一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选、制备及应用

摘要

本发明公开一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选、制备及应用，首先结合油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测将不同发酵条件下获得的发酵大麦提取物进行多级分离筛选，得到具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白。然后，根据筛选结果及该具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白的发酵条件及分离纯化条件，进行制备具有降脂活性的发酵大麦蛋白。并将该蛋白用于制备具有降脂功能的药物或保健食品，进一步开拓了大麦的营养功能及医疗价值，对大麦的进一步开发利用及大麦在医疗保健领域的应用提供了支持，具有良好的经济及社会价值。

权利要求

1.一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，其特征在于：该发酵大麦蛋白的氨基酸序列如SEQ NO:1所示；该筛选方法具体包括如下步骤：S1：制备发酵大麦提取物：将大麦籽粒粉碎脱脂后进行多级液态发酵，发酵完成后的发酵液分别离心，取上清液冻干，获得发酵大麦总提取物，以备发酵大麦蛋白筛选；所述多级液态发酵为：选取不同的发酵菌种，分别设置不同水平的料液比、发酵菌种添加量、发酵温度、发酵pH，及发酵时间；

S2：发酵大麦蛋白筛选：将制备的发酵大麦总提取物，依次进行硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析筛选，并结合油酸诱导的HepG2细胞高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白；具体操作如下：S2‑1：将发酵大麦总提取物进行蛋白含量测定及SDS‑PAGE电泳，选择蛋白含量发生显著变化且蛋白分子量分布明显不同的具备代表性的大麦提取物，采用油酸诱导的HepG2细胞高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅰ；

S2‑2：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅰ复溶，进行硫酸铵分级沉淀透析脱盐后，获得不同饱和度硫酸铵沉淀析出蛋白组分，再次对其进行SDS‑PAGE电泳，选择分子量分布明显不同的具备代表性的粗蛋白，采用油酸诱导的HepG2细胞高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅱ；

S2‑3：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅱ进行阴离子交换层析，将大麦提取物Ⅱ溶解于20mM、pH 8.0Tris‑HCl缓冲液中，上样于Q Beads 6FF阴离子交换层析柱，依次用含0M、0.1M、0.2M、0.5M、1M NaCl的起始缓冲液进行步进洗脱，洗脱液分管收集，制得发酵大麦离子交换层析各层析组分，再次采用油酸诱导的HepG2细胞高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅲ；

S2‑4：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅲ进行凝胶过滤层析，分离纯化，制得发酵大麦凝胶过滤层析组分，最后再次采用油酸诱导的HepG2细胞高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅳ，该大麦提取物Ⅳ即为具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白；所述的凝胶过滤层析选用Superdex 75 increase 10/300 GL 高分辨率预装柱和AKTApurifier纯化系统，上样体积为500ul，洗脱液为20mM pH8.0 的Tris‑HCl缓冲液，流速0.4‑0.8ml/min，按照出峰位置获得不同分子量的蛋白组分，将所得组分超滤脱盐，冻干，制得发酵大麦凝胶过滤层析组分；

S3：发酵大麦蛋白鉴定：将筛选的发酵大麦蛋白进行鉴定分析，确定筛选的具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白为单一蛋白LFBE‑P1，其具体氨基酸序列如SEQ NO:1所示。

2.一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）确定发酵条件：根据权利要求1所述的筛选方法，确定含有该具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白LFBE‑P1的发酵条件为：发酵料液比1：7，菌种为植物乳杆菌LP‑1，每克大麦粉添

7 7

加植物乳杆菌的量为7×10 9×10cfu，发酵温度为31℃，时间为24h；

~

2）大麦发酵：根据确定的发酵条件进行大麦籽粒发酵，并冻干，制得发酵大麦总提取物；

3）发酵大麦蛋白提取纯化：将制得的发酵大麦总提取物进行提取纯化，获得具有降脂活性的发酵大麦蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO:1所示；所述提取纯化的操作方法与权利要求1中步骤S2所述的发酵大麦蛋白筛选方法一致。

3.一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的应用，其特征在于：将根据权利要求2所述的制备方法获得具有降脂活性的发酵大麦蛋白产品用于制备具有降脂功能的药物。

说明书

一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选、制备及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选、制备及应用。

背景技术

[0002] 大麦是我国主要的种植作物之一，其主要用于啤酒酿造及用作牲畜铺草或粗饲料。研究发现，大麦中含有丰富的功能性蛋白质和多肽，涵盖了人类对氨基酸的大部分需求，是开发健康谷物食品的宝贵资源。

