一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法转让专利
申请号 : CN202111394911.3
文献号 : CN114097615B
文献日 : 2022-10-04
发明人 : 陈学军 , 李勇 , 童治军 , 焦芳婵 , 冯智宇 , 吴兴富 , 杨大海 , 白戈 , 肖炳光 , 何彬 , 方敦煌 , 李永平
申请人 : 云南省烟草农业科学研究院
摘要 :
本发明公开了一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法，利用组培方法，克服烟草远缘杂交II型致死因子，创制出高含量甲基戊酸的育种种质。研究结果表明：因远缘杂交II型致死因子的存在，杂交种常温下难以存活。35℃环境下，杂交种可以正常生活。采用组培诱芽并连续继代方法，克服上述致死因子，并获得常温下的存活杂交种。SSR标记及形态鉴别表明，该杂交种来自上述两种亲本。杂交种经染色体加倍后，杂交种花粉萌发并自交和回交正常结子，获得了戊酸含量得到提高的种质。该种质的回交材料田间试验表明，甲基戊酸可稳定遗传，且烤后烟叶的3‑甲基戊酸及4‑及甲基戊酸含量显著高于对照。
权利要求 :
1.一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法，其特征在于：包括：材料选择、远缘杂交、远缘杂交致死因子克服、杂交材料形态及SSR标记鉴别、成活杂交种染色体加倍、回交2代材料田间比较试验；
所述材料选择：选用材料为红花大金元、云烟87与烟草野生种簇叶烟草(Nicotiana umbratica)，烟草野生种簇叶烟草中戊酸含量指3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，红花大金元与云烟87以T表示，烟草野生种簇叶烟草(Nicotiana umbratica)以U表示，上述材料均由云南省烟草农业科学研究院提供；
所述远缘杂交：在现蕾初期，开展以T为母本且U为父本的正向杂交，同时做以U为母本且T为父本的反向杂交，正向及反向的杂交组合做3次重复，每个重复杂交15个花蕾，杂交后
10d统计坐果率，杂交后10天以所结蒴果数与总的杂交数的比值统计坐果率；获得的杂交种即为F1远缘杂交种，在催芽播种后第5d统计发芽率，分3次重复，每重复播种200粒，第25d统计存活率，存活率为存活的幼苗数与出苗数的比值；
所述远缘杂交致死因子克服：配制MS培养基，无菌条件下播种F1远缘杂交种，将其中一半的无菌苗放置于35℃环境下培养，另一半放置于25℃组培培养室内，无菌苗生长28d后，分别取两种环境下的叶片作外植体，进行丛生芽诱导培养，25℃及35℃环境下的叶片外植体各接种48个外植体，在25℃组培培养室进行离体扩繁，培养基为MS+KT3.0mg/l+NAA
0.5mg/l+0.7％琼脂粉+2％蔗糖，组培芽诱导在室温为25℃，14h光照环境下进行，分别诱导培养30d后，调查外植体是否有绿色芽点冒出，每个外植体绿色芽点数占总外植体数的比率即为芽点诱导率；之后，将绿色芽点挑出，无菌条件下培养30d观察丛生芽生长情况，之后继续继代培养，找出最少继代次数下，获得再生植株即为已克服远缘杂交致死因子的杂交种，并能够在常温下正常生长；
所述杂交材料形态及SSR标记鉴别：对杂交亲本及杂交种开展了形态学、SSR分子标记检测；形态方面开展了叶形、花色等形态特征的比较；并开展了SSR鉴别分析，PCR扩增体系为20μL，其中15‑30ng/μL DNA样品1.5uL、10×PCR Reaction Buffer2μL、Reaction Buffer
2+
含Mg plus，25mmol/L dNTPs 1.2μL、10μmol/L正反向引物各2μL、rTaq 0.75U，最后用ddH2O补足20μL；PCR程序：95℃变性5min，接着95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，之后72℃5min，4℃保存，筛选出最适引物进行SSR分子鉴别；
