一种聚丙烯酰胺色谱固定相及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种聚丙烯酰胺色谱固定相及其制备方法和应用，涉及液相色谱固定相技术领域，聚丙烯酰胺色谱固定相的结构式为：其中Silica Gel为硅胶，n＝1～10，x＝1～10，y＝1～20；制备方法包括，通过硅烷化反应在水体系下将聚丙烯酰胺修饰到硅胶表面，制备得到聚丙烯酰胺色谱固定相。本发明的有益效果聚丙烯酰胺固定相亲水性良好，可广泛用于各类极性化合物的分离分析，本发明首先合成分子量可控的聚丙烯酰胺硅烷，然后在水体系下通过硅烷化反应，将聚丙烯酰胺修饰到硅胶表面合成分子量可控的聚丙烯酰胺硅烷，制备方法简单新颖。

权利要求

1.一种聚丙烯酰胺色谱固定相，其特征在于，其结构式如下：

其中，Silica Gel为硅胶，n＝1～10，x＝1～10，y＝1～20；

其制备方法还包括以下步骤：

a、硅胶预处理：硅胶加入浓度为1～40wt％的强酸溶液中，加热回流搅拌1～48小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中100～160℃条件下干燥8～24小时，得酸化后硅胶；

b、聚丙烯酰胺硅烷合成：在氮气或氩气保护下，在有机溶剂中加入丙烯酰胺、硅烷偶联剂、自由基引发剂，在40～100℃下反应8～48小时，过滤，用有机溶剂进行洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下真空干燥8～24小时，得到聚丙烯酰胺硅烷；

c、硅烷化反应：使用乙酸钠和冰醋酸配置成pH＝4的水溶液，在氮气或氩气保护下，在水溶液中加入聚丙烯酰胺硅烷和酸化后硅胶，在40～130℃下反应8～24小时，过滤，依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下干燥8～24小时，得到聚丙烯酰胺色谱固定相。

2.一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、硅胶预处理：硅胶加入浓度为1～40wt％的强酸溶液中，加热回流搅拌1～48小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中100～160℃条件下干燥8～24小时，得酸化后硅胶；

b、聚丙烯酰胺硅烷合成：在氮气或氩气保护下，在有机溶剂中加入丙烯酰胺、硅烷偶联剂、自由基引发剂，在40～100℃下反应8～48小时，过滤，用有机溶剂进行洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下真空干燥8～24小时，得到聚丙烯酰胺硅烷；

c、硅烷化反应：使用乙酸钠和冰醋酸配置成pH＝4的水溶液，在氮气或氩气保护下，在水溶液中加入聚丙烯酰胺硅烷和酸化后硅胶，在40～130℃下反应8～24小时，过滤，依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下干燥8～24小时，得到聚丙烯酰胺色谱固定相。

3.根据权利要求2所述的一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤a所用的强酸溶液为盐酸、硝酸、硫酸中的一种；以每克硅胶计，强酸溶液的用量为3～20mL。

4.根据权利要求2所述的一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤b所用的硅烷偶联剂有如下结构：其中，X为氯、甲氧基和乙氧基中的一种，n＝1～10；

以每克硅胶计，硅烷偶联剂的用量为1～10mmol。

5.根据权利要求2所述的一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤b所用的有机溶剂为乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯、二甲苯、异辛烷、N,N‑二甲基甲酰胺中的一种；以每克硅胶计，有机溶剂的用量为4～15mL。

6.根据权利要求2所述的一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤b所用的自由基引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、偶氮二氰基戊酸、偶氮二异丙基咪唑啉中的一种；以每克硅胶计，自由基引发剂的用量为1～10mmol。

7.根据权利要求2所述的一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤b中，以每克硅胶计，丙烯酰胺的用量为每克硅胶1～100mmol。

8.根据权利要求2所述的一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤c所用的pH＝4的水溶液的用量为5～15mL。

9.根据权利要求2所述的一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，其特征在于，步骤c所用的聚丙烯酰胺硅烷的用量为每克硅胶0.1～20mmol。

