一种快速检测螺原体的通用引物、试剂盒及方法和应用转让专利
申请号 : CN202111261781.6
文献号 : CN114032315B
文献日 : 2022-07-22
发明人 : 刘晓萍 , 徐国东 , 臧照星 , 王敏
申请人 : 武汉珈创生物技术股份有限公司
摘要 :
本发明属于生物技术领域，具体提供了一种快速检测螺原体的通用引物、试剂盒及方法和应用。本发明提供的这种快速检测螺原体的通用引物基于34种螺原体16S rDNA标准序列的保守区及2种克隆常用大肠杆菌16SrDNA标准序列的变异区而设计，具有广谱性，且能特异识别昆虫细胞及其生物制品中的螺原体而不受大肠杆菌的干扰；采用本申请提供的快速检测螺原体的方法，只需提取昆虫细胞或生物制品DNA即可检测是否存在螺原体的污染，灵敏度为100拷贝，具有用时短、操作简单、灵敏度高、特异性好的优势。
权利要求 :
1.一种快速检测螺原体的通用引物，其特征在于，所述通用引物的正向引物序列为：ATGCACCACCTGTCTCAATG；反向引物序列：ACTCCGCCTGAGTAGTATGC。
2.如权利要求1所述的快速检测螺原体的通用引物在昆虫细胞基质和生物制品螺原体检测中的应用。
3.一种快速检测螺原体的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的通用引物。
4.一种快速检测螺原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品基因组DNA，以待测样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的快速检测螺原体的通用引物进行qPCR反应；
(2)构建螺原体的标准品质粒；
(3)将标准品质粒梯度稀释成不同copies/μl后作为模板，采用与步骤(1)相同的条件进行qPCR反应后，构建标准曲线；
(4)根据待测样品的qPCR反应结果判断待测样品中是否含有螺原体。
5.如权利要求4所述的快速检测螺原体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中qPCR反应体系包括：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix10μl、RNase‑free water 6.2μl、
10μM的正向引物0.4μl、10μM的反向引物0.4μl和模板3μl。
6.如权利要求4所述的快速检测螺原体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中qPCR反应程序包括：95℃预变性30s；扩增39个循环，每个循环95℃变性10s，57℃退火延伸30s，采集信号；循环结束后在60‑95℃内以0.5℃递增，每个温度处理5s，采集信号并绘制熔解曲线。
7.如权利要求4所述的快速检测螺原体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中标准品质粒的构建方法为：将编号为NC_021833.1的螺原体CUAS株16S rDNA序列的401‑845nt片段人工合成至pUC57载体。
8.如权利要求4所述的快速检测螺原体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中标准曲线7
的构件方法为：将标准品质粒的浓度换算成拷贝数并梯度稀释成1/3×10 copies/μl、1/3
6 5 4 3
×10copies/μl、1/3×10 copies/μl、1/3×10 copies/μl、1/3×10 copies/μl、1/3×2
10 copies/μl的定量标准品，分别进行qPCR反应，以拷贝数的对数为横坐标，Cq值为纵坐标，绘制标准曲线。
9.如权利要求4所述的快速检测螺原体的方法，其特征在于，所述步骤(4)中判断方法为：待测样品基因组DNA的qPCR反应Ct值≤35，同时拷贝数≥100，且有明显的扩增曲线、Tm值为83.5±0.5，表明待测样品中含有螺原体，判断为阳性，反之则为阴性。
说明书 :
一种快速检测螺原体的通用引物、试剂盒及方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测螺原体的通用引物、试剂盒及方法和应用。
背景技术