所述成活杂交种染色体加倍：以MS为基本培养基，取致死因子克服并开花的杂交种中部叶片中脉无菌处理后，接种在MS+KT 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L的诱芽培养基中，待丛生芽长至3cm时，接种丛生芽到MS+IBA 0.8mg/L诱根培养基，如此继代培养2次后，以花粉萌发初步检测其杂交植株育性，花粉培养基为20ml的去离子水中，依次加入2g蔗糖、0.003g硼酸及
0.4g琼脂，加热溶解后涂布于盖玻片，培养基凝固后将待测花粉抖在培养基表明，置于组培室3h后即可静检观察花粉管是否萌发；组培室培养温度为25℃，每日光照14h，培养架隔板中心光照度为3600lx，获得染色体加倍的杂交种，测定其3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，明确其为戊酸含量显著提高的种质；以该种质为父本，红大、云烟87烤烟品种为母本，获得回交1代材料，在回交1代材料烟叶旺长期取新鲜叶片，测定烟叶中3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，来确定进行后续回交的目标单株；
所述回交2代材料田间比较试验：分别以红大及云烟87为母本，回交1代材料为父本，获得回交2代材料，该回交材料进行田间种植，取旺长期新鲜烟样与烤后烟叶，测定比较两种类型烟样的3‑甲基戊酸与4‑甲基戊酸含量变化，从中筛选到农艺性状接近烤烟并能用于下一步持续回交自交且甲基戊酸含量明显提高的种质资源。
2.根据权利要求1所述的一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法，其特征在于：所述3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量分析：取1克的待测样品，放置于
100ml的平底烧瓶中，加入40ml的5％硫酸+甲醇及200μl己二酸内标溶液，烧瓶接冷凝管，在
60℃中回流2h，冷却至室温，取回流液体10ml于100ml的粉液漏斗中，加入20ml蒸馏水混匀，每次用10ml二氯甲烷萃取，萃取3次，合并萃取液，加入3.5g无水硫酸钠过夜，取适量上层澄清萃取液进行气相色谱分析。
3.根据权利要求1所述的一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法，其特征在于：所述最适合引物为：
TM100F5’‑TGGAGGAACCAACAAGGAAG‑3’,TM100R5’‑GTCCGACAGTATCTTCGCAA‑3’。
说明书 :
一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种
质的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及烟草技术领域，具体涉及一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法。
背景技术
[0002] 云南是烤烟生产大省，近几年烤烟种植面积及烟叶产量都占全国30％以上，烟叶收入是烟农增收的主要途径。在烟叶生产上，一直存在烤烟品种遗传基础狭窄，遗传多样性低的问题，狭窄的遗传基础限制了烤烟品种的品质、抗性的提高，成为选育突破性品种瓶颈。与野生烟草开展远缘杂交育种，是拓宽烟草遗传基础的有效手段之一。烟草是较早开展远缘杂交研究的作物之一，但迄今未见栽培烟草中转育挥发性有机酸的报道。利用远缘杂交、组培克服杂交致死因子及染色体加倍技术，获得了烤烟与簇叶烟草的远缘杂交种，并使杂交种后代育性得以恢复，获得了回交1代材料。并开展了烘烤后的F1材料及回交1代材料的3‑甲基戊酸和4‑甲基戊酸含量测定。开展对充分的利用和挖掘野生烟草资源的品质相关性状，创造新的品质相关种质和杂交桥梁材料，推动现有烤烟主栽品种的遗传改良有重要意义。
[0003] 因此，提供一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法，解决的问题。
[0005] 为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法，包括：材料选择、远缘杂交、远缘杂交致死因子克服、杂交材料形态及SSR标记鉴别、成活杂交种染色体加倍、回交2代材料田间比较试验。