[0003] 然而，大麦蛋白的溶解性较差，难以被人体吸收及利用。已有研究发现，通过乳酸菌发酵，大麦的水溶性蛋白的含量增加，且发酵后的大麦蛋白的营养功能得到改善。经研究发现，发酵后的大麦蛋白能够抑制脂肪细胞内脂滴的合成，降低脂肪细胞的分化率，由此可见，大麦经过生物发酵，产生了具有降脂生物活性功能的蛋白。然而，如何筛选及鉴定该具有降脂生物活性功能的物质为何种蛋白，对于大麦新功能的开发及利用具有重要的意义。且由于这种具有降脂生物活性功能的蛋白是大麦发酵后的产物，而影响发酵生产的因素又是多方面的，如何确定这些因素及如何更好地分离大麦发酵产物中的降脂蛋白，以达到更好地制备具有降脂活性的发酵大麦蛋白，也是亟待解决的技术问题。

发明内容

[0004] 针对上述存在的问题及为了达到上述的目的，本申请提供一种降脂大麦蛋白的筛选、鉴定及制备方法，首先结合油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测将不同发酵条件下获得的发酵大麦提取物进行多级分离筛选，得到具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白。然后，根据筛选结果及该具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白的发酵条件及分离纯化条件，进行制备具有降脂活性的发酵大麦蛋白。并将该蛋白用于制备具有降脂功能的药物或保健食品，进一步开拓了大麦的营养功能及医疗价值。具体技术方案如下：

[0005] 首先，本发明提供一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，包括如下步骤：

[0006] S1：制备发酵大麦提取物：将大麦籽粒粉碎脱脂后进行多级液态发酵，发酵完成后的发酵液分别离心，取上清液冻干，获得发酵大麦总提取物，以备降脂蛋白蛋白筛选；

[0007] S2：降脂蛋白筛选：将制备的发酵大麦总提取物，依次进行硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析筛选，并结合油酸诱导的HepG2细胞高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白；

[0008] S3：降脂蛋白鉴定：将筛选的降脂蛋白进行鉴定分析，确定筛选的具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白的具体氨基酸序列及相关的生物学信息。

[0009] 前述的具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，步骤S1中所述的多级液态发酵为：选取不同的发酵菌种，分别设置不同水平的料液比、发酵菌种添加量、发酵温度及发酵pH，分别发酵0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、48h，用于制备发酵大麦总提取物，以备降脂蛋白蛋白筛选。

[0010] 前述的具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，步骤S2中所述的降脂蛋白筛选的具体操作为：

[0011] S2‑1：将发酵大麦提取物进行蛋白含量测定及SDS‑PAGE电泳，选择蛋白含量发生显著变化且蛋白分子量分布明显不同的具备代表性的大麦提取物进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅰ；

[0012] S2‑2：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅰ进行硫酸铵分级沉淀，获得不同硫酸铵饱和度的粗蛋白，对其进行SDS‑PAGE电泳，选择分子量分布明显不同的具备代表性的粗蛋白进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅱ；

[0013] S2‑3：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅱ进行阴离子交换层析，获得各层析组分，再次进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅲ；

[0014] S2‑4：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅲ进行凝胶过滤层析，分离纯化，制得发酵大麦凝胶过滤层析组分，最后再次进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅳ，该大麦提取物Ⅳ即为具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白。

[0015] 前述的具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，步骤S2‑1中所述进行降脂活性检测为选择0h、4h、8h、16h、24h、48h六个时间段的发酵大麦提取物。

[0016] 前述的具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，步骤S2‑2中所述的硫酸铵分级沉淀，将大麦提取物Ⅰ复溶，进行硫酸铵分级沉淀透析脱盐后，获得不同饱和度硫酸铵沉淀析出蛋白组分，选择分子量分布不同的硫酸铵沉淀析出组分对其进行降脂活性检测。

[0017] 前述的具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，步骤S2‑3中所述的阴离子交换层析，将大麦提取物Ⅱ溶解于20mM、pH 8.0Tris‑HCl缓冲液中，上样于Q Beads 6FF阴离子交换层析柱，依次用含0M、0.1M、0.2M、0.5M、1M NaCl的起始缓冲液进行步进洗脱，洗脱液分管收集，制得发酵大麦离子交换层析各层析组分。

