一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用，涉及生物医学领域。本发明将Tet‑on系统应用于肝细胞，通过Tet‑on系统使得肝细胞的功能得到强化。Tet‑on系统具有高效率、精准、安全和可逆性的特点。进而由此制备了一种新型的永生化肝细胞，该肝细胞可以通过添加或去除四环素类似物实现肝细胞功能的可逆调控，促进肝细胞功能的可逆增强。该制备方法简单易行，培养成本低，种子细胞来源于永生化肝细胞，易于临床转化。

权利要求

1.一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法，其特征在于，将包装后的含调控肝细胞转录的Tet‑on系统的慢病毒感染人永生化肝细胞然后利用筛选剂和扩增培养基对经病毒转染后的细胞进行抗性筛选和扩增传代培养，得到肝功能可逆的永生化肝细胞系；通过添加四环素类似物使得永生化肝细胞系呈肝向功能强化状态，通过去除四环素类似物使得永生化肝细胞系呈正常肝细胞增殖状态；

所述调控肝细胞转录的Tet‑on系统包括调节表达盒和反应表达盒，所述调节表达盒包括肝脏特异性启动子和反义四环素激活子，所述反应表达盒包括四环素诱导型启动子和转录因子编码基因；所述转录因子编码基因包括FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因; 所述调节表达盒还包括第一筛选基因、转录后调控元件和衔接元件，且所述肝脏特异性启动子、所述反义四环素激活子、衔接元件、第一筛选基因和转录后调控元件沿5’‑3’方向依次串联；

所述四环素诱导型启动子、所述转录因子编码基因沿5’‑3’方向依次串联，所述反应表达盒还包括第二筛选基因，所述第二筛选基因位于所述转录因子编码基因的下游；

所述四环素类似物为金霉素、土霉素、米诺环素、多西环素或强力霉素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人永生化肝细胞是由人永生化肝细胞系作为基底种子细胞；在进行慢病毒感染前进行基底种子细胞的培养准备，所述基底种子细胞的培养准备包括：将人永生化肝细胞进行培养，以得到汇合率为50%‑70%的基底种子细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包装后的慢病毒与人永生化肝细胞的

5 7 7

混合比例为：每5×10数量的人永生化肝细胞与1×10‑2.5×10数量的包装后的慢病毒液混合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，感染人永生化肝细胞48‑72h后，换用含有筛选剂的培养基继续再传代培养；所述再传代培养的代数为3‑4代。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述筛选剂为嘌呤霉素、腐草霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或新霉素。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝脏特异性启动子选自CMV启动子、PGK启动子、白蛋白启动子、载脂蛋白E启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α‑I‑抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α‑甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF‑II启动子、因子VIII启动子、HBV基础核心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素‑结合球蛋白启动子、HCR‑Ap0CII的杂合启动子、HCR‑hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的增强子元件结合的AAT启动子、低密度脂蛋白启动子、丙酮酸激酶启动子、卵磷脂‑胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白H启动子、铁传递蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α‑纤维蛋白原及β‑纤维蛋白原的启动子、α‑I‑抗糜蛋白酶启动子、α‑2‑HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋白溶酶原启动子、补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及α‑I‑酸性糖蛋白启动子中的任意一种；

所述第一筛选基因选自嘌呤霉素抗性基因、腐草霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二筛选基因选自真核抗性基因；

所述真核抗性基因选自嘌呤霉素抗性基因、腐草霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述四环素诱导型启动子选自TRE3G启动子。

9.一种如权利要求1所述的调控肝细胞转录的Tet‑on系统在制备肝功能可逆的永生化肝细胞中的应用。

说明书

一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用。

背景技术

[0002] 合适的肝细胞系在生物人工肝技术、药理毒理学研究和肝脏组织工程研究中的地位越来越重要。理想的肝细胞源应具备完整的肝功能、良好的增殖能力以及无致瘤、无感染
的风险。目前常用的肝细胞源有原代人肝细胞、原代猪肝细胞、人肝癌细胞系HepG2、
HepaRG、永生化细胞以及干细胞分化肝细胞等。这些类肝细胞在体外虽然具有一定的肝功
能，但是它们各自存在着成熟度不足、有限性扩增、功能不稳定、异种移植排斥、生物安全性
不高和致瘤风险等应用障碍。

[0003] 公开号为CN110438157B和公开号为CN105521482A的中国发明专利申请公开了，单独或联合应用不同的肝细胞特异性转录因子来进一步诱导类肝细胞分化的方法，但这些方
法或种子细胞来源于肝癌细胞，或使用的培养体系成本高昂，皆难以进行临床转化。