[0007] 进一步的；所述材料选择：选用材料为红花大金元、云烟87与烟草野生种簇叶烟草(Nicotiana umbratica)，烟草野生种簇叶烟草中戊酸含量指3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，红花大金元与云烟87以T表示，烟草野生种簇叶烟草(Nicotiana umbratica)以U表示，上述材料均由云南省烟草农业科学研究院提供。
[0008] 进一步的；所述远缘杂交：在现蕾初期，开展以T为母本且U为父本的正向杂交，同时做以U为母本且T为父本的反向杂交，正向及反向的杂交组合做3次重复，每个重复杂交15个花蕾，杂交后10d统计坐果率，杂交后10天以所结蒴果数与总的杂交数的比值统计坐果率；获得的杂交种即为F1远缘杂交种，在催芽播种后第5d统计发芽率，分3次重复，每重复播种200粒，第25d统计存活率，存活率为存活的幼苗数与出苗数的比值。
[0009] 进一步的；所述远缘杂交致死因子克服：配制MS培养基，无菌条件下播种F1远缘杂交种，将其中一半的无菌苗放置于35℃环境下培养，另一半放置于25℃组培培养室内，无菌苗生长28d后，分别取两种环境下的叶片作外植体，进行丛生芽诱导培养，25℃及35℃环境下的叶片外植体各接种48个外植体，在25℃组培培养室进行离体扩繁，培养基为MS+KT3.0mg/l+NAA 0.5mg/l+0.7％琼脂粉+2％蔗糖，组培芽诱导在室温为25℃，14h光照环境下进行，分别诱导培养30d后，调查外植体是否有绿色芽点冒出，每个外植体绿色芽点数占总外植体数的比率即为芽点诱导率；之后，将绿色芽点挑出，无菌条件下培养30d观察丛生芽生长情况，之后继续继代培养，找出最少继代次数下，获得再生植株即为已克服远缘杂交致死因子的杂交种，并能够在常温下正常生长。
[0010] 进一步的；所述杂交材料形态及SSR标记鉴别：对杂交亲本及杂交种开展了形态学、SSR分子标记检测；形态方面开展了叶形、花色等形态特征的比较；并开展了SSR鉴别分2+
析，PCR扩增体系为20μL，其中15‑30ng/μL DNA样品1.5uL、10×PCR Reaction Buffer(Mgplus)2μL、25mmol/L dNTPs 1.2μL、10μmol/L正反向引物各2μL、rTaq 0.75U，最后用ddH2O补足20μL。PCR程序：95℃变性5min，接着95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，之后72℃5min，4℃保存，筛选出最适引物进行SSR分子鉴别。
析，PCR扩增体系为20μL，其中15‑30ng/μL DNA样品1.5uL、10×PCR Reaction Buffer(Mgplus)2μL、25mmol/L dNTPs 1.2μL、10μmol/L正反向引物各2μL、rTaq 0.75U，最后用ddH2O补足20μL。PCR程序：95℃变性5min，接着95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，之后72℃5min，4℃保存，筛选出最适引物进行SSR分子鉴别。
[0011] 进一步的；成活杂交种染色体加倍：以MS为基本培养基，取致死因子克服并开花的杂交种中部叶片中脉无菌处理后，接种在MS+KT 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L的诱芽培养基中，待丛生芽长至3cm时，接种丛生芽到MS+IBA 0.8mg/L诱根培养基，如此继代培养2次后，以花粉萌发初步检测其杂交植株育性，花粉培养基为20ml的去离子水中，依次加入2g蔗糖、0.003g硼酸及0.4g琼脂，加热溶解后涂布于盖玻片，培养基凝固后将待测花粉抖在培养基表明，置于组培室3h后即可静检观察花粉管是否萌发；组培室培养温度为25℃，每日光照14h，培养架隔板中心光照度为3600lx，获得染色体加倍的杂交种，测定其3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，明确其为戊酸含量显著提高的种质。以该种质为父本，红大、云烟87烤烟品种为母本，获得回交1代材料，在回交1代材料烟叶旺长期取新鲜叶片，测定烟叶中3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，来确定进行后续回交的目标单株。
