一种测定四环素的电化学传感器及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种测定四环素的电化学传感器及其制备方法和应用，制备方法为：先制备氧化石墨烯纳米带，再制备巯基化环糊精/氧化石墨烯纳米带溶液，然后加入HAuCl4溶液，借助水合肼的强还原性并利用S‑Au作用制备了AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs复合材料，在此基础上构筑了AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE电极。本发明制备的复合材料作为良好电导体可以有效加快电极与溶液之间的电子转移，从而提高检测的灵敏度。在最优条件下，利用线性扫描伏安法对四环素进行检测，其线性范围为0.05μM～240μM，检测限为0.016μM(S/N＝3)，并且具备较好的重复性和选择性。

权利要求

1.一种电化学传感器在检测四环素中的应用，其特征在于，所述电化学传感器由以下方法制备：(1)氧化石墨烯纳米带的制备：将多璧碳纳米管加入硫酸和磷酸的混合液中，搅拌1h后加入KMnO4，65℃下搅拌2h，然后冰浴冷却，再加入双氧水，最后将溶液过滤、洗涤、干燥，得到氧化石墨烯纳米带；所述硫酸和磷酸的体积比为9:1；所述多璧碳纳米管与混合液的加入量之比为0.1g:150mL；所述多璧碳纳米管、KMnO4和双氧水的加入量之比为1g:5g:5mL；

(2)金纳米粒子/巯基化环糊精/石墨烯纳米带的制备：将步骤(1)制备的氧化石墨烯纳米带分散在水中得到氧化石墨烯纳米带溶液，巯基化环糊精溶于水中得到巯基化环糊精溶液，然后将氧化石墨烯纳米带溶液与巯基化环糊精溶液混合均匀，再加入HAuCl4溶液混合均匀后滴加水合肼进行还原反应，得到黑色溶液，过滤后干燥，得AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs；所述氧化石墨烯纳米带溶液、巯基化环糊精溶液、HAuCl4溶液和水合肼的体积比为40:40:‑1

1.2:0.5；所述石墨烯纳米带溶液的浓度为0.5mg mL ；所述巯基化环糊精溶液的浓度为‑1

0.5mg mL ；所述HAuCl4溶液的浓度为10mM；

(3)修饰电极的制备：对电极进行预处理，将步骤(2)制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs溶于水中并超声分散得到AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs液，将AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs液滴涂于预处理后的电极表面，干燥后得到AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE；

所述预处理为：将玻碳电极进行打磨，再用蒸馏水把打磨后玻碳电极冲洗干净，然后将玻碳电极放入蒸馏水中超声清洗，清洗后的玻碳电极放入H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，最后将扫描后的玻碳电极放在二次水中超声处理；所述AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs液的浓度为‑1

0.5mg mL ；

‑1

所述H2SO4溶液的浓度为0.05M，循环伏安扫描的电位为‑0.2～1.6V，扫速为0.1V s 。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述滴加速度为1滴/s；所述还原反应的温度60℃、反应的时间为24h。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述打磨为：将电极用含有Al2O3 颗粒的麂皮进行打磨，所述超声清洗的时间为5min；所述Al2O3 颗粒的粒径为0.05μm。

说明书

一种测定四环素的电化学传感器及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及电化学传感器技术领域，特别是涉及一种快速灵敏测定四环素的电化学传感器及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 四环素是用来治疗细菌感染类疾病的最普遍的一种抗生素。它可以用在比如尿道感染，衣原体和皮肤上的粉刺痤疮类疾病等。然而其滥用的不当会造成动物源食品(如肉类、蜂蜜和鸡肉等)中的残留，进而引起人体抗药性、视力、牙齿和易过敏症状等危害。我国农业部对已批准使用的四环素类抗生素制定了相应的最高残留限量限制标准(例如，猪牛肉中四环素为不高于100μg/kg)。因此，发展灵敏、高选择和快速的四环素类抗生素残留检测方法具有十分重要的意义，成为未来检测发展的趋势。