[0004] 公开号为CN105925609B和公开号为CN107557389A的中国发明专利申请公开了，通过可控诱导不同的目的外源基因过表达，来调控干细胞向不同的体细胞分化的方法。前者
促进多能干细胞向造血细胞分化，后者则促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

[0005] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用以解决上述技术问题。

[0007] 发明人将Tet‑on系统应用于肝细胞，通过改进Tet‑on系统使得肝细胞的功能得到强化。进而由此制备了一种新型的永生化肝细胞，该肝细胞可以通过添加或去除四环素类
似物实现肝细胞功能的可逆调控，促进肝细胞可逆功能的增强。

[0008] 本发明是这样实现的：

[0009] 本发明提供了一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法，将包装后的含调控肝细胞转录的Tet‑on系统的慢病毒感染人永生化肝细胞，然后利用筛选剂和扩增培养基对经
病毒转染后得到的细胞进行抗性筛选和扩增传代培养，得到肝功能强化可逆的永生化肝细
胞系；通过添加四环素类似物使得永生化肝细胞系呈肝向功能强化状态，通过去除四环素
类似物使得永生化肝细胞系呈正常肝细胞增殖状态；

[0010] 调控肝细胞转录的Tet‑on系统包括调节表达盒和反应表达盒，调节表达盒包括肝脏特异性启动子和反义四环素激活子，反应表达盒包括四环素诱导型启动子和转录因子编
码基因；转录因子编码基因包括但不限于FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因。

[0011] 本发明提供的肝功能可逆的永生化肝细胞的制备方法具有高效率、精准、安全和可逆性的特点。

[0012] 高效率体现在：无诱导时目的基因表达水平较低，有四环素类似物诱导存在时，目的基因表达。目的基因包括转录因子编码基因和筛选基因。具体表现为：四环素类似物不存
在时，反义四环素激活子无法与TRE结合。由于反应表达盒缺少增强子，反义四环素激活子
（reverse tetracycline tranional activator，rtTA）未与TRE结合时，四环素诱导型启动
子无法启动目的基因的表达，从而表现为基因表达受抑制。四环素类似物存在时，反义四环
素激活子能够与TRE结合，从而使得四环素诱导型启动子活化，从而使得目的基因表达。

[0013] 精准调控体现为可以通过控制四环素类似物的剂量及用药时间进行肝细胞功能强化的可逆调控。

[0014] 安全性体现在，采用较低剂量的四环素类似物即可获得良好的效果，而且Tet‑on应用多年，其安全可靠。

[0015] 可通过反复加入诱导，多次启动诱导。

[0016] 发明人通过四环素类似物诱导启动子同时靶向过表达三种肝细胞相关转录因子FOXA3、CEBPA和GATA6，使永生化类肝细胞实现可逆的肝向功能增强。需要说明的是，上述转
录因子是发明人经过大量和长期的筛选获得的，发明人发现只有同时过表达上述三种肝细
胞相关转录因子才能实现永生化类肝细胞的肝向功能增强。

[0017] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述人永生化肝细胞是由人永生化肝细胞系作为基底种子细胞；在进行慢病毒感染前进行基底种子细胞的培养准备，基底种子细胞的培
养准备包括：将人永生化肝细胞进行培养，以得到汇合率为50%‑70%的基底种子细胞。汇合
率为细胞贴壁并且完全舒展后，细胞所占的面积与培养表面面积的百分比。

[0018] 四环素类似物为金霉素、土霉素、米诺环素、多西环素或强力霉素。

[0019] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述包装后的慢病毒与人永生化肝细胞的混合5 7 7
比例为：每5×10 数量的人永生化肝细胞与1×10‑2.5×10 数量的包装后的慢病毒液混
合。

[0020] 可选的，作为基底种子细胞的人永生化肝细胞系可以是C3A。

[0021] 发明人发现，当四环素类似物存在时，细胞为肝向功能强化状态，镜下细胞形态为典型的肝细胞形态（多边形），均匀平铺生长，表达正常的肝细胞标志物，并且ALB（白蛋白）、
AAT（α1‑抗胰蛋白酶）、尿素以及凝血因子7的合成能力提高；而多西环素去除时，细胞为正
常状态，镜下形态为上皮细胞样，呈岛状聚集生长，AAT、尿素以及凝血因子7的合成能力表
现并不优秀。表明本发明提供的制备方法制备的肝功能可逆的永生化肝细胞的功能得到强
化。