10.根据权利要求1所述聚丙烯酰胺色谱固定相在分离极性化合物以及不同聚合度壳寡糖中的应用。

说明书

一种聚丙烯酰胺色谱固定相及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及液相色谱固定相技术领域，具体地说是一种键合相中含有不同聚合度的聚丙烯酰胺链的色谱固定相及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 亲水作用液相色谱模式(HILIC)是近年来发展起来的用于分离强极性化合物的新型色谱分离技术，最早是由Alpert于1990年提出的。与正相色谱(NPLC)作用原理相似，HILIC的流动相是水相缓冲液(<40％)及有机溶剂，固定相是强亲水性的极性固定相，如硅胶键合相、极性聚合物填料或离子交换吸附剂，这些固定相的共同特点是它们和水的作用力很强，属于“亲水性”材料。HILIC可使用含水量大的溶液体系作为流动相，能够解决正相色谱的流动相对水溶性物质溶解性差、保留时间对流动相水含量十分敏感及与质谱检测器兼容等问题。同时，HILIC与反相色谱(RPLC)的分离选择性差异大，而流动相体系却相似，可以作为RPLC的有效补充，与RPLC组合构建二维液相色谱系统，用于复杂样品的分离。传统的氨基、氰基硅胶等正相色谱固定相虽然可直接用于亲水作用色谱，但存在着重现性差和使用寿命短的问题。发展新型色谱固定相是亲水作用色谱研究和应用的重要方面。俥[0003] 近年来专门用于亲水作用色谱的新型极性固定相得到了较大发展，包括酰胺类、羟基类、两性离子类等。酰胺类固定相由于其良好的亲水性，因此在亲水作用色谱中得到广泛应用。以商品化的TSKgel Amide‑80柱为代表酰胺柱，在亲水作用色谱中发挥着重要的作用。目前，对于聚丙烯酰胺固定相多以原子转移自由基聚合或可逆加成‑断裂链转移聚合的方法进行制备，即在修饰后的硅胶表面上进行丙烯酰胺的聚合反应，但是这类方法存在丙烯酰胺自聚的影响，会存在聚合物与硅胶间的黏连现象，导致填料洗料困难，因此需要发展更加简单而合适的方法将聚丙烯酰胺修饰在硅胶表面，来作为亲水色谱固定相的使用。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种新型聚丙烯酰胺色谱固定相及其制备方法。该键合相含有不同聚合度的聚丙烯酰胺链，其制备方法简单，适用性广泛。

[0005] 本发明的技术解决方案如下：

[0006] 本发明第一方面提供了一种聚丙烯酰胺色谱固定相，其结构式如下：

[0007]

[0008] 其中，Silica Gel为硅胶，n＝1～10，x＝1～10，y＝1～20。

[0009] 本发明第二方面一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，包括以下步骤：

[0010] a、硅胶预处理：硅胶加入浓度为1～40wt％的强酸溶液中，加热回流搅拌1～48小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中100～160℃条件下干燥8～24小时，得酸化后硅胶；

[0011] b、聚丙烯酰胺硅烷合成：在氮气或氩气保护下，在有机溶剂中加入丙烯酰胺、硅烷偶联剂、自由基引发剂，在40～100℃下反应8～48小时，过滤，用有机溶剂进行洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下真空干燥8～24小时，得到聚丙烯酰胺硅烷；

[0012] c、硅烷化反应：使用乙酸钠和冰醋酸配置成pH＝4的水溶液，在氮气或氩气保护下，在水溶液中加入聚丙烯酰胺硅烷和酸化后硅胶，在40～130℃下反应8～24小时，过滤，依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下干燥8～24小时，得到聚丙烯酰胺色谱固定相。

[0013] 本发明的一种具体实施方式，步骤a所用的强酸溶液为盐酸、硝酸、硫酸中的一种；以每克硅胶计，强酸溶液的用量为3～20mL。

[0014] 本发明的一种具体实施方式，步骤b所用的硅烷偶联剂有如下结构：

[0015]

[0016] 其中，X为氯、甲氧基和乙氧基中的一种，n＝1～10；

[0017] 以每克硅胶计，硅烷偶联剂的用量为1～10mmol。

[0018] 本发明的一种具体实施方式，步骤b所用的有机溶剂乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯、二甲苯、异辛烷、N,N‑二甲基甲酰胺中的一种；以每克硅胶计，有机溶剂的用量为4～15mL。

[0019] 本发明的一种具体实施方式，步骤b所用的自由基引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、偶氮二氰基戊酸、偶氮二异丙基咪唑啉中的一种；以每克硅胶计，自由基引发剂的用量为1～10mmol。