[0012] 进一步的；所述回交2代材料田间比较试验：分别以红大及云烟87为母本，回交1代材料为父本，获得回交2代材料，该回交材料进行田间种植，取旺长期新鲜烟样与烤后烟叶，测定比较两种类型烟样的3‑甲基戊酸与4‑甲基戊酸含量。
[0013] 进一步的；所述3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量分析：取1克的待测样品，放置于100ml的平底烧瓶中，加入40ml的5％硫酸+甲醇及200μl己二酸内标溶液，烧瓶接冷凝管，在
60℃中回流2h，冷却至室温，取回流液体10ml于100ml的粉液漏斗中，加入20ml蒸馏水混匀，每次用10ml二氯甲烷萃取，萃取3次，合并萃取液，加入3.5g无水硫酸钠过夜，取适量上层澄清萃取液进行气相色谱分析。
60℃中回流2h，冷却至室温，取回流液体10ml于100ml的粉液漏斗中，加入20ml蒸馏水混匀，每次用10ml二氯甲烷萃取，萃取3次，合并萃取液，加入3.5g无水硫酸钠过夜，取适量上层澄清萃取液进行气相色谱分析。
[0014] 进一步的；所述最适合引物为：TM100F5’‑TGGAGGAACCAACAAGGAAG‑3’,TM100R5’‑GTCCGACAGTATCTTCGCAA‑3’。
[0015] 1、利用组培手段，诱芽培养长出绿色芽点后，再连续两次芽继代培养，克服杂交致死因子，获得常温存活杂交种。
[0016] 2、首次获得了簇叶烟草与栽培烟草的杂交种，并将与品质相关的甲基戊酸成功转育到栽培烟草中；
[0017] 3、远缘杂交种育性得到恢复，回交后代材料中甲基戊酸能够稳定遗传。
附图说明
[0018] 图1为本发明远缘杂交正、反交座果率比较图。
[0019] 图2为本发明两次继代组培图。
[0020] 图3为本发明表型鉴别图。
[0021] 图4为本发明杂交种SSR标记检测图。
[0022] 图5为本发明加倍后的花药正常萌发与植株图。
具体实施方式
[0023] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024] 实施例1：
[0025] 一种应用组培技术克服远缘杂交II型致死并提高戊酸含量种质的方法，包括：材料选择、远缘杂交、远缘杂交致死因子克服、杂交材料形态及SSR标记鉴别、成活杂交种染色体加倍、回交2代材料田间比较试验；利用组培方法，克服烟草远缘杂交II型致死因子，创制出高含量戊酸，结果表明以染色体较少的簇叶烟为母本，烤烟品种红大为父本，其杂交种坐果率为75.8％，而反交坐果率为0。因远缘杂交II型致死因子的存在，杂交种常温下难以存活。35℃环境下，杂交种可以正常生活。采用组培诱芽连续继代方法，克服上述致死因子，并获得常温下的存活杂交种。SSR标记及形态鉴别表明，该杂交种来自上述两种亲本。杂交种经染色体加倍后，杂交种花粉萌发并自交和回交正常结子。取烤后的加倍杂交种叶片，测定的3‑甲基戊酸及4甲基戊酸含量分别为350.58μg/g和278.91μg/g，明显高于栽培品种红大和云烟87(表2)，获得了戊酸含量明显提高的种质。该种质的回交2代材料田间试验表明，甲基戊酸可稳定遗传，且烤后烟叶的3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量显著高于对照。戊酸含量是通过3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量进行分析。
[0026] 实施例2：
[0027] 在实施例1的基础上，材料选择：选用材料为红花大金元、云烟87与烟草野生种簇叶烟草(Nicotiana umbratica)，烟草野生种簇叶烟草中戊酸含量指3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，红花大金元与云烟87以T表示，烟草野生种簇叶烟草(Nicotiana umbratica)以U表示，上述材料均由云南省烟草农业科学研究院提供；选择红花大金元、云烟87与高戊酸含量的烟草野生种簇叶烟草(Nicotiana umbratica)，便于进行应用组培技术克服远缘杂交II型致死，且戊酸含量的烟草野生种簇叶烟草也能提供产品的戊酸含量。
