NKAP抑制剂联合顺铂在治疗癌症中的应用

摘要

本发明属于生物医学领域，具体涉及NKAP抑制剂联合顺铂在治疗癌症中的应用。具体地，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包含NKAP抑制剂和化疗剂。优选地，所述抑制剂是siRNA干扰方法所使用的试剂，所述化疗剂是顺铂。

权利要求

1.NKAP抑制剂和顺铂联合在制备治疗癌症的产品中的应用，所述抑制剂是HSS128451或HSS188063，所述HSS128451的目标序列为5’‑GAAGAGTCC GAAGCCCAGCAAATCT‑3’，所述HSS188063的目标序列为5’‑GACAAGTGAAGAAATTGCATCATTT‑3’。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症包括宫颈癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗包括使癌细胞凋亡增强。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述癌细胞是HeLa细胞系。

5.一种在体外杀伤癌细胞的方法，其特征在于，对癌细胞施用NKAP抑制剂和顺铂，所述抑制剂是HSS128451或HSS188063，所述HSS128451的目标序列为5’‑GAAGAGTCC GAAGCCCAGCAAATCT‑3’，所述HSS188063的目标序列为5’‑GACAAGTGAAGAAATTGCATCATTT‑3’。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是siRNA干扰方法所使用的试剂，所述方法包括将siRNA导入细胞的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述导入细胞使用的是脂质体递送的方法。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述顺铂在施用NKAP抑制剂之后施用。

说明书

NKAP抑制剂联合顺铂在治疗癌症中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及NKAP抑制剂联合顺铂在治疗癌症中的应用。

背景技术

[0002] 顺铂，又名顺式‑二氯二氨合铂，是一种含铂的抗癌药物，呈橙黄色或黄色结晶性粉末，微溶于水、易溶于二甲基甲酰胺，在水溶液中可逐渐转化成反式和水解。顺铂可与DNA
链交叉连接，显示出细胞毒作用。由于细胞内氯离子浓度低（4mmol/L），氯离子为水所取代，
电荷呈阳性，具有类似烷化剂双功能基团的作用，可与细胞核内DNA的碱基结合，形成三种
形式的交联，造成DNA损伤，破坏DNA复制和转录，高浓度时也抑制RNA及蛋白质的合成。顺铂
具有抗癌谱广、乏氧细胞有效、作用性强等优点，已普遍用于治疗睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、
膀胱癌、颈部癌、前列腺癌、脑癌等，疗效显著。但顺铂用于治疗癌有一定的毒性，会引起副
作用，因此需要不断寻找毒性较小而临床效果与顺铂相近的类似物。

[0003] 化疗是肿瘤治疗的重要方式。为提高肿瘤的治疗效果，临床上多采用两种或两种以上药物联合的化疗方案。然而联合用药在提高疗效的同时可能会因为药物之间的相互作
用或者抗癌药物作用的周期特异性对化疗的疗效和毒性产生影响，所以正确的给药顺序不
仅可以增加抗肿瘤疗效，还可以减少毒副作用。

[0004] 从药学角度出发，化疗方案的给药顺序应遵循以下三原则：相互作用原则、细胞动力学原则、刺激性原则。

发明内容

[0005] 如以下所使用的，术语“具有”，“包含”或“包括”或其任何语法变体以非排他性的方式使用。因此，这些术语都可以指除了由这些术语引入的特征之外在本上下文中描述的
实体中不存在其他特征的情况，并且可以指除了存在一个或多个其他特征的情况。

[0006] 此外，如下文中所使用的，术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与任选特征结合使用，而不限制其他可能性。

[0007] 术语“治疗”是指在显著程度上改善本文提及的疾病或病症或伴随其的症状。

[0008] 为提供治疗癌症的新方案，本发明提供了NKAP抑制剂和化疗剂联合在制备癌症药物中的应用，所述化疗剂是顺铂。本发明中NKAP抑制剂与顺铂同时使用时，二者可产生协同
的效果，更高效的杀伤癌细胞，达到治疗癌症的目的。