[0018] 前述的具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，步骤S2‑4中所述的凝胶过滤层析选用Superdex 75 increase 10/300GL高分辨率预装柱和AKTApurifier纯化系统，上样体积为500ul，洗脱液为20mM pH8.0的Tris‑HCl缓冲液，流速0.4‑0.8ml/min，按照出峰位置获得不同分子量的蛋白组分，将所得组分超滤脱盐，冻干，制得发酵大麦凝胶过滤层析组分。

[0019] 前述的具有降脂活性的发酵大麦蛋白的筛选方法，步骤S3中所述的降脂蛋白鉴定包括SDS‑PAGE电泳分析和质谱分析；SDS‑PAGE电泳分析确定筛选到的发酵大麦蛋白为单一蛋白LFBE‑P1；经质谱分析获得该发酵大麦蛋白LFBE‑P1的理论分子量为48KDa，其等电点为6.61，其氨基酸序列为MVPKSKPKLNPVSHFRPRALKTRENSIFQSALFPSTLTTAQRTTTPAMATTLATDVRLSIAHQTRFALRLASAISSNPERAAGNVAFSPLSLHVALSLITAGAGGATRDQVAILGDGGAGDAKELNALAEQVVQFVLANESSTGGPRIAFANGIFVDASLSLKPSFEELAVCQYKAKTQSVDFQHKTLEAVGQVNSWVEQVTTGLIKQILPPGSVDNTTKLVLGNALYFKGAWDQKFDESNTKCDSFHLLDGSSIQTQFMSSTKKQYISSSDNLKVLKLPYAKGHDKRQFSMYILLPGAQDGLWSLAKRLSTEPEFIENHIPKQTVEVGRFQLPKFKISYQFEASSLLRALGLQLPFSEEADLSEMVDSSQGLEISHVFHKSFVEVNEEGTEAGAATVAMGVAMSMPLKVDLVDFVANHPFLFLIREDIAGVVVFVGHVTNPLISA，氨基酸覆盖率为63％。

[0020] 其次，本申请提供一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的制备方法，包括如下步骤：

[0021] 1)确定发酵条件：根据前述的筛选方法筛选得到的具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白确定其发酵、提取及纯化制备的最佳发酵条件：发酵料液比1：7，菌种为植物乳杆菌LP‑7 7
1，每克大麦粉添加植物乳杆菌的量为7×10～9×10cfu，发酵初始pH值为5，发酵温度为31℃，时间为24h；

[0022] 2)大麦发酵：根据确定的制备降脂蛋白的最佳发酵条件进行大麦籽粒发酵，并冻干，制得发酵大麦总提取物；

[0023] 3)降脂蛋白提取纯化：将制得的发酵大麦总提取物采用前述的降脂蛋白筛选操作方法进行提取纯化，获得具有降脂活性的发酵大麦蛋白产品。

[0024] 再次，本申请提供一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白的应用，将通过前述的制备方法制备的具有降脂活性的发酵大麦蛋白产品用于制备具有降脂功能的药物或保健食品。

[0025] 本发明的有益效果是：

[0026] 本发明结合油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测将不同发酵条件下获得的发酵大麦提取物进行多级分离筛选，得到具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白。然后，根据筛选结果及该具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白的发酵条件及分离纯化条件，进行制备具有降脂活性的发酵大麦蛋白。并将该蛋白用于制备具有降脂功能的药物或保健食品，进一步开拓了大麦的营养功能及医疗价值。

[0027] 本发明采用硫酸铵分级沉淀获得具备最佳降脂能力的析出蛋白组分；然后再将该析出蛋白组分进行阴离子交换层析，获得具备最佳降脂能力的层析蛋白组分；最后将层析蛋白组分进行凝胶过滤层析，进一步分离纯化；筛选得到了具有显著降脂活性发酵大麦蛋白LFBE‑P1，并分析获得该蛋白的氨基酸序列、分子量、等电点等信息，其氨基酸覆盖率为63％。

[0028] 2、本发明采用植物乳杆菌Lp‑1发酵改善大麦蛋白的营养性能，并获得了制备发酵大麦降脂蛋白质的最佳发酵条件和提取纯化方法，应用前景广阔。

[0029] 3、经验证本发明发酵大麦蛋白LFBE‑P1具有显著的降脂功能，可明显降低油酸诱导HepG2细胞的脂质积累，LFBE‑P1作为新型天然的高活性降脂蛋白，可广泛用于保健食品与医药健康领域，具有良好的经济及社会价值。