[0020] 本发明的一种具体实施方式，步骤b中，以每克硅胶计，丙烯酰胺的用量为每克硅胶1～100mmol。

[0021] 本发明的一种具体实施方式，步骤c所用的pH＝4的水溶液的用量为5～15mL。

[0022] 本发明的一种具体实施方式，步骤c所用的聚丙烯酰胺硅烷的用量为每克硅胶0.1～20mmol。

[0023] 本发明第三方面还提供了所述聚丙烯酰胺色谱固定相在分离极性化合物以及不同聚合度壳寡糖中的应用。

[0024] 本发明至少具有以下有益效果之一：

[0025] 1、本发明提供的聚丙烯酰胺固定相的键合相中含有不同聚合度的聚丙烯酰胺链，亲水性良好，柱效和分离选择性高，可广泛用于各类极性化合物的分离分析。

[0026] 2、本发明的制备方法简单新颖，本发明首先合成分子量可控的聚丙烯酰胺硅烷，然后在水体系下通过硅烷化反应，将聚丙烯酰胺修饰到硅胶表面，从而得到一种结构新颖的聚丙烯酰胺固定相，

[0027] 3.本发明提供的液相色谱固定相制备过程简单可靠，填料洗料过程无黏连现象，有利于实现产业化。

附图说明

[0028] 图1为实施例1得到的色谱固定相用于极性化合物分离的色谱图；

[0029] 图2为实施例1得到的色谱固定相用于不同聚合度的壳寡糖分离的色谱图。

具体实施方式

[0030] 本发明提供了一种聚丙烯酰胺色谱固定相的制备方法，包括以下步骤：

[0031] a.硅胶预处理：硅胶加入浓度为1～40wt％的强酸溶液中，加热回流搅拌1～48小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中100～160℃条件下干燥8～24小时，得酸化后硅胶；

[0032] 以每克硅胶计，强酸溶液的用量3～20mL；

[0033] 强酸为盐酸、硝酸、硫酸中的一种。

[0034] b.聚丙烯酰胺硅烷合成：在氮气或氩气保护下，在有机溶剂中加入丙烯酰胺、硅烷偶联剂、自由基引发剂，在40～100℃下反应8～48小时，过滤，用有机溶剂进行洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下真空干燥8～24小时，得到聚丙烯酰胺硅烷；

[0035] 以每克硅胶计，丙烯酰胺的用量1～100mmol，硅烷偶联剂的用量为1～10mmol，自由基引发剂的用量为1～10mmol，有机溶剂的用量为4～15mL。

[0036] 硅烷偶联剂有如下结构：

[0037]

[0038] 其中，X为氯、甲氧基或乙氧基中的一种，n＝1～10。

[0039] 有机溶剂为乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯、二甲苯、异辛烷、N,N‑二甲基甲酰胺中的一种。

[0040] 自由基引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁基脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、偶氮二氰基戊酸、偶氮二异丙基咪唑啉中的一种。

[0041] c.硅烷化反应：使用乙酸钠和冰醋酸配置成pH＝4的水溶液，在氮气或氩气保护下，在水溶液中加入聚丙烯酰胺硅烷和酸化后硅胶，在40～130℃下反应8～24小时，过滤，依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤，所得固体于干燥箱中40～80℃条件下干燥8～24小时，得到色谱固定相。

[0042] 以每克硅胶计，聚丙烯酰胺硅烷的用量为每克硅胶0.1～20mmol，pH＝4的水溶液的用量为5～15mL。

[0043] 下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

[0044] 实施例1

[0045] 向250mL烧瓶中加入10g硅胶，加入100mL浓度为20wt％的盐酸溶液中，加热回流搅拌2小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中160℃条件下干燥24小时，得酸化后硅胶；

[0046] 在氮气保护下，向250mL烧瓶中加入10.43g丙烯酰胺、1.84g 3‑(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯、0.38g AIBA和100mL乙醇，在80℃下反应24小时，应结束后将得到的白色固体产物进行抽滤，用100mL乙醇进行洗涤，所得固体于干燥箱中40℃真空干燥24h，得到聚丙烯酰胺硅烷1；

[0047] 称取0.66g乙酸钠置于烧杯中，加入80mL/g水进行溶解，再加入1.6mL冰醋酸至水溶液pH＝4；在氮气保护下，向250mL烧瓶中加入2g聚丙烯酰胺硅烷1，再加入配好的水溶液，聚丙烯酰胺硅烷1全部溶解后投入10g酸化后硅胶，90℃反应2h。反应结束后进行抽滤，然后依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤抽干，所得固体于干燥箱中60℃干燥24h，得到色谱固定相1，结构如下：