[0028] 实施例3：
[0029] 在实施例1‑2的基础上，远缘杂交：在现蕾初期，开展以T为母本且U为父本的正向杂交，同时做以U为母本且T为父本的反向杂交，正向及反向的杂交组合做3次重复，每个重复杂交15个花蕾，杂交后10d统计坐果率，杂交后10天以所结蒴果数与总的杂交数的比值统计坐果率；获得的杂交种即为F1远缘杂交种，在催芽播种后第5d统计发芽率，分3次重复，每重复播种200粒，第25d统计存活率，存活率为存活的幼苗数与出苗数的比值；便于进行以T为母本，U为父本的正向杂交，同时做以U为母本，T为父本的反向杂交时，坐果率及发芽率的统计，如附图1所示，由图1看出，以簇叶烟草为母本，其坐果率可达到75.8％，如作为父本，则蒴果脱落，坐果率为0。这与前人研究中，远缘杂交中，染色体数多的做母本，易于杂交成功不同，或许是由于不同的亲本，其对远缘杂交生殖隔离强弱有差异所致。由于致死因子的存在，其杂交种发芽率虽为91.3％，但幼苗存活率极低，仅为0.67％。
[0030] 实施例4：
[0031] 在实施例1‑3的基础上，远缘杂交致死因子克服：配制MS培养基，无菌条件下播种F1远缘杂交种，将其中一半的无菌苗放置于35℃环境下培养，另一半放置于25℃组培培养室内，无菌苗生长28d后，分别取两种环境下的叶片作外植体，进行丛生芽诱导培养，25℃及35℃环境下的叶片外植体各接种48个外植体，在25℃组培培养室进行离体扩繁，培养基为MS+KT3.0 mg/l+NAA 0.5mg/l+0.7％琼脂粉+2％蔗糖，组培芽诱导在室温为25℃，14h光照环境下进行，分别诱导培养30d后，调查外植体是否有绿色芽点冒出，每个外植体绿色芽点数占总外植体数的比率即为芽点诱导率；之后，将绿色芽点挑出，无菌条件下培养30d观察丛生芽生长情况，之后继续继代培养，找出最少继代次数下，获得再生植株即为已克服远缘杂交致死因子的杂交种，并能够在常温下正常生长；利用组培方法，克服烟草远缘杂交II型致死因子。如附图2、表1所示。两次继代组培后，克服致死因子常温下存活杂交种中，A为无菌苗25℃下培养30d后杂交种致死，B为35℃杂交种生长正常，C为35℃下叶片第一次组培，外植体绿色芽点，D为第二次继代诱芽后，较大的丛生芽形成，E为三次组培后，部分完整芽诱导成功。常温下生长的杂交种无菌苗，在培养一周后，下胚轴及根部陆续变褐。而35℃下的杂交种生长正常。取35℃下叶片为外植体，常温下离体扩繁培养30d后，个别外植体露出绿色芽点，其诱导率为10.42％，取含绿色芽点外植体，继续培养30d后,大的丛生芽诱导生成，取较大丛生芽，进行第二次的芽诱导,二次诱芽率提升到16.67％。无菌条件下，选择最大的二次诱导丛生芽进行离体扩繁及根的诱导，其最终成苗率为25％。
[0032] 实施例5：
[0033] 在实施例1‑4的基础上，杂交材料形态及SSR标记鉴别：对杂交亲本及杂交种开展了形态学、SSR分子标记检测；形态方面开展了叶形、花色等形态特征的比较，如附图3所示，和亲本相比，F1植株偏矮，花为粉色，叶片大小介于亲本之间，其中，附图3表示，A为红大花，B为加倍F1花，C为簇叶烟草花，D为红大叶片，E为加倍F1为叶片，F为未加倍杂交种叶片；并开展了SSR鉴别分析，PCR扩增体系为20μL，其中15‑30ng/μL DNA样品1.5uL、10×PCR 2+
Reaction Buffer(Mg plus)2μL、25mmol/L dNTPs 1.2μL、10μmol/L正反向引物各2μL、rTaq