[0022] 在一种实施方式中，上述四环素类似物为金霉素、土霉素、米诺环素、多西环素或强力霉素。

[0023] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述感染人永生化肝细胞后48‑72h后，换用含有筛选剂的培养基再传代培养；再传代培养的代数为3‑4代。

[0024] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述筛选剂为嘌呤霉素（puro）、腐草霉素（phleomycin）、杀稻瘟菌素（blasticidin）、潮霉素（hygb）或新霉素（neo）。

[0025] 通过所述筛选剂能够进一步筛选出成功进行所述病毒感染的细胞，有利于为后续的建立所述永生化细胞系创造良好的培养条件。

[0026] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述调节表达盒还包括和第一筛选基因、转录后调控元件和衔接元件，且肝脏特异性启动子、反义四环素激活子、衔接元件、第一筛选基
因和转录后调控元件沿5’‑3’方向依次串联；

[0027] 优选地，肝脏特异性启动子选自CMV启动子、PGK启动子、白蛋白启动子、载脂蛋白E启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α‑I‑抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白
启动子、α‑甲胎蛋白启动子、醇脱氢酶启动子、IGF‑II启动子、因子VIII启动子、HBV基础核
心蛋白启动子、HBV前s2蛋白启动子、甲状腺素‑结合球蛋白启动子、HCR‑Ap0CII的杂合启动
子、HCR‑hAAT杂合启动子、与小鼠白蛋白基因的增强子元件结合的AAT启动子、低密度脂蛋
白启动子、丙酮酸激酶启动子、卵磷脂‑胆固醇酰基转移酶启动子、载脂蛋白H启动子、铁传
递蛋白启动子、甲状腺素运载蛋白启动子、α‑纤维蛋白原及β‑纤维蛋白原的启动子、α‑I‑抗
糜蛋白酶启动子、α‑2‑HS糖蛋白启动子、触珠蛋白启动子、血浆铜蓝蛋白启动子、血纤维蛋
白溶酶原启动子、补体蛋白启动子、补体C3激活子的启动子、血液结合素启动子及α‑I‑酸性
糖蛋白启动子中的任意一种；

[0028] 第一筛选基因选自嘌呤霉素抗性基因、腐草霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。

[0029] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述四环素诱导型启动子、转录因子编码基因沿5’‑3’方向依次串联，反应表达盒还包括第二筛选基因，第二筛选基因位于转录因子编码
基因的下游；

[0030] 第二筛选基因选自真核抗性基因；

[0031] 优选地，真核抗性基因选自嘌呤霉素抗性基因、腐草霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。抗生素抗性基因(编码抗生素抗性蛋白)提供
对特定抗生素的抗性，使得只有表达这些抗性基因的细胞才能存活并繁殖。

[0032] 在本发明应用较佳的实施方式中，上述四环素诱导型启动子选自TRE3G启动子。

[0033] 本发明还提供了一种由上述方法制备的肝功能可逆的永生化肝细胞在生物人工肝反应器领域的应用。上述制备的肝功能可逆的永生化肝细胞可以作为治疗用肝细胞运用
于生物人工肝反应器中。

[0034] 本发明还提供了一种调控肝细胞转录的Tet‑on系统在制备肝功能可逆的永生化肝细胞中的应用，调控肝细胞转录的Tet‑on系统包括调节表达盒和反应表达盒，调节表达
盒包括肝脏特异性启动子和反义四环素激活子，反应表达盒包括四环素诱导型启动子和转
录因子编码基因；转录因子编码基因包括FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因。

[0035] 本发明具有以下有益效果：

[0036] 本发明将Tet‑on系统应用于肝细胞，通过改进Tet‑on系统使得肝细胞的功能得到强化。Tet‑on系统具有高效率、精准、安全和可逆性的特点。进而由此制备了一种新型的永
生化肝细胞，该肝细胞可以通过添加或去除四环素类似物实现肝细胞功能的可逆调控，促
进肝细胞可逆功能的增强。该制备方法简单易行，培养成本低，种子细胞来源于永生化细
胞，易于临床转化。

