并冻存）的比较例1做对比，如图7所示；

[0084] 本实施例中保护剂液滴体积和浓度的变化过程如图10和图11所示。

[0085] 实施例2

[0086] 由于常压下的加载速度较慢，细胞组织样品仍会受到较大的毒性损伤，为了加快加载速度，便采用负压的条件进行加载，并且为了验证不同保护剂的加载效果，因此只选用10%DMSO在负压条件下进行加载，包括如下步骤：

[0087] 1）将样品加载腔内温度条件设置为4℃，湿度条件设置为30%，待样品加载腔内温湿度条件达到设定值，并且稳定，关闭加湿系统，维持样品加载腔密封；

[0088] 2）选用细胞组织样品类型为：肺癌细胞（A549），保护剂类型为：10%DMSO，将肺癌细胞（A549）与低温保护剂溶液混合；

[0089] 3）将含有肺癌细胞（A549）的低温保护剂溶液添加至铝板，液滴体积设置为1ul，置于样品加载腔内；

[0090] 4）设定压力条件为‑0.09Mpa，加载时间为5分钟；

[0091] 5）加载时间结束后取出样品，浸入液氮，进行低温保存；

[0092] 6）待保存一段时间，取出冻存装置，放入37℃水浴锅进行水浴复温；

[0093] 7）去除样品中的低温保护剂，加入荧光染色试剂；

[0094] 8）在荧光显微镜下，统计细胞组织样品的存活率并与新鲜组，以及不用此方法（直接用10%DMSO处理并冻存）的比较例2对比，如图8所示；

[0095] 9）将部分样品放入培养箱中继续培养48h，加入cck‑8溶液孵育处理1‑4h，用酶标仪检测吸光度；

[0096] 10）统计细胞样品的细胞活力并与不用此方法（直接用10%DMSO处理并冻存）的比较例2对比，如图9所示；

[0097] 本实施例中保护剂液滴体积和浓度的变化过程如图10和图11所示。

[0098] 本发明的原理如下：本发明实施的一种用于细胞组织样品的低温保护剂加载方法，明显提高了细胞组织样品的保存效果。并且通过改变环境条件，可以更加快速有效地完成细胞组织样品低温保护剂的加载。

[0099] 在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，或者是本领域技术人员惯常理解的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，“设置”、“连接”等术语应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接连接，也可以通过中间媒介间接连接，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，除了包含所列的那些要素，而且还可包含没有明确列出的其他要素。

[0100] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。