0.75U，最后用ddH2O补足20μL。PCR程序：95℃变性5min，接着95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，之后72℃5min，4℃保存，筛选出最适引物进行分子鉴别，如附图4，其中附图4表示的M 100bp标准分子量，1为红大，2为加倍F1，3为簇叶烟草。通过前期预试验，从已发表(Bindler G,Plieske J,Bakaher N,Gunduz I,Ivanov N,Van der Hoeven R,Ganal M,Donini P.A high density genetic map of tobacco(Nicotiana tabacum L.)obtained from large scale microsatellite marker development.Theor Appl Genet,
2011,123(2):219‑230；Tong Z J,Xiao B G,Jiao F C,Fang D H,Zeng J M,Wu X F,Chen X J,Yang J K,Li Y P.Large‑scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue‑cured tobacco.Breeding Science,2016,66:
381‑390)的烟草SSR引物中，筛选出10个引物，可以稳定区分双亲与其杂交种，图4为其中的一对引物(TM100F5’‑TGGAGGAACCAACAAGGAAG‑3’,TM100R5’‑GTCCGACAGTATCTTCGCAA‑3’)扩增结果，结果表明获得的杂交种含有双亲主要带型。
Reaction Buffer(Mg plus)2μL、25mmol/L dNTPs 1.2μL、10μmol/L正反向引物各2μL、rTaq
0.75U，最后用ddH2O补足20μL。PCR程序：95℃变性5min，接着95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，之后72℃5min，4℃保存，筛选出最适引物进行分子鉴别，如附图4，其中附图4表示的M 100bp标准分子量，1为红大，2为加倍F1，3为簇叶烟草。通过前期预试验，从已发表(Bindler G,Plieske J,Bakaher N,Gunduz I,Ivanov N,Van der Hoeven R,Ganal M,Donini P.A high density genetic map of tobacco(Nicotiana tabacum L.)obtained from large scale microsatellite marker development.Theor Appl Genet,
2011,123(2):219‑230；Tong Z J,Xiao B G,Jiao F C,Fang D H,Zeng J M,Wu X F,Chen X J,Yang J K,Li Y P.Large‑scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue‑cured tobacco.Breeding Science,2016,66:
381‑390)的烟草SSR引物中，筛选出10个引物，可以稳定区分双亲与其杂交种，图4为其中的一对引物(TM100F5’‑TGGAGGAACCAACAAGGAAG‑3’,TM100R5’‑GTCCGACAGTATCTTCGCAA‑3’)扩增结果，结果表明获得的杂交种含有双亲主要带型。
[0034] 实施例6：
[0035] 在实施例1‑5的基础上，活杂交种染色体加倍：以MS为基本培养基，取致死因子克服并开花的杂交种中部叶片中脉无菌处理后，接种在MS+KT 4.0mg/L+NAA 0.2mg/L的诱芽培养基中，待丛生芽长至3cm时，接种丛生芽到MS+IBA 0.8mg/L诱根培养基，如此继代培养2次后，以花粉萌发初步检测其杂交植株育性，花粉培养基为20ml的去离子水中，依次加入2g蔗糖、0.003g硼酸及0.4g琼脂，加热溶解后涂布于盖玻片，培养基凝固后将待测花粉抖在培养基表明，置于组培室3h后即可静检观察花粉管是否萌发；组培室培养温度为25℃，每日光照14h，培养架隔板中心光照度为3600lx，获得染色体加倍的杂交种，测定其3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，明确其为戊酸含量显著提高的种质。