附图说明

[0030] 图1为本发明不同发酵时间大麦提取物SDS‑PAGE电泳分子量分布图；

[0031] 图2为本发明不同发酵时间大麦提取物蛋白含量图；

[0032] 图3为本发明不同硫酸铵饱和度的粗蛋白SDS‑PAGE电泳分子量分布图；

[0033] 图4为本发明阴离子交换层析各组分SDS‑PAGE电泳分子量分布图；

[0034] 图5为本发明发酵大麦蛋白LFBE‑P1、LFBE‑P2、LFBE‑P3对油酸诱导HepG2细胞甘油三酯(TG)的影响；

[0035] 其中，空白组‑未经油酸诱导，模型组‑油酸诱导，LFBE‑P1‑油酸+LFBE‑P1，LFBE‑P2‑油酸+LFBE‑P2，LFBE‑P3‑油酸+LFBE‑P3；

[0036] 图6为本发明HepG2细胞的油红O染色图；

[0037] 其中，空白组‑未经油酸诱导，模型组‑油酸诱导，LFBE‑P1‑油酸+LFBE‑P1，LFBE‑P2‑油酸+LFBE‑P2，LFBE‑P3‑油酸+LFBE‑P3；

[0038] 图7为本发明LFBE‑P1、LFBE‑P2、LFBE‑P3对油酸诱导HepG2细胞总脂质的影响；

[0039] 其中，空白组‑未经油酸诱导，模型组‑油酸诱导，LFBE‑P1‑油酸+LFBE‑P1，LFBE‑P2‑油酸+LFBE‑P2，LFBE‑P3‑油酸+LFBE‑P3；

[0040] 图8为本发明发酵大麦蛋白LFBE‑P1的SDS‑PAGE分子量分布图。

具体实施方式

[0041] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

[0042] 实施例1

[0043] 本实施例为筛选一种具有降脂活性的发酵大麦蛋白，具体包括如下步骤：

[0044] S1：制备发酵大麦提取物：将大麦籽粒粉碎后过80目筛，制得大麦全粉；将所得大麦粉采用正己烷进行脱脂，按料液质量体积比1:3进行，室温下磁力搅拌2h后，抽滤，重复以上操作2～3次，将得到的大麦粉于37℃烘箱中烘干即得脱脂大麦粉；将得脱脂大麦粉进行液态发酵。根据现有的文献报告，发酵大麦可改善大麦蛋白的营养功能，但由于菌的种类较多，且各种发酵菌的发酵作用及结果还受到发酵时添加的量、料液比、发酵的温度、时间及pH值等因素的影响。经实验经验表明，发酵的条件中：发酵菌添加量、发酵的温度和时间对大麦发酵后的降脂活性影响最大。为了找出发酵的大麦产物中具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白，同时确定产生该具备最佳降脂蛋白的最佳发酵条件，以备后续的制备生产，本实施例进行了如表1所示的发酵实验设计。

[0045] 表1.发酵实验设计

[0046]

[0047] 本实施例采用植物乳杆菌LP‑1、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌四种发酵菌进行实验；设定每克大麦粉添加发酵菌的量为2×107、3×107、4×107～9×107cfu，共8个水平；设定料液比(大麦(g):水(ml))，1:3、1:4、1:5～1:9，共7个水平；设定发酵温度21～37℃，每2℃一个水平级别，共9个水平。每个实验因素每个水平均设置三个平行实验。按上述的实验设计分别进行发酵0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、48h。发酵完成后，10000rpm离心30min，收集上清，冻干，获得的发酵大麦总提取物，以备降脂蛋白蛋白筛选。

[0048] S2：降脂蛋白筛选：将制备的发酵大麦总提取物，依次进行硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析筛选，并结合油酸诱导的HepG2细胞高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白。具体操作如下：

[0049] S2‑1：将发酵大麦提取物进行蛋白含量测定及SDS‑PAGE电泳，选择具备代表性的提取物以备进一步筛选。如图1和图2所示的，发酵能够使大分子蛋白分解为更多的小分子物质，提取物中的蛋白含量及蛋白分子量分布随着发酵时间的增长而出现明显变化，发酵8h开始提取物中大分子蛋白开始分解成更小分子量的蛋白质且在发酵24h时蛋白含量达到最高；并且发酵时间达到16h时其分子量分布基本不再发生变化；且随着发酵时间的增长，蛋白含量增多，在发酵24h时蛋白含量增长趋于稳定，48h由于时间过长，蛋白含量有所下降。经检测选择0h、4h、8h、16h、24h、48h六个时间段的发酵大麦提取物，采用油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测，即通过测定加药后细胞内甘油三酯含量并通过油红O染色考察各发酵时间下大麦提取物的降脂活性，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅰ，以备进一步筛选。