[0003] 目前，许多传统的分析方法包括气相色谱‑质谱法、高效液相色谱‑质谱法、荧光光度法和酶联免疫法等已经被开发应用于四环素的残留检测分析。然而这些方法通常涉及到昂贵的仪器、复杂的样品衍生处理步骤、费时和专门的技术人员等缺点。电化学传感分析具有灵敏性高、仪器简单易于操作、检测成本低及易于微型化等特点，为动物源食品中四环素的检测，提供了新的途径，具有潜在的比较优势和可替代性。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种快速灵敏测定四环素的电化学传感器及其制备方法和应用。本发明制备的传感器简单、实用、高效、灵敏、精确、价廉，可快速选择性测定四环素。

[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的：

[0006] 本发明的第一方面，提供一种测定四环素的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

[0007] (1)氧化石墨烯纳米带的制备：将多璧碳纳米管加入硫酸和磷酸的混合液中，搅拌1h后加入KMnO4，65℃下搅拌2h，然后冰浴冷却，再加入双氧水，最后将溶液过滤、洗涤、干燥，得到氧化石墨烯纳米带；

[0008] (2)金纳米粒子/巯基化环糊精/石墨烯纳米带的制备：将步骤(1)制备的氧化石墨烯纳米带溶于水中超声分散得到氧化石墨烯纳米带溶液，巯基化环糊精溶于水中得到巯基化环糊精溶液，然后将氧化石墨烯纳米带溶液与巯基化环糊精溶液混合均匀，再加入HAuCl4溶液混合均匀后滴加水合肼进行还原反应，得到的黑色溶液，过滤后干燥，得AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs；

[0009] (3)修饰电极的制备：对电极进行预处理，将步骤(2)制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs溶于水中并超声分散得到AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs液，将AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs液滴涂于预处理后的电极表面，干燥后得到AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE。

[0010] 优选的，步骤(1)中，所述硫酸和磷酸的体积比为9:1；所述多璧碳纳米管与混合液的加入量之比为0.1g:150mL。

[0011] 优选的，所述多璧碳纳米管、KMnO4和双氧水的加入量之比为1g:5g:5mL。

[0012] 优选的，步骤(1)中，所述过滤为使用孔径为0.45μm的滤膜进行过滤；所述干燥为室温下干燥24h。

[0013] 优选的，步骤(2)中，所述石墨烯纳米带溶液、巯基化环糊精溶液、HAuCl4溶液和水合肼的体积比为40:40:1.2:0.5。

[0014] 优选的，所述石墨烯纳米带溶液的浓度为0.5mg mL‑1；所述巯基化环糊精溶液的浓‑1度为0.5mg mL ；所述HAuCl4溶液的浓度为10mM。

[0015] 优选的，步骤(2)中，所述滴加速度为1滴/s；所述还原反应的温度60℃、反应的时间为24h。

[0016] 优选的，步骤(2)中，所述过滤为使用孔径为0.45μm的滤膜进行过滤，所述干燥为60℃下真空干燥24h，真空度低于133Pa。

[0017] 本发明中，步骤(1)制备的是氧化石墨烯纳米带，步骤(2)中滴加了水合肼，不仅能还原得到金纳米粒子，而且能将氧化石墨烯纳米带还原为石墨烯纳米带。

[0018] 优选的，步骤(3)中，所述预处理为：首将电极进行打磨，再用蒸馏水把打磨后电极冲洗干净，然后将电极放入蒸馏水中超声清洗，清洗后的电极放入H2SO4溶液中进行循环伏安扫描，最后将扫描后的电极放在二次水中超声处理。所述AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs液的浓度‑1为0.5mg mL 。

[0019] 优选的，所述电极为玻碳电极；所述打磨为：将电极用含有粒径为0.05μm的Al3O2的麂皮进行打磨，所述超声清洗的时间为5min。

[0020] 优选的，所述H2SO4溶液的浓度为0.05M，循环伏安扫描的电位为‑0.2～1.6V，扫速‑1为0.1V s 。

[0021] 本发明的第二方面，提供上述制备方法得到的测定四环素的电化学传感器。

[0022] 本发明的第三方面，提供上述电化学传感器在检测四环素中的应用。

[0023] 本发明的有益效果为：

[0024] 1、本发明的制备方法成本低廉、工艺简单、操作简易。

[0025] 2、本发明制备得到的复合材料是良好电导体，可有效加快电极与溶液之间的电子转移，从而提高检测灵敏度。

[0026] 3、本发明制备得到的电化学传感器用于测定实际样品中的四环素，并获得了较好的效果，其线性范围为0.05μM～240μM，检测限为0.016μM(S/N＝3)。