以该种质为父本，红大、云烟87烤烟品种为母本，获得回交1代材料，在回交1代材料烟叶旺长期取新鲜叶片，测定烟叶中3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，来确定进行后续回交的目标单株；取烤后的加倍杂交种叶片，测定的3‑甲基戊酸及4甲基戊酸含量分别为350.58μg/g和278.91μg/g，明显高于栽培品种红大和云烟87(表2)，获得了戊酸含量明显提高的种质。以该种质为父本，红大、云烟87烤烟品种为母本，获得回交1代材料，在回交1代材料烟叶旺长期取新鲜叶片，测定烟叶中3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，来确定进行后续回交的目标单株。如附图5中加倍后的花药正常萌发图，A为加倍前的花药未萌发图，B为加倍后花药花粉管正常萌发图，C为中脉加倍后植株图。
[0036] 实施例7：
[0037] 在实施例1‑6的基础上，回交2代材料田间比较试验：分别以红大及云烟87为母本，回交1代材料为父本，获得回交2代材料，该回交材料进行田间种植，取旺长期新鲜烟样与烤后烟叶，测定比较两种类型烟样的3‑甲基戊酸与4‑甲基戊酸含量。烟叶旺长及烘烤后，比较回交材料的3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸的含量变化。结果表明，如表2所示，旺长期回交材料的3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量分别为157.55μg/g及49.11μg/g，主栽品种红大及云烟87未检出上述甲基戊酸；烘烤后烟叶的3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量分别为116.11μg/g及24.80μg/g，而同田试验的红大及云烟87的3‑甲基戊酸含量仅为3.72μg/g及2.71μg/g，这两品种的4‑甲基戊酸未检出。
[0038] 实施例8：
[0039] 在实施例1‑7的基础上，3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量分析：取1克的待测样品，放置于100ml的平底烧瓶中，加入40ml的5％硫酸+甲醇及200μl己二酸内标溶液，烧瓶接冷凝管，在60℃中回流2h，冷却至室温，取回流液体10ml于100ml的粉液漏斗中，加入20ml蒸馏水混匀，每次用10ml二氯甲烷萃取，萃取3次，合并萃取液，加入3.5g无水硫酸钠过夜，取适量上层澄清萃取液进行气相色谱分析；本申请中需要检测的3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量，均采用此方法进行分析，便于进行戊酸中3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量分析。
[0040] 实施例9：
[0041] 在实施例1‑8的基础上，最适合引物为：TM100F5’‑TGGAGGAACCAACAAGGAAG‑3’,TM100R5’‑GTCCGACAGTATCTTCGCAA‑3’；杂交材料形态及SSR标记鉴别得到的最适合引物，杂交材料含有双亲主要条带，表现为共显性。
[0042] 表1不同环境下组培手段克服致死因子
[0043]
[0044] 注：“/”无法培养
[0045] 表2回交2代材料杀青样及烘烤样品3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量变化[0046]
[0047] 备注：同田种植的常规栽培品种红大及云烟87的3‑甲基戊酸含量分别为3.72μg/g及2.71g/g，4‑甲基戊酸未检出。
[0048] 戊酸含量提高的种质，其回交材料杀青样品与烘烤样品甲基戊酸测定结果表明，尽管烘烤后相对应的甲基戊酸含量会降低，但该性状仍能够遗传，且烤后烟叶的3‑甲基戊酸及4‑甲基戊酸含量含量显著高于对照。烘烤样品的3‑甲基戊酸平均含量为116.11μg/g，4‑甲基戊酸的为24.80μg/g。
[0049] 尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。