[0048]

[0049] 实施例2

[0050] 向250mL烧瓶中加入10g硅胶，加入100mL浓度为40wt％的盐酸溶液中，加热回流搅拌2小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中160℃条件下干燥24小时，得酸化后硅胶；

[0051] 在氮气保护下，向250mL烧瓶中加入20.86g丙烯酰胺、1.84g 3‑(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸戊酯、0.38g AIBA和100mL乙醇，在80℃下反应24小时，应结束后将得到的白色固体产物进行抽滤，用100mL乙醇进行洗涤，所得固体于干燥箱中40℃真空干燥24h，得到聚丙烯酰胺硅烷2；

[0052] 称取0.66g乙酸钠置于烧杯中，加入80mL/g水进行溶解，再加入1.6mL冰醋酸至水溶液pH＝4；在氮气保护下，向250mL烧瓶中加入4g聚丙烯酰胺硅烷2，再加入配好的水溶液，聚丙烯酰胺硅烷2全部溶解后投入10g酸化后硅胶，90℃反应4h。反应结束后进行抽滤，然后依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤抽干，所得固体于干燥箱中60℃干燥24h，得到色谱固定相2，结构如下：

[0053]

[0054] 实施例3

[0055] 向250mL烧瓶中加入10g硅胶，加入100mL浓度为20wt％的盐酸溶液中，加热回流搅拌2小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中160℃条件下干燥24小时，得酸化后硅胶；

[0056] 在氮气保护下，向500mL烧瓶中加入50.13g丙烯酰胺、9.74g 3‑(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸癸酯、3.8g AIBA和400mL乙醇，在80℃下反应24小时，应结束后将得到的白色固体产物进行抽滤，用100mL乙醇进行洗涤，所得固体于干燥箱中40℃真空干燥24h,得到聚丙烯酰胺硅烷3；

[0057] 称取0.66g乙酸钠置于烧杯中，加入80mL/g水进行溶解，再加入1.6mL冰醋酸至水溶液pH＝4；在氮气保护下，向250mL烧瓶中加入2g聚丙烯酰胺硅烷3，再加入配好的水溶液，聚丙烯酰胺硅烷3全部溶解后投入10g酸化后硅胶，90℃反应2h。反应结束后进行抽滤，然后依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤抽干，所得固体于干燥箱中60℃干燥24h，得到色谱固定相3，结构如下：

[0058]

[0059] 实施例4

[0060] 向250mL烧瓶中加入10g硅胶，加入100mL浓度为20wt％的盐酸溶液中，加热回流搅拌2小时，过滤，用水洗涤至pH＝6～7，所得固体于干燥箱中160℃条件下干燥24小时，得酸化后硅胶；

[0061] 在氮气保护下，向500mL烧瓶中加入50.13g丙烯酰胺、15.68g 3‑(三甲氧基甲硅基)甲基癸烯酸癸酯、3.8g AIBA和400mL乙醇，在80℃下反应24小时，应结束后将得到的白色固体产物进行抽滤，用100mL乙醇进行洗涤，所得固体于干燥箱中40℃真空干燥24h，得到聚丙烯酰胺硅烷4；

[0062] 称取0.66g乙酸钠置于烧杯中，加入80mL/g水进行溶解，再加入1.6mL冰醋酸至水溶液pH＝4；在氮气保护下，向250mL烧瓶中加入2g聚丙烯酰胺硅烷4，再加入配好的水溶液，聚丙烯酰胺硅烷3全部溶解后投入10g酸化后硅胶，90℃反应2h。反应结束后进行抽滤，然后依次用水、甲醇、水、甲醇洗涤抽干，所得固体于干燥箱中60℃干燥24h，得到色谱固定相4，结构如下：

[0063]

[0064] 色谱固定相的应用和效果测试

[0065] 将实施例1～4得到的色谱固定相应用于分离极性化合物等物质，并测试分离效果，测试方法如下：

[0066] (一)实施例1得到的色谱固定相的分离效果

[0067] (1)使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×50mm色谱柱，用于极性化合物的分离分析，色谱条件为：