[0009] 一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包含NKAP抑制剂和化疗剂。

[0010] 优选地，所述抑制剂包括siRNA干扰、CRISPR/cas9方法、同源重组、基因敲除、基因置换、化学药物方法所使用的试剂。

[0011] 优选地，本发明所使用的抑制剂是siRNA，也就是靶向NKAP的siRNA，更具体地，本发明所使用的靶向NKAP的siRNA是Invitrogen的货号为HSS128451、HSS188063的产品。

[0012] 术语“化疗剂”包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、抗肿瘤的植物类药物和杂类。

[0013] 优选地，所述杂类包括但不限于顺铂、卡铂、草酸铂、奈达铂、奥沙利铂、门冬酰胺酶。

[0014] 优选地，所述化疗剂是顺铂。

[0015] 优选地，所述药物组合物是药学上相容的组合制剂。

[0016] 如本文所用术语“药物组合物”包含本发明所述的NKAP抑制剂和顺铂，同时还包含任选一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。

[0017] 应该理解的是，所述药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量、施用途径和其他众所周知的变量。

[0018] 优选地，所述所用的药物载体可以是例如固体、凝胶或液体。

[0019] 示例性的，所述固体载体的实例是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸、可降解聚合物例如PLGA等。

[0020] 示例性的，所述液体载体是磷酸盐缓冲盐溶液、糖浆、诸如花生油和橄榄油的油、水、乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。

[0021] 优选地，所述稀释剂的选择要以不影响NKAP抑制剂和/或顺铂的生物活性为标准。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液（Ringer’s solutions）、葡萄糖溶液和
汉克氏溶液（Hank’s solution）。

[0022] 优选地，所述药物组合物还可以包含其他无毒的、非治疗性的非免疫原性的稳定剂、活性氧清除剂等。

[0023] 本发明所述药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。所述药物组合
物可以是任何剂型，并以任何方式施用。所述剂型包括按常规方法制成片剂、胶囊剂、颗粒
剂、口服液、混悬剂、注射剂、微球或脂质体等。所述使用方式包括口服或肠胃外方式而给
予，其中所述肠胃外方式为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。

[0024] 在本发明的另一方面，还提供了NKAP抑制剂和化疗剂、前述药物组合物在制备治疗癌症的产品中的应用。

[0025] 优选地，所述癌症包括以下任意一种：急性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，肾上腺皮质癌，艾滋病相关淋巴瘤，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，非典型畸胎瘤，基底细胞癌，
胆管癌，膀胱癌，脑干性胶质瘤，乳腺癌，伯基特淋巴瘤（burkitt lymphoma），类癌瘤，小脑
星形细胞瘤，宫颈癌，脊索瘤，慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病，结肠癌，结直肠癌，
颅咽管瘤，子宫内膜癌，室管膜母细胞瘤，室管膜瘤，食管癌，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖
细胞瘤，肝外胆管癌，胆囊癌，胃癌，胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，毛细胞白血病，头颈
癌，肝细胞癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，下丘脑和视觉通路胶质瘤，眼内黑色素瘤，卡波西肉
瘤（kaposi sarcoma），喉癌，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，黑色素瘤，梅克尔细胞癌
（merkelcell carcinoma），间皮瘤，口腔癌，多发性内分泌肿瘤综合征，多发性骨髓瘤，蕈样
真菌病，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌，口腔癌，口
咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞瘤，卵巢低恶性潜在肿瘤，乳头状瘤病，鼻
窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，鼻咽癌，嗜铬细胞瘤，垂体瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中
枢神经系统淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，肾细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，
皮肤癌，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，鳞状颈癌，睾丸癌，咽喉癌，胸腺癌，
胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，华氏巨球蛋白血症
（macroglobulinemia）和威尔姆氏瘤（wilms tumor）。

[0026] 优选地，所述癌症是宫颈癌，更优选地，是HeLa（HELA）细胞系。

[0027] 最后，本发明还提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括使用NKAP抑制剂和前述化疗剂、或者使用前述药物组合物。