附图说明

[0037] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。

[0038] 图1为显微镜下四组细胞的形态及生长情况图；

[0039] 图2为四组细胞培养上清中ALB的ELISA检测结果统计图；

[0040] 图3为四组细胞培养上清中AAT的ELISA检测结果统计图；

[0041] 图4为四组细胞培养上清中尿素的ELISA检测结果统计图；

[0042] 图5为四组细胞培养上清中凝血因子7的ELISA检测结果统计图；

[0043] 图6为调节表达盒的载体图；

[0044] 图7为反应表达盒的载体图。

具体实施方式

[0045] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产
品。

[0046] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0047] 实施例1

[0048] 本实施例提供了一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法。所使用的调控肝细胞转录的Tet‑on系统包括调节表达盒和反应表达盒，调节表达盒包括肝脏特异性启动子和
反义四环素激活子，反应表达盒包括四环素诱导型启动子和肝细胞转录因子编码基因；肝
细胞转录因子编码基因包括FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因。调节表达盒的载体图参照
图6所示，序列参照SEQ ID NO.1所示，反应表达盒的载体图参照图7所示，序列参照SEQ ID 
NO.2所示。将上述慢病毒序列交由云舟生物科技（广州）有限公司进行病毒包装。

[0049] 制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法包括以下步骤：

[0050] （1）准备基底种子细胞：将状态良好的目的细胞（C3A，购自ATCC细胞库）接种到12 孔板，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。

[0051] （2）感染基底种子细胞：感染前，从冰箱取出并融化病毒，吸去细胞原有培养基，更5 7
换为半量的新鲜培养基，每5×10数量的人永生化肝细胞加入2.5×10数量的慢病毒液，轻
轻8 字混匀。感染后第二天（约12 小时），吸弃含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继
续37℃培养。

[0052] （3）筛选目的细胞：感染后48 小时，换上含适当浓度（工作浓度为1‑10ug/mL）的嘌呤霉素（Puromycin）的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株。每2‑3 天换含puromycin 
的完全培养液一次，至未成功转染的细胞被嘌呤霉素杀光。然后将感染并筛选后的细胞进
行传代，并继续施加嘌呤霉素进行维持性筛选培养。连续筛选并传3 代后，冻存保种稳定细
胞株。

[0053] （4）观察目的细胞：对成功转染的目的细胞以及未转染的基底种子细胞，分别使用含或者不含多西环素（购自上海碧云天生物技术有限公司）的培养基培养7天。7天后，显微
镜下观察细胞的形态及生长情况。

[0054] 实验例1

[0055] 显微镜明场图参照图1所示，图1中成功转染的目的细胞在不含多西环素的培养基培养7天后，细胞为正常状态，镜下形态为上皮细胞样，呈岛状聚集生长，标记为C3A‑FOXA3/
CEBPA/GATA6‑CTRL。而成功转染的目的细胞在含多西环素（DOX）的培养基培养7天后，镜下
细胞形态为典型的肝细胞形态（多边形），均匀平铺生长，标记为C3A‑FOXA3/CEBPA/GATA6‑
DOX1000ng‑day7。

[0056] 而未成功转染的目的细胞在不含多西环素的培养基培养7天后，细胞为正常状态，镜下形态为上皮细胞样，呈岛状聚集生长，标记为C3A‑CTRL。而未成功转染的目的细胞在含
多西环素的培养基培养7天后，镜下细胞形态维持不变，为正常状态，镜下形态为上皮细胞
样，呈岛状聚集生长，标记为C3A‑ DOX1000ng‑day7。

[0057] 结果表明转染成功细胞的形态改变是tet‑on系统打开的结果，与多西环素的刺激无关。

[0058] 实验例2

[0059] 本实验例在培养7天后，通过ELISA检测四组细胞的白蛋白（ALB）、α1‑抗胰蛋白酶（AAT）、尿素（UREA）以及凝血因子7（FVII）的合成能力，实验过程中细胞数量、培养上清体
积、培养时间不变，单一变量为细胞）。

[0060] 结果显示，当成功转染的目的细胞处于肝向功能强化状态（添加有多西环素）时，表达正常的肝细胞标志物，并且ALB（参照图2所示）、AAT（参照图3所示）、尿素（参照图4所
示）以及凝血因子7（参照图5所示）的合成能力提高。而当多西环素去除时，细胞AAT、尿素以
及凝血因子7的合成能力表现并不优秀。

[0061] 本实验例表明本发明提供的Tet‑on系统制备的肝功能可逆的永生化肝细胞具有促进肝向功能强化的效果，通过控制四环素类似物，可以实现靶向调控FOXA3/CEBPA/ 
GATA6三种肝细胞相关转录因子的表达，从控制永生化类肝细胞的可逆功能增强进程。使得
永生化类肝细胞在正常状态与肝向功能强化状态之间切换。

[0062] 针对目的细胞系C3A，本发明提供的病毒tet‑on系统，最佳效果为DOX浓度500~
1000 ng，添加培养时间为5 7天。
~

[0063] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。