[0068] 色谱柱：4.6×50mm；

[0069] 溶剂：A：乙腈，D：100mM甲酸铵(pH＝3.2)；

[0070] 洗脱：A：D＝85:15；

[0071] 流速：1.0mL/min；

[0072] 柱温：30℃；

[0073] 检测：PDA(190nm～400nm)&UV(254nm)；

[0074] 进样：1.0μL。

[0075] 测试结果如图1所示，由图1可以看出，实施例1所得的色谱固定相1对尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、乳清酸的分离效果很好，由此说明，实施例1所得的色谱固定相1对极性化合物具有良好的选择性。

[0076] (2)使用实施例1所得色谱固定相1装填4.6×150mm色谱柱，用于壳寡糖的分离分析，色谱条件为：

[0077] 色谱柱：4.6×150mm；

[0078] 溶剂：A：A,20％ACN+10mM NH4FA(pH＝3.2)，B：80％ACN+10mM NH4FA(pH＝3.2)；

[0079] 洗脱：0～10min，20％A；10～30min，40％A；31～35min，100％A；

[0080] 流速：1.0mL/min；

[0081] 柱温：30℃；

[0082] 检测：CAD(190nm～400nm)；

[0083] 进样：10μL。

[0084] 测试结果见图2所示，由图2可以看出，实施例1所得的色谱固定相1对不同聚合度的壳寡糖具有良好的分离选择性。

[0085] (二)实施例2得到的色谱固定相的分离效果

[0086] (1)使用实施例2所得色谱固定相2装填4.6×50mm色谱柱，用于极性化合物的分离分析，测试结果见下表1，色谱条件为：

[0087] 色谱柱：4.6×50mm；

[0088] 溶剂：A：乙腈，D：100mM甲酸铵(pH＝3.2)；

[0089] 洗脱：A：D＝85:15；

[0090] 流速：1.0mL/min；

[0091] 柱温：30℃；

[0092] 检测：PDA(190nm～400nm)&UV(254nm)；

[0093] 进样：1.0μL。

[0094] 由表1可以看出，实施例2所得的色谱固定相2对尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、乳清酸的分离效果很好，由此说明，实施例2所得的色谱固定相2对极性化合物具有良好的选择性。

[0095] 表1

[0096]样品 保留时间 选择性
尿嘧啶 1.093 /
尿苷 1.527 1.73
胞嘧啶 2.153 1.61
乳清酸 2.628 1.29

[0097] (三)实施例3得到的色谱固定相的分离效果

[0098] (1)使用实施例3所得色谱固定相3装填4.6×50mm色谱柱，用于极性化合物的分离分析，测试结果见下表2，色谱条件为：

[0099] 色谱柱：4.6×50mm；

[0100] 溶剂：A：乙腈，D：100mM甲酸铵(pH＝3.2)；

[0101] 洗脱：A：D＝85:15；

[0102] 流速：1.0mL/min；

[0103] 柱温：30℃；

[0104] 检测：PDA(190nm～400nm)&UV(254nm)；

[0105] 进样：1.0μL。

[0106] 由表2可以看出，实施例3所得的色谱固定相3对尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、乳清酸的分离效果很好，由此说明，实施例3所得的色谱固定相3对极性化合物具有良好的选择性。

[0107] 表2

[0108]

[0109]

[0110] (四)实施例4得到的色谱固定相的分离效果

[0111] (1)使用实施例4所得色谱固定相4装填4.6×50mm色谱柱，用于极性化合物的分离分析，测试结果见下表3，色谱条件为：

[0112] 色谱柱：4.6×50mm；

[0113] 溶剂：A：乙腈，D：100mM甲酸铵(pH＝3.2)；

[0114] 洗脱：A：D＝85:15；

[0115] 流速：1.0mL/min；

[0116] 柱温：30℃；

[0117] 检测：PDA(190nm～400nm)&UV(254nm)；

[0118] 进样：1.0μL。

[0119] 由表3可以看出，实施例4所得的色谱固定相4对尿嘧啶、尿苷、胞嘧啶、乳清酸的分离效果很好，由此说明，实施例4所得的色谱固定相4对极性化合物具有良好的选择性。

[0120] 表3

[0121]样品 保留时间 选择性
尿嘧啶 1.240 /
尿苷 1.906 1.73
胞嘧啶 2.814 1.58
乳清酸 4.054 1.50

[0122] 以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。