[0028] 优选地，所述癌症是宫颈癌，例如本发明具体实施例中所使用的HELA细胞系。

[0029] 优选地，所述治疗还可以与放射治疗、手术治疗等其他治疗方式连用。

[0030] 优选地，NKAP抑制剂和前述化疗剂用于分开给药或组合给药。

[0031] 如本文所用，“分开给药”也可以称为“分开施用”，具体是指：NKAP抑制剂和前述化疗剂经由不同途径在受试者身体的不同部位施用的给药方式。例如，NKAP抑制剂通过肠内
施用（例如口服）而施用，而前述化疗剂通过肠胃外施用（例如静脉注射）而施用。

[0032] 优选地，分开施用的前述药物组合物包含至少两种物理分离的制剂，其中每种制剂含有至少一种药学活性化合物。

[0033] 相反，本文所用“组合施用”涉及本发明的药学活性化合物经由相同途径施用，例如，同时口服、同时静脉注射等。

[0034] 另外，优选地，前述药物组合物用于同时或顺序施用。

[0035] 如本文所用，“同时施用”可以是NKAP抑制剂和前述化疗剂同时施用，优选地，在少于15分钟的时间间隔内施用NKAP抑制剂和前述化疗剂，更优选地，在小于5分钟的时间间隔
内施用。

[0036] “顺序施用”可以是NKAP抑制剂在前述化疗剂之前或之后施用，优选地，间隔至少1天、2天、3天、7天、30天、或更长的时间施用NKAP抑制剂和前述化疗剂。

[0037] 如本发明具体实施例所使用的，所述NKAP抑制剂在化疗剂之前使用。NKAP抑制剂可以进一步提高化疗剂的治疗效果。

[0038] 在本发明的另一方面，还提供了一种在体外杀伤癌细胞的方法，其特征在于，对癌细胞施用NKAP抑制剂和化疗剂。

[0039] 优选地，所述化疗剂是顺铂。

[0040] 优选地，所述抑制剂包括siRNA干扰、CRISPR/cas9方法、同源重组、基因敲除、基因置换、化学药物方法所使用的试剂。

[0041] 优选地，本发明所使用的抑制剂是siRNA，也就是靶向NKAP的siRNA，更具体地，本发明所使用的靶向NKAP的siRNA是Invitrogen的货号为HSS128451、HSS188063的产品。

[0042] 优选地，所述方法包括将siRNA导入细胞的步骤。

[0043] 优选地，所述导入细胞可以考虑本领域中任何已知的方法向细胞内递送遗传物质。非限制性的实例包括病毒转导，电穿孔转染，脂质体递送（脂质体转染），聚合物载体，化
学载体，脂质复合物，聚合复合物，树枝状聚合物，纳米粒子，乳剂，天然内吞或吞噬途径，细
胞穿透肽，显微注射法，微针递送法，粒子轰击法等。使用的是脂质体转染的方法。

[0044] 优选地，所述导入细胞使用的是脂质体递送的方法。更具体的如本发明具体实施例所使用的转染方法。

附图说明

[0045] 图1为干涉NKAP基因后蛋白检测和细胞检测的结果图，A是蛋白检测，B是细胞检测。

[0046] 图2为NKAP联合不同化疗药物对细胞的治疗作用，A是联合顺铂，B是联合紫杉醇。

具体实施方式

[0047] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示
的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明
的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

[0048] 本发明所使用的仪器和试剂如下表1所示：

[0049] 表1.本发明所使用的仪器或试剂

[0050]

[0051] 注：对照siRNA是靶向Photinus pyralis luciferase gene，目标序列5’‑GGAUUUCGAGUCGUCUUAAUGUAUA‑3’；