[0027] 4.本发明制备得到的电化学传感器性能稳定，便于保存，方便使用。

附图说明

[0028] 图1：四环素在裸GCE、SH‑β‑CD‑GNRs/GCE、实施例1制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE上循环伏安行为比较；其中，a:四环素在GCE上的循环伏安图；b:四环素在SH‑β‑CD‑GNRs/GCE上的循环伏安图；c:四环素在实施例1制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE上的循环伏安图；扫描速度100mV/s；0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 6.5)；富集时间250s；开路富集。

[0029] 图2：实施例1制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE的循环伏安行为比较；其中，a：在空白pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安图，b：在25μM四环素中的循环伏安图。

[0030] 图3中，A：不同扫描速度下的循环伏安图；其中，a:5mV/s、b:10mV/s、c:20mV/s、d:40mV/s、e:60mV/s、f:80mV/s、g:100mV/s；B：峰电流(I)与扫描速度(v)的关系。

[0031] 图4中，A：四环素在不同pH缓冲液中的循环伏安图；从右往左(a‑g)pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0；B：缓冲液pH对四环素氧化峰电流的影响；C：
缓冲液pH与四环素氧化峰电位的关系。

[0032] 图5中，A：不同浓度四环素与其峰电流。a‑o:0.00‑240.00μM；B：峰电流对应四环素浓度的校准曲线。

[0033] 图6：0.5μM四环素溶液中加入不同干扰物质后的峰电流响应比例。

具体实施方式

[0034] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0035] 正如背景技术所述，四环素会对我们人体造成不良影响，需要进一步提高四环素的检测选择性和灵敏性。基于此，本发明提供一种快速灵敏测定四环素的电化学传感器及其制备方法和应用。本发明中的石墨烯纳米带是用多壁碳纳米管制成的纳米带，再利用巯基和金纳米粒子结合，然后负载在石墨烯纳米带上。

[0036] 石墨烯纳米带一种二维晶体碳纳米材料，由于其具有很好的导电性和电化学稳定性，在电化学传感检测方面具有独特的优势。然而纯净的石墨烯纳米带不易与水互溶，导致了应用上存在一定的局限性。环糊精分子具有“外亲水、内疏水”的特殊结构，可以间接促进疏水物质在水溶液中的“溶解”。金纳米粒子具有表面效应，导电性高和良好的生物兼容性，被广泛用于提高传感器的性能。本发明一方面采用巯基化环糊精改善了石墨烯纳米带在水溶液中的分散，另一方面利用巯基化环糊精上的S‑Au作用，以自下而上的方法，通过湿化学法的化学还原手段合成金纳米粒子，构筑了金纳米粒子/巯基化环糊精/石墨烯纳米带复合物修饰电极。在此基础上利用线性扫描伏安法成功实现了四环素的快速灵敏检测，目前该方法尚未见报道。

[0037] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

[0038] 实施例1：电化学传感器的制备

[0039] (1)氧化石墨烯纳米带的制备。将0.1g MWCNT加入含有150mLH2SO4/H3PO4(9:1)的烧瓶中，搅拌1小时后加入0.5g KMnO4，混合物于65℃下搅拌2小时，冰浴冷却后加入0.5mLH2O2，最后将溶液用0.45μm滤膜过滤，并用去离子水多次洗涤至滤液呈中性，室温下干燥24小时后即得。

[0040] (2)金纳米粒子/巯基化环糊精/石墨烯纳米带的制备。将步骤(1)制备的氧化石墨烯纳米带溶于水中超声(功率360w，频率40KHz)24小时分散得到氧化石墨烯纳米带溶液，将‑120mg加入于40mL水中搅拌0.5小时后可得到0.5mg mL 的巯基化环糊精溶液。将40mL氧化石‑1 ‑1
墨烯纳米带溶液(0.5mg mL )与40mL(0.5mg mL )的SH‑β‑CD溶液混合后搅拌0.5小时，再加入1.2mL(10mM)HAuCl4溶液混合均匀后滴加0.5mL水合肼，混合液于60℃下反应24个小时，得到的黑色溶液用0.45μm滤膜过滤后并在60℃真空下(真空度略低于133Pa)干燥24小时后即得AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs。