[0002] 杆状病毒‑昆虫细胞表达系统是以杆状病毒为载体、昆虫细胞为宿主的外源基因表达体系，具有易于筛选、高表达水平及翻译后修饰功能等优势。作为现今应用广泛的真核表达系统之一，已成功用于人用和兽用生物产品的研制，目前已有4种人用生物制品和5种兽用疫苗上市。随着昆虫细胞的广泛应用和近年来科学技术的发展，昆虫细胞作为生物制品生产用细胞基质的安全性也被密切关注，依照欧洲药典10.0通则5.2.3的最新要求，昆虫细胞来源或添加有植物源原料的生物制品需进行螺原体的检测。
[0003] 螺原体是一种呈螺旋状、无细胞壁、能运动的原核生物，属于细菌域、厚壁菌门、柔膜菌纲、虫原体目，与同属柔膜菌纲下的支原体类似，具有基因组小、代谢过程简单、营寄生生活的特性。螺原体主要存在于昆虫肠道、血淋巴或植物韧皮部中，与宿主大多数呈共生或互生关系，但某些螺原体也会引起植物的病害和昆虫的性别失调、疾病死亡。
[0004] 目前对螺原体的检测只有针对某种致病性螺原体的特异性检测，如柑橘螺原体的PCR检测、虾蟹螺原体的胶体金检测、水生动物螺原体的酶联免疫检测等，尚未有广谱性好、灵敏度高、特异性强的检测方法。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种具有广谱性的螺原体检测方法。
[0006] 为此，本发明提供了一种快速检测螺原体的通用引物，所述通用引物的正向引物序列为：ATGCACCACCTGTCTCAATG；反向引物序列： ACTCCGCCTGAGTAGTATGC。
[0007] 本发明还提供了一种快速检测螺原体的试剂盒，包括上述通用引物。
[0008] 本发明还提供了一种快速检测螺原体的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)提取待测样品基因组DNA，以待测样品基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的快速检测螺原体的通用引物进行qPCR反应；
[0010] (2)构建螺原体的标准品质粒；
[0011] (3)将标准品质粒稀释成不同浓度梯度后作为模板，采用与步骤(1) 相同的条件进行qPCR反应后，构建标准曲线；
[0012] (4)根据待测样品的qPCR反应结果判断待测样品中是否含有螺原体；
[0013] 具体的，上述步骤(1)中qPCR反应体系包括：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl、RNase‑free water 6.2μl、10μM的正向引物0.4μl、 10μM的反向引物0.4μl和模板3μl。
[0014] 具体的，上述步骤(1)中qPCR反应程序包括：95℃预变性30s；扩增39个循环，每个循环95℃变性10s，57℃退火延伸30s，采集信号；循环结束后在60‑95℃内以0.5℃递增，每个温度处理5s，采集信号并绘制熔解曲线。
[0015] 具体的，上述步骤(2)中标准品质粒的构建方法为：将螺原体CUAS (NC_021833.1)株16S rDNA序列的401‑845nt片段人工合成至pUC57载体。
[0016] 具体的，上述步骤(3)中标准曲线的构建方法为：将标准品质粒的浓度换算成拷贝7 6 5
数(copies/μl)并梯度稀释成1/3×10copies/μl、1/3×10 copies/μl、 1/3×10copies/μ
4 3 2
l、1/3×10 copies/μl、1/3×10 copies/μl、1/3×10copies/μl的定量标准品，分别进行qPCR反应，以拷贝数的对数为横坐标，Cq值为纵坐标，绘制标准曲线。
数(copies/μl)并梯度稀释成1/3×10copies/μl、1/3×10 copies/μl、 1/3×10copies/μ
4 3 2
l、1/3×10 copies/μl、1/3×10 copies/μl、1/3×10copies/μl的定量标准品，分别进行qPCR反应，以拷贝数的对数为横坐标，Cq值为纵坐标，绘制标准曲线。
[0017] 具体的，上述步骤(4)中判断方法为：待测样品基因组DNA的qPCR 反应Ct值≤35，同时拷贝数≥100，且有明显的扩增曲线、Tm值为83.5±0.5，表明待测样品中含有螺原体，判断为阳性；反之则为阴性。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
[0019] 本发明提供的这种快速检测螺原体的通用引物基于34种螺原体16S rDNA标准序列的保守区及2种克隆常用大肠杆菌16S rDNA标准序列的变异区而设计，能特异识别昆虫细胞基质及其生物制品中的螺原体而不受大肠杆菌的干扰；采用本申请提供的快速检测螺原体的方法，只需提取昆虫细胞或生物制品DNA即可检测是否存在螺原体的污染，灵敏度为100拷贝，具有用时短、操作简单、灵敏度高、特异性好的优势。