[0050] S2‑2：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅰ复溶后进行硫酸铵分级沉淀，透析脱盐，获得不同硫酸铵饱和度的粗蛋白，然后对其进行SDS‑PAGE电泳，如图3所示，10％、20％硫酸铵饱和度下的粗蛋白的以25KDa以下的小分子蛋白为主，而40％、80％硫酸铵饱和度下的粗蛋白的分子量分布与前两者差异明显，但彼此的分子量分布基本相同。由于蛋白质的结构对其功能具备决定作用，而不同分子量的蛋白质的氨基酸序列也有所不同，而氨基酸序列与其生物学功能密切相关，因此根据其分子量分布差异选择具备代表性的硫酸铵饱和度的粗蛋白对其进行降脂活性检测；同样采用油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测，通过测定加药后细胞内甘油三酯含量并通过油红O染色考察各析出蛋白组分的降脂活性，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅱ，以备进一步筛选。

[0051] S2‑3：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅱ进行阴离子交换层析筛选，采用预处理过的Q Beads 6FF填料装柱后，将具备最佳降脂能力的析出蛋白组分溶解于20mM、pH 8.0Tris‑HCl缓冲液中，上样于Q Beads 6FF阴离子交换层析柱，大麦提取物Ⅱ流经层析柱时，不与层析柱中树脂结合的蛋白组分直接流出，与之结合的蛋白组分则需要提高溶液中相反离子浓度或降低蛋白质所带电荷数等方法从树脂上洗脱下来，因此依次用含0M、0.1M、0.2M、0.5M、1M NaCl的起始缓冲液进行步进洗脱，洗脱液分管收集，分别检测各管中的蛋白含量，获得各层析组分。再次采用油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测，通过测定加药后细胞内甘油三酯含量并通过油红O染色考察各析出蛋白组分的降脂活性，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅲ，以备进一步筛选；

[0052] S2‑4：将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅲ最后进行凝胶过滤层析筛选，进一步分离纯化。为了获得较佳的分离效果，本实施例中选用GE的Superdex 75 increase 10/300GL高分辨率预装柱，采用AKTApurifier纯化系统(美国GE公司)，上样体积为500ul，洗脱液为20mM pH8.0的Tris‑HCl缓冲液，流速0.4‑0.8ml/min，凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。大麦提取物Ⅲ流经凝胶过滤层析柱时，大分子蛋白组分最早流出柱子，中等大小的蛋白质可以进人填料分子中较大的孔内，因此中等大小的蛋白质晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬人所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。因此可按照出峰位置获得不同分子量的蛋白组分，将所得组分超滤脱盐，冻干，制得发酵大麦凝胶过滤层析组分。

[0053] 将获得的层析组分进行SDS‑PAGE电泳分析图如4所示，获得了分子量分布各不相同的三个层析组分LFBE‑P1、LFBE‑P2、LFBE‑P3；最后再次进行降脂活性检测。首先将获得的发酵大麦蛋白LFBE‑P1、LFBE‑P2、LFBE‑P3对油酸诱导HepG2细胞甘油三酯(TG)的影响，如图5所示，(空白组‑未经油酸诱导，模型组‑油酸诱导，LFBE‑P1‑油酸+LFBE‑P1，LFBE‑P2‑油酸+LFBE‑P2，LFBE‑P3‑油酸+LFBE‑P3)；结果显示，与模型组相比，LFBE‑P1、LFBE‑P2、LFBE‑P3均具备一定的降脂能力，而LFBE‑P1降脂效果最优。图6为HepG2细胞的油红O染色图(空白组‑未经油酸诱导，模型组‑油酸诱导，LFBE‑P1‑油酸+LFBE‑P1，LFBE‑P2‑油酸+LFBE‑P2，LFBE‑P3‑油酸+LFBE‑P3)；显然，与模型组相比，LFBE‑P1红色区域显著减少，说明LFBE‑P1明显降低油酸诱导HepG2细胞的脂质积累。图7为LFBE‑P1、LFBE‑P2、LFBE‑P3对油酸诱导HepG2细胞总脂质的影响(空白组‑未经油酸诱导，模型组‑油酸诱导，LFBE‑P1‑油酸+LFBE‑P1，LFBE‑P2‑油酸+LFBE‑P2，LFBE‑P3‑油酸+LFBE‑P3)，结果也显示，与模型组相比，LFBE‑P1组的总脂质显著降低，且明显优于其他组分。因此通过测定加药后细胞内甘油三酯含量并通过油红O染色考察各析出蛋白组分的降脂活性，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅳ，该大麦提取物Ⅳ即为具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白。