[0041] (3)修饰电极的制备。首先把玻碳电极放在含有0.05μm的Al3O2(泥浆)的麂皮上打磨，用蒸馏水把电极冲洗干净，再把电极放入装了蒸馏水的小烧杯中并且超声(功率360w，频率40KHz)5分钟。

[0042] 清洗干净电极后取出把电极放在溶度为0.05M H2SO4溶液中，并且在‑0.2V到1.6V‑1的电位范围内进行循环伏安扫描，扫速为0.1V s 。最后，再将电极放在二次水中超声(功率‑1
360w，频率40KHz)5分钟。将AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs复合物溶于水中(0.5mg mL )超声(功率
360w，频率40KHz)分散后，取6μL滴涂于电极表面室温下用氮气吹0.5小时至干燥后即得AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE。

[0043] 实施例2：

[0044] 对实施例1制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE进行四环素的电化学检测

[0045] (1)在0.30～1.10V的电位范围内，在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中，进行循环伏安扫描，SH‑β‑CD‑GNRs/GCE和实施例1制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE对四环素有明显的催化效果，结果如图1和图2所示，相比较而言，实施例1制备的AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE对四环素的催化效果更优。

[0046] (2)在0.30～1.10V的电位范围内，在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中，富集时间为250s，富集电位为0.30V，改变循环伏安的扫描速率(5mV/s、10mV/s、20mV/s、40mV/s、60m V/s、80mV/s、100mV/s)，得到一系列CV曲线。随着扫描速率的增加，两个氧化峰的峰电流也逐渐增加。并且两个峰的峰电流和扫描速率成线性关系，线性方程式分别为：Ipeak1＝0.1613v+
2 2
1.4653(R＝0.9992)，Ipeak2＝0.0931v+0.6717(R＝0.9987)说明四环素的电化学反应是吸附控制过程。结果如图3所示。

[0047] (3)在0.30～1.10V的电位范围内，分别在pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，进行循环伏安扫描。在磷酸盐缓冲溶液pH从5.0逐渐增加到6.5的过程中，峰电流随pH的增加而增大，在pH 6.5左右的范围内达到最大且稳定。而在磷酸盐缓冲溶液pH从6.5逐渐增加到8.0的过程中，峰电流随pH的增加而减小。实验结果表明四环素在pH 6.5的条件下能最好地发生电化学反应。结果如图4所示。

[0048] (4)在0.05μM～240μM范围内，在pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液中，用线性扫描伏安法测定，四环素的浓度为0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、2.00、4.00、8.00、14.00、40.00、80.00、120.00、160.00、200.00、240.00μM。随着四环素浓度的增大，AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE对四环素的电流响应也随之增加，并且四环素的浓度与电流呈线性关系，其线性方程分别为：
2
Ipeak1(μA)＝0.06184C(μM)+0.02346(R ＝0.9944)，Ipeak1’(μA)＝0.01383C(μM)+
2 2
0.67652(R ＝0.9989)，Ipeak2(μA)＝0.00995C(μM)+0.4581(R＝0.9985)。所以，本实验线性范围是：0.05μM～240μM，最低检测限(LOD)是：0.016μM(S/N＝3)。结果如图5A和图5B所示。

[0049] (5)在0.5μM四环素溶液中，用同一AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE在同样条件下，平行测定10次的相对标准偏差为3.11％。在0.5μM四环素溶液中，用同样方法修饰的10支AuNPs/SH‑β‑CD‑GNRs/GCE，在同样条件下，分别测定10次的相对标准偏差为3.17％。该电极用于测定四环素后，存放在4℃的冰箱中10天，测定相同浓度的四环素时其电流仅减小4％。

[0050] (6)电化学传感器检测四环素的性能评估：检查了一些可能共存物的干扰。实验结果表明，在0.5μM四环素溶液中，存在100倍的尿酸，葡萄糖，维生素C，B1，B6，B12不干扰四环素的测定。结果如图6所示，可以看出本发明制备的电化学传感器可以抗尿酸，葡萄糖，维生素C，B1，B6，B12等常见物质的干扰，检测具有较好的选择性。

[0051] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。