[0020] 以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
[0021] 图1是本发明实施例1中标准品质粒qPCR检测的扩增曲线和溶解曲线，a‑f依次代7 2
表标准质粒1×10copies/reaction‑1×10copies/reaction。
表标准质粒1×10copies/reaction‑1×10copies/reaction。
[0022] 图2是本发明实施例1中标准品质粒的拟合曲线。
[0023] 图3是本发明实施例2中添加有100ng的Sf细胞基因组的标准品质粒 qPCR检测扩7
增曲线和溶解曲线；其中a‑f依次为添加有Sf细胞基因组的标准品质粒1×10 copies/
2
reaction‑1×10copies/reaction，g为添加有Sf细胞基因组的空白对照。
增曲线和溶解曲线；其中a‑f依次为添加有Sf细胞基因组的标准品质粒1×10 copies/
2
reaction‑1×10copies/reaction，g为添加有Sf细胞基因组的空白对照。
[0024] 图4是本发明实施例2中添加有100ng的Sf细胞基因组的标准品质粒拟合曲线。
[0025] 图5是本发明实施例3中标准品质粒、大肠杆菌和牛虻螺原体TABS‑2 样本qPCR检7
测的扩增曲线和溶解曲线；其中a‑f依次为标准品质粒 1×10 copies/reaction‑1×
2
10copies/reaction，g为大肠杆菌，h为牛虻螺原体 TABS‑2。
测的扩增曲线和溶解曲线；其中a‑f依次为标准品质粒 1×10 copies/reaction‑1×
2
10copies/reaction，g为大肠杆菌，h为牛虻螺原体 TABS‑2。
[0026] 图6是本发明实施例3中标准品质粒的拟合曲线。
具体实施方式
[0027] 下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。除非特别说明，本发明所使用的试剂和设备都可通过常规市场购买，所使用的试剂均按照《分子克隆实验指南》配制。
[0028] 下面通过具体实施例对本发明的快速检测螺原体的通用引物、试剂盒及方法的效果进行研究。
[0029] 实施例1：
[0030] 本实施例提供了一种快速检测螺原体的通用引物，并验证了利用该通用引物进行qPCR检测的灵敏度和稳定性。
[0031] (1)引物的设计与合成
[0032] 利用MEGA5.0软件对NCBI中34种螺原体、2种大肠杆菌的16S rDNA 序列进行同源性分析，找出螺原体保守而又与大肠杆菌差异的区域设计多对通用引物，经筛选得到一对特异性和灵敏度均最优的引物对，所述引物对序列为：
[0033] 正向引物：ATGCACCACCTGTCTCAATG；
[0034] 反向引物：ACTCCGCCTGAGTAGTATGC。
[0035] (2)qPCR检测
[0036] 将螺原体CUAS(NC_021833.1)株16S rDNA序列的401‑845nt片段人工合成至pUC57载体，得到含有目的检测片段的标准品质粒，将质粒的浓度换算成拷贝数(copies/μl)并梯7 6 5 4
度稀释成1/3×10 copies/μl、 1/3×10copies/μl、1/3×10copies/μl、1/3×10copies/
3 2
μl、1/3×10copies/μl、 1/3×10copies/μl的定量标准品。以此定量标准品为模板，利用上述通用引物进行qPCR检测，每个样本重复两次，同时以水为空白对照。
度稀释成1/3×10 copies/μl、 1/3×10copies/μl、1/3×10copies/μl、1/3×10copies/
3 2
μl、1/3×10copies/μl、 1/3×10copies/μl的定量标准品。以此定量标准品为模板，利用上述通用引物进行qPCR检测，每个样本重复两次，同时以水为空白对照。
[0037] 反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl、 RNase‑free water 6.2μl、10μM的正向引物0.4μl、10μM的反向引物0.4μl 和模板3μl。
[0038] 反应程序为：95℃预变性30s；扩增39个循环，每个循环95℃变性10s， 57℃退火延伸30s，采集信号；循环结束后在60‑95℃内以0.5℃递增，每个温度处理5s，采集信号并绘制熔解曲线。