[0054] S3：降脂蛋白鉴定：将筛选的降脂蛋白进行鉴定分析，包括SDS‑PAGE电泳分析和质谱分析；SDS‑PAGE电泳分析如图5所示，发酵大麦蛋白LFBE‑P1为单一条带，说明其为纯蛋白。然后进行质谱分析获得该发酵大麦蛋白的理论分子量为48KDa，其等电点为6.61，其氨基酸序列为MVPKSKPKLNPVSHFRPRALKTRENSIFQSALFPSTLTTAQRTTTPAMATTLATDVRLSIAHQTRFALRLASAISSNPERAAGNVAFSPLSLHVALSLITAGAGGATRDQVAILGDGGAGDAKELNALAEQVVQFVLANESSTGGPRIAFANGIFVDASLSLKPSFEELAVCQYKAKTQSVDFQHKTLEAVGQVNSWVEQVTTGLIKQILPPGSVDNTTKLVLGNALYFKGAWDQKFDESNTKCDSFHLLDGSSIQTQFMSSTKKQYISSSDNLKVLKLPYAKGHDKRQFSMYILLPGAQDGLWSLAKRLSTEPEFIENHIPKQTVEVGRFQLPKFKISYQFEASSLLRALGLQLPFSEEADLSEMVDSSQGLEISHVFHKSFVEVNEEGTEAGAATVAMGVAMSMPLKVDLVDFVANHPFLFLIREDIAGVVVFVGHVTNPLISA，氨基酸覆盖率为63％。

[0055] 实施例2

[0056] 本实施例为制备具有降脂活性的发酵大麦蛋白，具体包括如下步骤：

[0057] 1)确定发酵条件：根据实施例1所述的筛选方法筛选得到的具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白确定其发酵、提取及纯化制备的最佳发酵条件：发酵料液比1：7，菌种为植物乳杆菌LP‑1，每克大麦粉添加植物乳杆菌的量为7×107～9×107cfu，发酵初始pH值为5，发酵温度为31℃，时间为24h。

[0058] 2)大麦发酵：根据确定的制备降脂蛋白的最佳发酵条件进行大麦籽粒发酵，并冻干，制得发酵大麦总提取物(具体如实施例1中的方法)；

[0059] 3)降脂蛋白提取纯化：将制得的发酵大麦总提取物进行提取纯化，具体操作如下：

[0060] 3.1将发酵大麦总提取物进行采用油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物A。

[0061] 3.2将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物A复溶后进行硫酸铵分级沉淀，透析脱盐，获得不同硫酸铵饱和度的粗蛋白，然后对其进行SDS‑PAGE电泳，根据其分子量分布差异选择具备代表性的硫酸铵饱和度的粗蛋白对其进行降脂活性检测，再采用油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物B；

[0062] 3.3将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物B进行阴离子交换层析筛选，与实施例1相同采用预处理过的Q Beads 6FF填料装柱后，将具备最佳降脂能力的析出蛋白组分溶解于20mM、pH 8.0Tris‑HCl缓冲液中，上样于Q Beads 6FF阴离子交换层析柱，依次用不同离子强度的缓冲液进行阶段性洗脱，洗脱液分管收集，分别检测各管中的蛋白含量，获得各层析组分。再次采用油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物C；

[0063] 3.4将获得的具备最佳降脂能力的大麦提取物Ⅲ最后进行凝胶过滤层析筛选，进一步分离纯化。同样选用GE的Superdex 75 increase 10/300GL高分辨率预装柱，采用AKTApurifier纯化系统(美国GE公司)，上样体积为500ul，洗脱液为20mM pH8.0的Tris‑HCl缓冲液，流速0.4‑0.8ml/min，并按照出峰位置分为高分子量组分和低分子量组分，将所得组分超滤脱盐，冻干，制得发酵大麦凝胶过滤层析组分。最后再次采用油酸诱导的HepG2高脂模型进行降脂活性检测，获得具备最佳降脂能力的大麦提取物D。该大麦提取物D经SDS‑PAGE电泳分析和质谱分析检测即为实施例1中筛选的具备最佳降脂能力的发酵大麦蛋白LFBE‑P1。将该发酵大麦蛋白LFBE‑P1作为新型天然的高活性降脂蛋白，可广泛用于保健食品与医药健康领域，具有很好的应用前景。

[0064] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。