[0052] NKAP siRNA #1目标序列5’‑GAAGAGTCC GAAGCCCAGCAAATCT‑3’；

[0053] NKAP siRNA #2目标序列5’‑GACAAGTGAAGAAATTGCATCATTT‑3’。

[0054] 实施例1、肿瘤细胞中干涉NKAP基因后，促进肿瘤细胞DNA损伤及凋亡

[0055] 实验过程：

[0056] 1、转染前一天接种宫颈癌肿瘤细胞（HeLa细胞）于24孔板中，每孔接种2.5X105细胞于500μl DMEM培养基（10%胎牛血清）中。转染前将细胞换液至0.4ml完全培养基。

[0057] 2、siRNA‑NKAP脂质体转染细胞：（1）每个孔对应Control及NKAP siRNA加入50μl Opti‑MEM培养基中，终浓度为100uM；每个孔对应2μl Lipofectamine RNAiMAX加入50μl 
Opti‑MEM中，轻轻混匀，室温孵育5min。

[0058] 3、而后将siRNA稀释液与Lipofectamine RNAiMAX稀释液混合（总体积100μl），轻轻混匀。室温孵育20min。20min后将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内有0.5ml培养的细
胞，轻轻晃动培养液混匀。细胞放回37度培养箱继续培养。

[0059] 4、转染72小时后，将细胞收集一半用于western blot检测，一半用于流式细胞仪检测。

[0060] 5、Western blot检测：用RIPA（50mM Tris‑HCl（pH7.4），150mM NaCl，1% NP‑40，0.1% SDS）裂解液裂解每组细胞。加入电泳上样缓冲液后进行SDS‑PAGE电泳，而后进行蛋白
质转印到PVDF膜。室温1h 5%BSA封闭后，加入一抗4度孵育过夜，TBST洗3次后，加入二抗室
温孵育1个小时。TBST洗3次后，进行ECL显色。

[0061] 6、流式细胞术检测细胞凋亡：首先利用胰酶将细胞消化至1.5ml EP管，1000g，5min离心收集细胞；PBS重悬清洗细胞一次；细胞计数约5‑10万个细胞每组加入195μl 
Annexin V‑FITC结合液轻轻重悬细胞；再加入5μl Annexin V‑FITC，10μl碘化丙啶（PI）轻
轻混匀，室温避光孵育10‑20分钟，随后置于冰浴中。立即流式细胞仪进行样品检测并分析。

[0062] 实验结果

[0063] 如图1所示，Western Blot检测发现NKAP干涉后不但造成DNA损伤加剧，同时细胞凋亡也随之增加。流式细胞仪利用细胞凋亡marker‑Annexin V染色证明NKAP干涉后造成肿
瘤细胞凋亡显著增加。

[0064] 实施例2、抑制NKAP表达可加强顺铂对HeLa肿瘤细胞的凋亡效应，而不增强其他化疗药物对HeLa肿瘤细胞的凋亡效应

[0065] 实验步骤

[0066] #1 NKAP siRNA的敲低效果最高，进而使用#1 NKAP siRNA进行下一步验证：按实施例1所述转染方法siRNA，转染48小时后，将细胞不同孔加入不同浓度（0，2，4，8，10μM）的
顺铂处理4小时，而后将顺铂洗去，更换完全培养基继续培养箱中培养24个小时。同时按实
施例1所述转染方法siRNA，转染24小时后，将细胞不同孔加入不同浓度（0.1，1，10，100，
800nM）的紫杉醇处理48小时。

[0067] 随后进行MTT实验：首先吸去每孔中的培养基，加入100μl含有 1mg/ml MTT RIPA裂解液，37度孵育60min。而后将上清吸去加入100μl DMSO溶解染料。两组之间统计学分析
采用student’s t test；*P<0.05。

[0068] 利用酶标仪利用590nm波长对吸光值进行检测，并制作细胞活力曲线。

[0069] 实验结果

[0070] 如图2所示，结果表明#1 NKAP siRNA干涉NKAP后可以增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用。而#1 NKAP siRNA干涉NKAP后，对于紫杉醇对肿瘤细胞的杀伤作用并没有明显的改
变。

[0071] 因此，提示NKAP抑制剂可特异性增强顺铂的疗效，尤其是在妇科肿瘤（尤其是宫颈癌肿瘤细胞）的治疗中。