[0039] 反应结果如图1‑2所示，本发明提供的qPCR检测方法可检测至100 copies，Ct值为32.99，小于35，符合药典规定，Tm值为83.5±0.5；标准曲线的线性回归方程为Copies＝10(39.795‑Cq)/3.486 2 7 2
，扩增效率为93.6％，R＝0.999，该检测方法在10 ‑10copies/reaction的范围内具有良好的线性关系；此外，空白对照未起峰，不同时间的重复实验均得到类似结果，表明本申请提供的螺原体检测方法灵敏度高、稳定性好，具有较高的可重复性。
，扩增效率为93.6％，R＝0.999，该检测方法在10 ‑10copies/reaction的范围内具有良好的线性关系；此外，空白对照未起峰，不同时间的重复实验均得到类似结果，表明本申请提供的螺原体检测方法灵敏度高、稳定性好，具有较高的可重复性。
[0040] 实施例2：
[0041] 本实施例采用与实施例1相同的通用引物和标准品质粒进行实验。
[0042] 为评估昆虫宿主来源的核酸是否对本申请的qPCR检测方法存在干扰，在各浓度梯度的标准品质粒的qPCR反应体系中均添加一定量昆虫细胞基因组进行检测。
[0043] 具体反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl、RNase‑free water 5.2μl、100ng/μl的sf9细胞系基因组1μl、10μM的正向引物0.4μl、10μM的反向引物0.4μl和模板(标准品质粒)3μl。
[0044] 同时，以水和同样添加有sf9细胞系基因组的水为空白对照进行qPCR 反应，反应程序与实施例1相同，每样本两次重复。
[0045] 反应结果如图3‑4所示，R2平均为0.999，qPCR重复实验表明标准品质粒仍具有良好的线性关系；100copies标准品对应Ct均值为32.73，添加 sf9细胞系基因组的空白对照起低于阈值的非特异性杂峰，Ct值约为39，属于阴性。此结果说明本发明提供的qPCR检测方法对昆虫细胞螺原体具有良好的特异性和灵敏度，且对昆虫细胞基因组具有一定程度的抗干扰性。
[0046] 实施例3
[0047] 本实施例采用与实施例1相同的通用引物和标准品质粒进行实验，对大肠杆菌和牛虻螺原体TABS‑2样本进行qPCR检测。
[0048] (1)样本基因组提取
[0049] 样本大肠杆菌为DH‑10B感受态细胞，牛虻螺原体TABS‑2购买于 ATCC。分别取37℃过夜培养的大肠杆菌悬液和30℃培养72小时的螺原体悬液200μl，经天根基因组提取试剂盒提取并溶于50μl超纯水，作为待检样本。
[0050] (2)qPCR检测
[0051] 将标准品质粒梯度稀释成1/3×107copies/μl、1/3×106copies/μl、1/3×5 4 3 2
10copies/μl、1/3×10 copies/μl、1/3×10copies/μl、1/3×10copies/μl的定量标准品，用作构建标准曲线的模板。采用与实施例1相同的反应体系和程序，分别以定量标准品、大肠杆菌基因组、牛虻螺原体TABS‑2基因组作为模板进行qPCR反应，结果如图5‑6 所示。
10copies/μl、1/3×10 copies/μl、1/3×10copies/μl、1/3×10copies/μl的定量标准品，用作构建标准曲线的模板。采用与实施例1相同的反应体系和程序，分别以定量标准品、大肠杆菌基因组、牛虻螺原体TABS‑2基因组作为模板进行qPCR反应，结果如图5‑6 所示。
[0052] 大肠杆菌基因组经qPCR反应后未检测到任何DNA的扩增，而螺原体 TABS‑2基因组的Ct值为28，熔解峰单一并与标准质粒一致，说明该qPCR 检测方法能特异地识别螺原体，且不会因环境中存在的大肠杆菌造成假阳性。此结果表明本申请提供的通用引物及qPCR检测方法对螺原体具有特异识别能力，同时证明了该检测体系的有效性。
[0053] 综上所述，本发明提供的这种快速检测螺原体的通用引物基于34种螺原体16S rDNA标准序列的保守区及2种克隆常用大肠杆菌16S rDNA标准序列的变异区而设计，既具有广谱性，又能特异识别生物制品中的螺原体而不受大肠杆菌的干扰；采用本申请提供的快速检测螺原体的方法，只需提取生物制品DNA即可检测是否存在螺原体的污染，灵敏度为100拷贝，具有用时短、操作简单、灵敏度高、特异性好的优势。
[0054] 以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。